專利名稱：在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達促性腺素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在盤基網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)中表達的促性腺素或其突變體，含有它們的藥物組合物，制備促性腺素的方法以及選擇具有超興奮劑或拮抗劑特性的促性腺素突變體的方法。
促性腺素形成結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖蛋白激素家族。典型的成員包括絨毛膜促性腺素(CG)，促濾泡激素(FSH)，促黃體素(LH)和促甲狀腺激素(TSH)。大多數(shù)脊椎動物中都存在FSH，LH和TSH，它們是由腦垂體合成和分泌的。迄今為止僅在包括人的靈長類動物和馬中發(fā)現(xiàn)由胎盤組織合成的CG。
這些激素是由普通α-亞單位和激素特異性的β-亞單位非共價結(jié)合形成的約30 KD的異二聚體蛋白質(zhì)。
在種內(nèi)，促性腺素家族每個成員的α-亞單位基本相同；在種間該α亞單位也是高度保守的。每個成員，即CG，F(xiàn)SH，TSH和LH的β-亞單位不同，但其結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)高的同源性。另外，種與種之間的β亞單位也是高度保守的。人α亞單位由92個氨基酸殘基組成，而每個成員的β亞單位大小不同hFSH為111個殘基，hLH為121個殘基，hTSH為118個殘基，hCG為145個殘基(Combarnous，Y.(1992)，EndocrineReviews，13，670-691，Lustbader，J.W.等(1993)，EndocrineReviews，14，291-311)。hCG的β亞單位比其它β亞單位都要大，因為前者的C-末端含有約34個額外的氨基酸，本文稱之為羧基末端肽(CTP)。該CTP攜有4個絲氨酸相連的寡糖。
促性腺素在包括代謝、溫度調(diào)節(jié)和繁殖過程的多種身體功能中起著重要作用。例如，垂體促性腺素FSH在刺激濾泡發(fā)育和成熟方面起著關(guān)鍵作用，而LH可誘導(dǎo)排卵(Sharp，R.M.(1990)，Clin Endocrinol.，33，787-807；Dorrington和Armstrong(1979)，Recent Prog.Horm.Res.，35，301-342)。最近，將FSH單獨或與LH聯(lián)合應(yīng)用于臨床以刺激卵巢，即超刺激卵巢以進行體外受精(IVF)并誘導(dǎo)不育的不排卵婦女體內(nèi)排卵(Insler，V.(1988)，Int.J.Fertility，33，85-97，Navot和Rosenwaks(1988)，J.Vitro Fert.Embryo Transfer，5，3-13)以及用于男性性腺機能減退。人絨毛膜促性腺素(hCG)參與受孕后早期妊娠的維持并具有重要的治療作用。
異二聚體的兩個亞單位呈現(xiàn)出很多保守的亞單位內(nèi)二硫鍵α-亞單位中有5個二硫鍵，β-亞單位中有6個二硫鍵。在促性腺素家族所有成員中，相應(yīng)的半胱氨酸殘基是完全保守的。最新得到的hCG X-射線結(jié)構(gòu)顯示出這些二硫鍵涉及被稱為二硫結(jié)的典型三維模式。
促性腺素具有3或4個可以是N-糖基化的天冬酰胺殘基，所述殘基對其構(gòu)象和生物活性具有重要影響。另外，hCG的C-末端肽(CTP)在4個絲氨酸的位置可以是O-糖基化的。糖基化CTP的主要作用似乎是延長hCG的循環(huán)半壽期。
糖蛋白激素的生物合成是十分復(fù)雜的過程。在過去的十年里，人們逐漸清楚地意識到促性腺素的折疊、裝配和分泌是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中存在的很多套伴侶分子和折疊酶輔助完成的。由于α-亞單位和β-亞單位都含有所謂的胱氨酸-結(jié)，預(yù)期蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶在促進折疊的過程中起著關(guān)鍵性的作用。另外，已證明hCG的適當(dāng)折疊、二硫鍵的形成和分泌需要N-聯(lián)寡糖側(cè)鏈(Feng，W.等(1995)，生物化學(xué)雜志，270，11851-11859)。兩個亞單位成功裝配成二聚體是二聚體生物活性所必需的。
異二聚體糖蛋白激素功能決定簇的闡明經(jīng)常被突變對亞單位裝配的不希望有的次要作用所阻礙。為了促進結(jié)構(gòu)/功能分析研究，產(chǎn)生了突變體，其中hCGβ-亞單位和共有的α-亞單位的編碼區(qū)經(jīng)由肽間隔區(qū)或亞單位間二硫鍵連接。已闡明hCG共價相連的α-和β-亞單位能折疊成具有生物活性的構(gòu)象。
已在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達了促性腺素，其重組衍生物具有與天然激素差不多的生物活性(Olijve，W.等(1996)，Mol.Hum.Reprod.2，371-382)。這表明這些宿主細胞含有裝配hCGα-和β-亞單位和進行所有的翻譯后修飾所必需的所有伴侶分子和折疊酶，所述修飾是完整的生物活性所必需的。另外，已證實CHO細胞和定點誘變的聯(lián)合使用是闡明糖蛋白激素中功能決定簇(Puett，D.等H.(1994)，糖蛋白激素(Lustbader，J.W.，Puett，D & Ruddon，R.W.編)，p59-82，Springer-Verlag，紐約)和設(shè)計這些激素潛在的新治療類似物的有利工具(Fares，F(xiàn).A.等(1992)，Proc Natl Acad SciUSA 89，4304-4308)。
不幸的是，使用如CHO細胞的哺乳動物細胞表達人促性腺素受到一些限制。因此，不可能產(chǎn)生研究所必需的涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域隨機誘變的大量轉(zhuǎn)化子。蛋白質(zhì)中選定結(jié)構(gòu)域的隨機誘變是鑒定受體結(jié)合和生物活性的結(jié)構(gòu)決定簇的有利工具。另外，使用CHO細胞是昂貴的和費力的。因此，需要在更易于生長的表達宿主中表達促性腺素。
得自低等生物的宿主細胞可能符合上述需求，但預(yù)期促性腺素的復(fù)雜折疊會妨礙這種復(fù)雜的重組蛋白的適當(dāng)表達和分泌。
目前，我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)盤基網(wǎng)柄菌屬能產(chǎn)生高度復(fù)雜的糖蛋白激素。
土壤變形蟲Dictyostelium discoideum是另一種能異源表達人糖蛋白激素的有吸引力的生物。它象糖酵母一樣易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化，同時又具有類似于哺乳動物細胞的一些復(fù)雜特征，如糖基化和趨化性。另外，最近的研究表明盤基網(wǎng)柄菌屬可為隨機誘變方法提供有用的系統(tǒng)。
然而，已發(fā)現(xiàn)盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與CHO細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相比，它們的糖基化是有區(qū)別的。已知糖基化對激素功能起著重要作用，而大多數(shù)糖基化是由盤基網(wǎng)柄菌屬進行的，半乳糖、N-乙酰半乳糖胺或唾液酸不與寡糖側(cè)鏈結(jié)合(Slade，M.等(1997)，Biotech.Genet.Eng.Rev，14，1-35)。盡管翻譯后的修飾與高等真核生物的不同，但盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的促性腺素也是有生物活性的。已發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)能與其受體結(jié)合并刺激表達人LH/CG受體的細胞產(chǎn)生cAMP。
所表達的糖蛋白的不均一性大大降低，產(chǎn)生更加均一的同工激素制品。因此，相對于更復(fù)雜的由CHO產(chǎn)生的促性腺素而言，由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的促性腺素的化學(xué)定義更完善。這對維持和分析證實批與批之間的一致性較為有利。由于糖基化是促性腺素的體內(nèi)半壽期的很重要的決定因素，在盤基網(wǎng)柄菌屬中產(chǎn)生促性腺素提供了產(chǎn)生具有較確定的體內(nèi)半壽期的未突變促性腺素的工具。另外，將盤基網(wǎng)柄菌屬中的表達與蛋白質(zhì)工程聯(lián)合便于產(chǎn)生幾個臨床應(yīng)用所用的特制促性腺素。
由于兩個亞單位復(fù)雜的分子間和分子內(nèi)折疊，大量二硫鍵，二硫結(jié)和翻譯后修飾的存在，很顯然盤基網(wǎng)柄菌屬可表達活性促性腺素，根據(jù)本發(fā)明可以制備適當(dāng)折疊的分子。在功能性促性腺素的折疊和成熟過程中，適當(dāng)二硫鍵的形成是至關(guān)重要的事件。β亞單位中的二硫鍵形成尤其重要所有二硫鍵都是有效連接和折疊所需的。對hCG折疊的詳細研究揭示出分子的折疊不是通過簡單的連續(xù)途徑進行，而是在分子的不同結(jié)構(gòu)域獨立地進行。因此，據(jù)認為低等生物的細胞不能分泌適當(dāng)折疊的促性腺素。
本發(fā)明提供了由盤基網(wǎng)柄菌屬表達的促性腺素。
使用已被深入研究的Dictyostelium discoideum是有利的。營養(yǎng)期的變形蟲在純性培養(yǎng)物中或革蘭氏陰性細菌上都能容易地和便宜地生長。另外，已描述了幾個能介導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達的轉(zhuǎn)化載體。
本發(fā)明的促性腺素可以是二聚體，即由兩個非共價結(jié)合的亞單位組成。優(yōu)選促性腺素是hCG或FSH。然而，促性腺素可含有本領(lǐng)域已知的修飾。
在本發(fā)明促性腺素的一個優(yōu)選的修飾中，一個亞單位氨基酸序列的C-末端任選通過接頭組成成分與另一個亞單位氨基酸序列的N-末端相連。優(yōu)選接頭組成成分是完整的或部分的CTP單位或其變體，或是重復(fù)的寡肽，如5次重復(fù)的Ser-Gly肽。
本發(fā)明促性腺素的另一個修飾是用完整的或部分的CTP單位或其變體延伸α和/或β亞單位各自的N-或C-末端。延伸可含有單一或多倍形式的各個CTP單位?；蛘?，可將完整的CTP單位或部分CTP單位或其多倍形式插入所述亞單位的N-或C-末端。另一個修飾是導(dǎo)入一個或多個非天然的二硫鍵。
另外，本發(fā)明的促性腺素可以是糖基化的或部分糖基化的。通過定點誘變可得到本發(fā)明的部分糖基化的促性腺素，所述定點誘變除去了促性腺素中的一個或多個糖基化識別位點?；蛘?，可通過導(dǎo)入其它的糖基化識別位點，和任選除去一個或多個糖基化識別位點來修飾本發(fā)明促性腺素的糖基化模式，導(dǎo)致所述促性腺素的被修飾的糖基化。本文所用的一個糖基化識別位點由氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr組成，其中X可以是任何氨基酸。
本文所用的CG，F(xiàn)SH，LH和TSH的α和β亞單位以及異二聚體形式的定義一般是其常規(guī)的定義，指的是本身具有本領(lǐng)域已知的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其等位基因變體，而不論其表現(xiàn)出的糖基化模式如何。
這些蛋白質(zhì)的“天然”形式是具有分離自相關(guān)脊椎動物組織的氨基酸序列且本身具有這些已知序列的蛋白質(zhì)，或其等位基因變體。
這些“變體”指的是相對于天然蛋白質(zhì)而言，其氨基酸序列具有故意的改變的蛋白質(zhì)。改變可包括單個或多個缺失，插入，取代及其組合，可通過例如位點特異性誘變產(chǎn)生這些改變。
本文所用的“CTP單位”指的是存在于hCGβ亞單位羧基末端，從C末端的氨基酸112-118延伸至殘基145的氨基酸序列，或其部分。根據(jù)CTP的N-末端，“完整的”CTP單位含有28-34個氨基酸。“部分”CTP單位是第112-118至145(包括端點值)位出現(xiàn)的氨基酸序列，但它從可能的最短的完整CTP單位(氨基酸118-145)中缺失了至少一個氨基酸?！岸鄠€”CTP單位被理解為包含完整CTP單位或部分CTP單位或兩者組合的串聯(lián)排列。
構(gòu)建本發(fā)明的促性腺素基因的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，最新版)。目前，有關(guān)定點誘變，連接另外的序列，PCR和構(gòu)建適當(dāng)表達系統(tǒng)的技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。可使用標(biāo)準(zhǔn)的固相技術(shù)合成構(gòu)建編碼所需蛋白質(zhì)的部分或全部DNA，優(yōu)選在其中包括限制性位點以易于連接。可為DNA編碼序列提供用于所包含編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的適當(dāng)控制元件。
本發(fā)明還提供了在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達促性腺素或其變體的方法。本發(fā)明的所述方法包括下列步驟-用含有編碼促性腺素基因或突變基因的DNA序列的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬菌株，所述DNA序列受盤基網(wǎng)柄菌屬調(diào)節(jié)序列的控制，-在允許所述DNA序列表達的條件下培養(yǎng)重組菌株，以及-分離所表達的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選所表達的蛋白質(zhì)是單鏈蛋白質(zhì)，即亞單位通過間隔分子共價相連。更優(yōu)選促性腺素是單鏈的hCG。
本發(fā)明的另一方面提供了易于篩選突變的促性腺素的方法。所述方法包括-隨機誘變促性腺素基因-將突變基因插入盤基網(wǎng)柄菌屬質(zhì)粒載體-用所述重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬菌株-在允許DNA序列表達的條件下培養(yǎng)克隆-測定受體結(jié)合/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的比率和-分離比率與野生型促性腺素的比率不同的克隆。
優(yōu)選突變的促性腺素顯示出與天然蛋白質(zhì)與其受體結(jié)合相等的受體結(jié)合。更優(yōu)選突變蛋白質(zhì)與其受體的親和性高于其天然的對應(yīng)物。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至少應(yīng)比天然蛋白質(zhì)高或低2倍。優(yōu)選信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異相當(dāng)于系數(shù)10。
表現(xiàn)出高比率的蛋白質(zhì)可用作拮抗劑，而低比率的蛋白質(zhì)可用作超級激動劑。
測定受體結(jié)合的方法以及測定促性腺素生物活性的體外和體內(nèi)試驗是眾所周知的。
隨機誘變無需對完整的促性腺素基因進行，而只需對單個亞單位基因或明確限定的區(qū)域，如決定簇環(huán)進行。
為了在促性腺素基因中導(dǎo)入隨機的點突變，可使用Taq DNA聚合酶擴增所需的區(qū)域。由于Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’核酸外切編輯活性，該酶是易錯DNA聚合酶，所測定的錯誤比率為每個合成的核苷酸10-5-10-4個錯誤。因此，在基本上標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下使用Taq DNA聚合酶進行PCR可導(dǎo)入突變(Zhou，Y.等(1991)，核酸研究，19，52)。然而，使用這些條件的突變頻率對于誘變較大的序列而言是足夠的，但對于小的DNA片斷(＜500bp)來說卻不夠。加入Mn2+和使用較高濃度的dNTP和Mg2+會使Taq DNA聚合酶出錯誤的機會增加(Leungh，D.W.等(1989)，技術(shù)1，1-15)。調(diào)節(jié)突變頻率，同時也會提供影響突變類型的機會的另一種方法是聯(lián)合使用dITP和有限量的4種dNTPs之一(Spee，J.H.等(1993)，核酸研究，21，777-778)。為了誘變短的靶DNA(＜50bp)，使用簡并的寡核苷酸似乎是可行的方法(Kirchhoff，F(xiàn).和Desrosiers，R.C.(1996)，分子生物學(xué)方法，57，323-333)。通常，此方法有四個步驟。第一步，通過(經(jīng)改良的)PCR擴增所需區(qū)域。第二步，用切割所需DNA序列兩端的一對限制性內(nèi)切核酸酶消化擴增的DNA。第三步，將含有所需DNA序列的DNA片斷與經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶消化的載體DNA連接。第四步，通過轉(zhuǎn)化或電穿孔將所得的重組DNA分子導(dǎo)入細胞。
編碼本發(fā)明任一促性腺素的DNA載體也包括在本發(fā)明的范圍中。通過將編碼天然促性腺素或其變體的DNA與含有盤基網(wǎng)柄菌屬調(diào)節(jié)序列的DNA可操作地相連可得到本發(fā)明的DNA載體。任選地，這些載體也可含有含復(fù)制起點和/或便于染色體外復(fù)制的多肽編碼序列的區(qū)域。該載體的優(yōu)點是可在盤基網(wǎng)柄菌屬宿主細胞中進行染色體外復(fù)制。
如上文所解釋的，根據(jù)突變位點的不同，本發(fā)明的促性腺素變體可以是激動劑或拮抗劑。突變位點可導(dǎo)致分子構(gòu)象發(fā)生微妙的變化。例如，如果在與受體結(jié)合和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)部位選擇突變位點，本發(fā)明的分泌蛋白質(zhì)可導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的部分或完全喪失。這種保留了受體結(jié)合特性的經(jīng)改變的促性腺素可用作拮抗劑。也可選擇具有改善的結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的促性腺素。
本發(fā)明的激動劑促性腺素可用于與天然促性腺素相同的臨床目的。另外，該蛋白質(zhì)可用作診斷工具以檢測生物樣品中與天然蛋白質(zhì)相關(guān)的抗體存在與否。它們也可用作檢測試劑盒中的對照試劑以評估多種樣品中的促性腺素激素水平。拮抗劑可用于例如治療促性腺素依賴型腫瘤；LH/hCG拮抗劑在控制卵巢超刺激的過程中可預(yù)防LH波動，F(xiàn)SH拮抗劑可用于男性避孕。
本發(fā)明的適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物含有一種或多種本發(fā)明的促性腺素和藥物可接受的載體。
藥物可接受的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括例如無菌鹽水，乳糖，蔗糖，磷酸鈣，明膠，糊精，瓊脂，果膠，花生油，橄欖油，芝麻油和水。
另外，本發(fā)明的藥物組合物可含有一種或多種穩(wěn)定劑，例如包括山梨糖醇，甘露醇，淀粉，蔗糖糊精和葡萄糖的碳水化合物，如白蛋白或酪蛋白的蛋白質(zhì)和如堿性磷酸鹽的緩沖液。
適當(dāng)?shù)慕o藥途徑是肌內(nèi)注射，皮下注射，靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射，口服和鼻內(nèi)給藥。
下列實施例闡明了本發(fā)明，但不應(yīng)將其解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


圖1質(zhì)粒和克隆策略。(1A)質(zhì)粒MB12n和MB12n/PsA的圖譜。兩個質(zhì)粒都由4個主要的片斷組成，含有大腸桿菌維持序列(bluescript)，受Dd啟動子控制的殺稻瘟素抗性基因(BSR)，具有Dd啟動子(act15)和終止子(2H3)的克隆盒，和用于盤基網(wǎng)柄菌屬染色體外維持的序列(G4/D5，G5/D6)。MB12n/PsA含有插入MB12n唯一的BglII位點的PsA接頭序列(表1)。(1B)JV158的克隆圖。所用寡核苷酸由水平箭頭表示。寡核苷酸b20aarev中所示的xxx表示已進行了序列取代使序列最優(yōu)化以成為盤基網(wǎng)柄菌屬偏愛的密碼子。(1C)JV10PSA的克隆圖。所有的寡核苷酸序列示于表1。
圖2野生型hLH、hCG和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或Dictyosteliumdiscoideum(Dd)產(chǎn)生的單鏈hCG(sc hCG)與穩(wěn)定表達人LH/CG受體的CHO細胞膜的結(jié)合活性。在有或沒有多種濃度未標(biāo)記的野生型hLH，hCG或單鏈hCG的條件下，將膜與經(jīng)125I-標(biāo)記的hCG保溫。置換曲線被表示為每個劑量的未標(biāo)記激素的最大結(jié)合的百分比。
圖3野生型hLH、hCG和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或Dictyosteliumdiscoideum(Dd)產(chǎn)生的單鏈hCG(sc hCG)的體外生物活性。刺激穩(wěn)定表達人LH/CG受體的CHO細胞之后，通過特異性的RIA測定細胞外的cAMP。
圖4中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或Dictyostelium discoideum(Dd)產(chǎn)生的野生型hCG的體外生物活性。37℃保溫4小時并刺激穩(wěn)定表達人LH/CG受體和報道基因構(gòu)建體的CHO細胞之后，測定螢光素酶的產(chǎn)生。
圖5中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或Dictyostelium discoideum(Dd)產(chǎn)生的野生型FSH的體外生物活性。37℃保溫4小時并刺激穩(wěn)定表達人FSH受體和報道基因構(gòu)建體的CHO細胞之后，測定螢光素酶的產(chǎn)生。
圖6得自CHO細胞的野生型hCG和Dictyostelium discoideum(Dd)產(chǎn)生的選定hCG突變體的體外生物活性。37℃保溫4小時并刺激穩(wěn)定表達人LH/CG受體和報道基因構(gòu)建體的CHO細胞之后，測定螢光素酶的產(chǎn)生。
實施例實施例1設(shè)計表達構(gòu)建體一個促性腺素突變體被選擇用于在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達，該突變體由通過含有5個Ser-Gly重復(fù)的肽十聚體與僅缺乏C-末端肽的β-鏈連接的一個十分完整的α-亞單位組成。
產(chǎn)生了兩個構(gòu)建體，它們的前導(dǎo)序列有所不同。第一個含有hCGβ-亞單位的天然前導(dǎo)序列。為了杜絕因大量(在hCG β-亞單位中約為40％)不常用密碼子的存在可能導(dǎo)致的mRNA翻譯問題，改變編碼序列的前30個堿基使其成為盤基網(wǎng)柄菌屬偏愛使用的密碼子。為了構(gòu)建第二個構(gòu)建體，據(jù)認為在不同物種之間，參與哺乳動物細胞經(jīng)由ER和高爾基體的分泌途徑的蛋白質(zhì)可能不是保守的。為了便于在盤基網(wǎng)柄菌屬中運輸，用盤基網(wǎng)柄菌屬糖蛋白，即通過質(zhì)膜運輸?shù)那版咦拥鞍踪|(zhì)A(PsA)的前導(dǎo)肽替換人β-亞單位的前導(dǎo)肽。以前曾用此前導(dǎo)肽表達過分泌的異源蛋白質(zhì)(Dittrich，W.等(1994)，Bio/Technology 12，614-618)。
表達載體被稱為JV158(與β-亞單位前導(dǎo)肽相適應(yīng)的密碼子)和JV10PSA(具有PsA前導(dǎo)肽)，它們衍生自MB12n。
MB12n是在染色體外維持的8.25kb Dictyostelium discoideum(Dd)質(zhì)粒，在Dd啟動子和終止子之間含有唯一的限制性位點。MB12n由p155d1(Hughes，J.E.等(1994)分子細胞生物學(xué)，14，6117-6124)中含有Dd復(fù)制起點和復(fù)制所需的兩個Dd基因(G4/D5和G5/D6)的2.9kb片斷(ClaI-HincII部分消化的片斷)，pBluescript(Strategene)中用于在大腸桿菌中增殖的2.95kb片斷，在Dd Actine 15啟動子和Dd Actin 8終止子之間含有殺稻瘟素抗性基因的1.35kb片斷(得自pBsr2，Sutoh，K.(1993)，質(zhì)粒30，150-154)，和含有Dd Actin15啟動子、唯一的BglII限制性位點和Dd 2H3終止子的1.05 kb克隆盒(得自BS18.2H3，Kumagai A.等(1989)細胞57，265-275)組成。通過誘變除去殺稻瘟素抗性基因中的BglII位點。圖1A顯示出MB12n中這些組分的相對位置。質(zhì)粒MB12n/PsA含有編碼19個氨基酸長的PsA前導(dǎo)肽的接頭序列(Early，E.A.等(1988)分子細胞生物學(xué)，8 3458-3466；Dittrich等(1994)Bio/Technology 12，614-618)，該序列被克隆于唯一的BglII位點。質(zhì)粒在PsA序列的3’部分具有唯一的NdeI位點，在2H3終止子的5’部分具有唯一的BglII位點以便于“框內(nèi)”定向克隆。在克隆的過程中除去了與Dd Actin 15啟動子相鄰的BglII位點(見表1)。
使用引物b20aarev和alphater(表1)，通過PCR由含有hCG突變體1[β-(1-111)-(Ser-Gly)5-α-(1-92)]的質(zhì)粒(Heikoop，J.C.等(1997)，歐洲生物化學(xué)雜志，245，656-662)擴增單鏈hCG。用BglII消化后，將所得片斷克隆至MB12n中。引物b20aarev被設(shè)計為使β鏈的前10個氨基酸最優(yōu)化，使其成為盤基網(wǎng)柄菌屬偏愛使用的密碼子。用引物bmature(表1)和alphater擴增相同的模板以產(chǎn)生產(chǎn)物，用NdeI和BglII消化之后克隆至MB12n/PsA。所得質(zhì)粒分別被稱為JSV158和JV10PSA(見圖1B和1C)。使用下列循環(huán)參數(shù)，用Expand HighFidelity(Boehringer Mannheim)系統(tǒng)進行PCR94℃變性3分鐘，然后94℃30秒，37℃30秒和72℃60秒共25輪循環(huán)。通過凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切下并用Qiaex II(Qiagen)純化，然后進行限制性消化和克隆。通過雙脫氧測序分析并證實所有的DNA序列。
表1寡核苷酸和PsA接頭的DNA序列。PsA序列也顯示出PsA前導(dǎo)肽的序列以及唯一的限制性位點BglII和NdeI。
Oligo ID序列PsA(BglII) NdeI BglIIagatcatgaa attccaacat acatttattg cattattatc actattaaca tatgcaaatg cagatctM K F Q H T F I A L L S L L T Y A N Ab20aarevgcagatctat ggagatgttc caaggtctcc tccttttatt actcctcagc atgggtggtacatgggcatc caagalphaterccagatctaa acatttaaga tttgtgbmaturegctatcgaca tatgcaaatg catccaagga gccgcttcg實施例2在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達單鏈hCG電穿孔之前，在純種培養(yǎng)基中將盤基網(wǎng)柄菌屬菌株AX3培養(yǎng)至密度為2×106個細胞/ml。使用1微克質(zhì)粒DNA電穿孔107個細胞，電穿孔的條件基本上如文獻所述(Mann S.K.O.等(1994)細胞生物學(xué)實驗室手冊，J.E.Celis編，Academic出版社，Vol 1，pp412-452)。
用質(zhì)粒JV158和JV10PSA以及MB12n對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬。電穿孔之后，將一個小池中的細胞接種于10cm平板上。電穿孔之后12小時，加入殺稻瘟素至終濃度為5μg/ml。電穿孔之后24小時，吸出含有死細胞的培養(yǎng)基，通過吸移到含殺稻瘟素的培養(yǎng)基中以重新懸浮細胞，將細胞分布于96孔微滴板的24個孔中。將24個孔各連續(xù)稀釋10,100和1000倍。每3天換1次含殺稻瘟素的培養(yǎng)基。接種后5至9天鑒定陽性孔，由稀釋系列估計轉(zhuǎn)化頻率。每微克DNA一般可得到1×104至6×104個集落。然后選擇單個孔用于進一步的實驗。單個孔含有200微升培養(yǎng)基，足以進行與hCG有100％交叉反應(yīng)性的DELFIAhLH試驗。該試驗是以直接的夾心技術(shù)為基礎(chǔ)的，其中固定了針對β-亞單位上特異性抗原位點的單克隆抗體。完整的(單鏈)hCG與固相抗體結(jié)合之后，結(jié)合并定量經(jīng)銪標(biāo)記的針對α-亞單位上特異性抗原位點的抗體。按廠商(Wallac Oy，Turku，芬蘭)的描述進行試驗。
結(jié)果清楚地表明兩個表達構(gòu)建體而不是對照質(zhì)粒產(chǎn)生了具有免疫活性的單鏈hCG。另外，JV158產(chǎn)生的單鏈hCG的量(267 mU/ml)看上去比JV10PSA產(chǎn)生的量(4.9 mU/ml)高很多，這表明此時人β-hCG前導(dǎo)肽比PsA中的盤基網(wǎng)柄菌屬前導(dǎo)肽更加有效。
對經(jīng)JV158轉(zhuǎn)化的細胞的單鏈hCG產(chǎn)生的動力學(xué)進行研究。將不同密度的經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞接種于含純種培養(yǎng)基的平板中，培養(yǎng)至鋪滿并維持幾天，不用換培養(yǎng)基。每24小時取出等量的培養(yǎng)基，分析其中單鏈hCG的存在。細胞達到鋪滿后的4至5天，表達水平達到最高(數(shù)據(jù)未顯示)。由于達到鋪滿后約6至7天細胞開始從平板上脫離，故在達到鋪滿后的第5天收獲培養(yǎng)基。實施例3盤基網(wǎng)柄菌屬中表達的單鏈hCG的活性通過用異二聚體hCG進行競爭性結(jié)合試驗以測定盤基網(wǎng)柄菌屬單鏈hCG與人LH/CG受體結(jié)合的能力。將表達人LH/CG受體的CHO細胞(Jia，X.-C.等(1991)，Mol.Endocrinol，5，759-768)同時與125I-hCG和盤基網(wǎng)柄菌屬細胞培養(yǎng)物上清液的純化物質(zhì)保溫。
對分離自指數(shù)生長細胞的膜組分進行放射性配體受體置換試驗以定量檢測純化的單鏈hCG的受體結(jié)合活性。室溫下，在總體積為0.5ml的緩沖液(最終組成為10mM Tris-HCl，5mM MgCl2，0.1％牛血清白蛋白，pH7.4)中，將固定量的膜蛋白與125I-hCG(20,000cpm，約12pM)和量逐漸增加的競爭蛋白質(zhì)一起保溫18小時。經(jīng)125I-標(biāo)記的hCG(NEX-106)得自Du Pont de Nemours。特異性結(jié)合是所加入的總放射性的10-12％。保溫后通過離心分離結(jié)合的和游離的激素。將高度純化的、重組的促性腺素用作標(biāo)準(zhǔn)物。
為了純化盤基網(wǎng)柄菌屬細胞培養(yǎng)物中的hCG，從大(22×22cm)培養(yǎng)板中收獲培養(yǎng)基。借助于使用對照和層析超分辨系統(tǒng)UNICORN(Pharmacia，Roosendaal，荷蘭)的可編程FPLC系統(tǒng)(Pharmacia，Roosendaal，荷蘭)進行純化。聯(lián)合使用疏水作用和用LH/CGβ-亞單位特異性的單克隆抗體進行的免疫層析來純化單鏈hCG。為此，產(chǎn)生了150ml培養(yǎng)基，經(jīng)DELFIA測定出其中的單鏈hCG含量為0.372個單位/ml。使用此培養(yǎng)基得到約3個單位純化的單鏈hCG(得率約為5％)。所有步驟都在4℃進行。
與多種濃度的野生型hCG、野生型hLH或單鏈hCG的共保溫以依賴于劑量的方式置換125I-hCG結(jié)合(圖2)。置換曲線表明由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的物質(zhì)實際上能與人LH/CG受體結(jié)合。對受體的親和性與CHO細胞產(chǎn)生的單鏈hCG的親和性差不多，與hCG異二聚體相比，后者置換125I-hCG結(jié)合的效力差得多。因此，與CHO細胞相比，由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的單鏈hCG的結(jié)合能力沒有什么顯著差別。
通過檢查其刺激表達人LH/CG受體的CHO細胞中cAMP產(chǎn)生的能力，分析盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的單鏈hCG的生物活性。在0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的存在下，將細胞與濃度漸增的激素保溫4小時。通過RIA(Immunotech)測定細胞外的cAMP。
結(jié)果表明由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的單鏈hCG實際上能激活人LH/CG受體，導(dǎo)致cAMP的產(chǎn)生。與CHO細胞中產(chǎn)生的物質(zhì)相比，由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的單鏈hCG的效力僅稍有差別(IC50值約低5倍)。實施例4異二聚體hCG在盤基網(wǎng)柄菌屬中的表達及生物活性我們的目標(biāo)是在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達異二聚體hCG。為了表達hCG的α-和β-亞單位，產(chǎn)生了兩個質(zhì)粒。它們的結(jié)構(gòu)和全部組成與實施例1中描述的MB12n基本上相同。為了便于在Dd中表達兩個獨立的質(zhì)粒，我們用p155d1(Hughes，J.E.等(1994)，分子細胞生物學(xué)，14，6117-6124)中含有新霉素盒的2.4kb KpnI-XbaI片斷取代MB12n中的殺稻瘟素抗性盒，產(chǎn)生了MB12neo。為了構(gòu)建α亞單位的表達載體，使用在片斷的5’和3’末端都導(dǎo)入BglII限制性位點的引物，經(jīng)PCR產(chǎn)生其天然的cDNA序列，以使其能被克隆至MB12neo中。為了構(gòu)建hCGβ-亞單位的表達載體，修飾MB12n以使BglII克隆位點的3’端含有另一個唯一的限制性位點(SphI)[見實施例1]。使用導(dǎo)致編碼序列的前30個堿基發(fā)生變化而成為盤基網(wǎng)柄菌屬偏愛使用的密碼子的5’引物擴增hCGβ-亞單位的cDNA[見實施例1]。引物還在片斷的5’(BglII)和3’(SphI)末端導(dǎo)入了適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c以便于定向克隆。
同時用兩個表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬。轉(zhuǎn)化后，將細胞鋪于培養(yǎng)板中進行克隆稀釋。然后選擇克隆的轉(zhuǎn)化子，繼續(xù)培養(yǎng)供分析時用。使用與hCG有100％交叉反應(yīng)性的DELFIAhLH試驗(Wallac Oy，Turku，芬蘭)，按廠商的描述測定盤基網(wǎng)柄菌屬分泌的hCG的量。結(jié)果清楚地表明具有免疫活性的hCG實際上是由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的。
盡管通過表位檢測的方式證明了培養(yǎng)基中異二聚體hCG的存在，仍必需進行其它實驗以確定由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的hCG是否具有生物活性。定量檢測是以免疫-反應(yīng)性為基礎(chǔ)的。通過在螢光素酶報道分子試驗中檢查其激活人LH/CG受體的能力來分析由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的異二聚體hCG的生物活性。結(jié)果表明由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的異二聚體hCG實際上能激活人LH/CG受體(圖4)。另外，其生物活性與CHO細胞產(chǎn)生的野生型hCG的生物活性差不多(IC50值約高2倍)。實施例5異二聚體FSH在盤基網(wǎng)柄菌屬中的表達及生物活性為了研究盤基網(wǎng)柄菌屬是否也能產(chǎn)生其它復(fù)雜的糖蛋白激素，我們研究了該生物中FSH的產(chǎn)生。根據(jù)hCG所用的策略(實施例4)，產(chǎn)生兩個表達質(zhì)粒。為了構(gòu)建FSHβ-亞單位的表達載體，使用導(dǎo)致編碼序列的前27個堿基發(fā)生變化而成為盤基網(wǎng)柄菌屬偏愛使用的密碼子的5’引物擴增cDNA，按與hCGβ-亞單位相同的方法進行克隆。轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬后，將細胞鋪于培養(yǎng)板中進行克隆稀釋。然后選擇克隆的轉(zhuǎn)化子，繼續(xù)培養(yǎng)供分析時用。
通過夾心免疫測定法[SS-artikel]測定盤基網(wǎng)柄菌屬分泌的FSH的量。結(jié)果表明免疫活性的FSH是由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的。另外，由盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的異二聚體FSH也能激活人FSH受體(圖5)。實施例6在盤基網(wǎng)柄菌屬中隨機誘變hCG的選定區(qū)域由于我們已證實盤基網(wǎng)柄菌屬能產(chǎn)生生物活性的促性腺素，我們的目的是開發(fā)隨機誘變的方法。為此，我們選擇hCG決定簇環(huán)中的兩個氨基酸，已經(jīng)證實這兩個氨基酸參與受體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
通過位點特異性誘變并按上述使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR條件組合序列重疊的PCR片斷以導(dǎo)入特異性的堿基取代。引物被設(shè)計為改變了hCGβ-亞單位的氨基酸94和95。兩個密碼子的前兩個核苷酸的變化完全是隨機的(A，C，T或G)，而第三個堿基僅限為G或T以使導(dǎo)入的終止密碼子的百分比最小。分離PCR片斷，將其亞克隆至pCR2.1(Invitrogen，Leek，The Netherlands)。選擇引物以使亞克隆的PCR片斷的5’末端含有BglII位點，3’末端含有SphI位點。PCR和克隆之后，用pCR2.1構(gòu)建體的集合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。隨后，從200個轉(zhuǎn)化子的集合物中分離DNA，經(jīng)限制性消化之后，將BglII/SphI突變的片斷亞克隆至含有BglII和SphI位點的MB12n中。將含有隨機突變片斷的MB12質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子鋪平板之后，收集400個菌落并制備DNA。
通過電穿孔同時用α-亞單位的表達載體轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬。電穿孔之后5小時，用殺稻瘟素(10μg/ml)進行選擇。第2天，在96孔培養(yǎng)板中使用4倍稀釋對細胞進行克隆稀釋并啟動新霉素選擇(10μg/ml)。每3-4天更換1次培養(yǎng)基，保持選擇條件不變。電穿孔后11-14天鑒定陽性孔，由稀釋系列估計轉(zhuǎn)化效力。用1微克hCGα和hCGβ載體電穿孔107個細胞一般可得到約500個轉(zhuǎn)化子。然后選擇單個孔用于進一步的實驗。單個孔含有200微升培養(yǎng)基。從大(22×22cm)培養(yǎng)板中收獲純化用的較大量的培養(yǎng)基。
分析85個盤基網(wǎng)柄菌屬克隆的上清液中免疫活性和生物活性的存在。作為對照，96孔培養(yǎng)板中存在幾個產(chǎn)生野生型hCG的克隆和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的盤基網(wǎng)柄菌屬克隆。使用與hCG有100％交叉反應(yīng)性的DELFIAhLH試驗(Wallac Oy，Turku，芬蘭)測定野生型和突變的hCG的濃度。隨后，測定對人LH/CG受體的體外生物活性。分析過的85個突變體中的一半顯示出B/I比例在0.35-1.05之間變化?？紤]到2次單獨分析的偏差，可以認為這些突變體的活性與野生型hCG差不多。約40％的突變體顯示出降低的B/I比例。這是能夠預(yù)期的，因為已證明突變的氨基酸94和95參與受體結(jié)合和激活。11個克隆之所以未顯示出任何hCG產(chǎn)生可能是因為改變的氨基酸受突變β-多肽的適當(dāng)折疊和/或與α-亞單位的結(jié)合的干擾，或不是所有克隆都同時含有α-和β-亞單位表達構(gòu)建體的緣故。選擇20個B/I比例不同的克隆以進行詳細的分析。
在6孔培養(yǎng)板中進一步培養(yǎng)選擇的克隆直至鋪滿，4天后收集細胞培養(yǎng)物上清液。20個克隆中有4個不產(chǎn)生任何可測的hCG。這與初次篩選出的克隆的結(jié)果一致。在其它克隆中，所產(chǎn)生的hCG的量也變化很大(116-2118mU/ml)。分析細胞培養(yǎng)物上清液中一定濃度范圍的hCG的體外生物活性的存在。當(dāng)更詳細地分析時，顯示出的B/I比例位于初次篩選的野生型hCG范圍之內(nèi)的所有突變體也顯示出野生型的體外生物活性。未顯示出任何免疫活性的4個上清液也不能激活LH/CG受體。因此，我們得出結(jié)論這些克隆不產(chǎn)生任何hCG。另外，在初次篩選時B/I比例降低的所有突變體實際上都顯示出明顯的IC50增加。它們的B/I比例比盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的野生型hCG低2倍至＞100倍。8個突變體的劑量/反應(yīng)曲線示于圖6。
為了使觀察到的生物活性與β-亞單位中存在的突變相聯(lián)系，測序突變的表達載體。從選定的盤基網(wǎng)柄菌屬克隆中分離總DNA，并用此DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對每個盤基網(wǎng)柄菌屬克隆而言，通過菌落-PCR分析大量轉(zhuǎn)化子中α-亞單位質(zhì)?；颚?亞單位質(zhì)粒的存在。隨后，從含有β-亞單位質(zhì)粒的幾個轉(zhuǎn)化子中分離DNA，使用自動化的測序儀(Pharmacia)對突變的區(qū)域進行序列分析。
因此，大多數(shù)盤基網(wǎng)柄菌屬克隆在hCGβ表達載體中僅含有1種類型的突變。這些克隆產(chǎn)生單一類型的突變體。另外，我們的結(jié)論是所分析的大多數(shù)盤基網(wǎng)柄菌屬克隆在β-亞單位的第94和95位含有不相關(guān)的序列，這表明誘變實際上是隨機的。實施例7得自Dictyostelium discoideum的rec hCG的質(zhì)譜分析通過隨后的疏水作用層析和使用與LH和hCG共有表位反應(yīng)的MoAb119A進行的免疫層析從培養(yǎng)物上清液中分離盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的重組hCG。將抗體固定于NHS-Sepharose上。將經(jīng)酸洗脫的純化rec hCG對著50％乙腈透析并凍干。將蛋白質(zhì)溶解于0.1％的TFA中，使用superDHB作為基質(zhì)，用MALDI-TOF進行質(zhì)譜分析。將由CHO細胞產(chǎn)生并用相同的純化方法分離的純的rec hCG用作參照。
盤基網(wǎng)柄菌屬物質(zhì)的α-和β-亞單位的分子量比得自CHO細胞的相應(yīng)亞單位的低，盤基網(wǎng)柄菌屬亞單位的峰中位值為11578和17351 D，而CHO多肽的相應(yīng)值為14013和23284 D。這一觀察結(jié)果表明盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)生的激素上存在較少和/或較短的碳水化合物鏈。另外，相應(yīng)亞單位的峰寬有很大不同，即盤基網(wǎng)柄菌屬α-為11110-12452 D(1342D)，而CHOα-鏈為12959-15591 D(2632 D)，盤基網(wǎng)柄菌屬β-為17006-18104D(1098 D)，而CHO β-鏈為20674-25208 D(4534 D)。這表明盤基網(wǎng)柄菌屬產(chǎn)物的糖基化較為簡單。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱AKZO NOBEL N.V.
(B)街道Velperweg 76(C)城市Arnhem(E)國家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)6824 BM(G)電話0412 666379(H)電傳0412 650592(ii)發(fā)明題目在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達促性腺素(iii)序列數(shù)5(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度67個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置6..62(xi)序列描述SEQ ID NO1AGATC ATG AAA TTC CAA CAT ACA TTT ATT GCA TTA TTA TCA CTA TTA47Met Lys Phe Gln His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10ACA TAT GCA AAT GCA GATCT67Thr Tyr Ala Asn Ala15(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Phe Gln His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Ser Leu Leu Thr Tyr1 5 10 15Ala Asn Ala(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度74個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GCAGATCTAT GGAGATGTTC CAAGGTCTCC TCCTTTTATT ACTCCTCAGC ATGGGTGGTA60CATGGGCATC CAAG 74(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CCAGATCTAA ACATTTAAGA TTTGTG 26(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTATCGACA TATGCAAATG CATCCAAGGA GCCGCTTCG 39
權(quán)利要求
1.可以通過在盤基網(wǎng)柄菌屬宿主中進行異源表達而得到的促性腺素或其突變體。
2.權(quán)利要求1的突變的促性腺素，其特征在于亞單位是共價連接的。
3.權(quán)利要求1或2的促性腺素，其用作治療物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的促性腺素，其特征在于所述促性腺素是hCG或FSH。
5.含有權(quán)利要求1或2的促性腺素和藥物可接受的載體的藥物組合物。
6.產(chǎn)生促性腺素或其突變體的方法，所述方法包括下列步驟-用含有編碼促性腺素基因或突變基因的DNA序列的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬菌株，所述DNA序列受盤基網(wǎng)柄菌屬調(diào)節(jié)序列的控制，-在允許所述DNA序列表達的條件下培養(yǎng)重組菌株，以及-分離所表達的蛋白質(zhì)。
7.選擇具有超級激動劑或拮抗劑特性的促性腺素突變體的方法，所述方法包括下列步驟-隨機誘變促性腺素基因-將突變基因插入盤基網(wǎng)柄菌屬質(zhì)粒載體-用所述重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化盤基網(wǎng)柄菌屬菌株-在允許DNA序列表達的條件下培養(yǎng)克隆-測定所表達蛋白質(zhì)的受體結(jié)合/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)比率-分離比率與野生型促性腺素的比率不同的克隆。
全文摘要
本發(fā)明涉及在盤基網(wǎng)柄菌屬中表達的促性腺素。發(fā)現(xiàn)促性腺素以生物活性形式被分泌。促性腺素在盤基網(wǎng)柄菌屬中的表達為選擇促性腺素突變體提供了簡單的方法。
文檔編號C12N15/09GK1269834SQ98808921
公開日2000年10月11日 申請日期1998年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月8日
發(fā)明者P·D·J·格魯坦輝斯, J·C·海庫普, M·H·K·林斯肯斯, P·J·M·范哈斯特特, M·布勞 申請人:阿克佐諾貝爾公司