專利名稱：：?jiǎn)渭儼捳畈《据d體和重組病毒及宿主細(xì)胞及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種病毒載體、包括該病毒載體的重組病毒、包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的宿主細(xì)胞，以及包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的藥物組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于一種單純皰疹病毒載體、包括該病毒載體的重組病毒、包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的宿主細(xì)胞，以及包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)渭儼捳畈《?Herpessimplexvirus,HSV)呈球形，完整的單純皰疹病毒由核心、衣殼、被膜(Tegument)和囊膜組成。該病毒的核心含有雙鏈DNA，纏繞成纖絲巻軸。衣殼呈二十面體對(duì)稱，直徑為100納米左右，由162個(gè)殼微粒組成。衣殼由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜。包括囊膜的病毒直徑為150-200納米。囊膜表面含有病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)。單純皰疹病毒包括I型單純皰疹病毒(HerpesSimplexVirusTypeI,HSV-1)以及II型單純皰疹病毒。該病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力與單純皰疹病毒囊膜糖蛋白的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，即囊膜糖蛋白的立體結(jié)構(gòu)決定了病毒能否進(jìn)入宿主細(xì)胞，以及能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞的病毒滴度。由于單純皰疹病毒能以人類細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，并且能夠感染的人類細(xì)胞類型廣、發(fā)生意外增殖可以用抗皰疹藥物阻止、裂解期和潛伏期都不整合宿主細(xì)胞基因組插入突變危險(xiǎn)小，因此，單純皰疹病毒已經(jīng)用于腫瘤或神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的基因治療。例如，I型單純皰疹病毒F株HSV1716用于腦膠質(zhì)瘤的治療(參見(jiàn)"HSV1716injectionintothebrainadjacenttotumourfollowingsurgicalresectionofhigh-gradeglioma:safetydataandlong-termsurvival",S.Harrow等人，GeneTherapy,11,1648-1658,2004);I型單純皰疹病毒17+株感染腫瘤細(xì)胞，通過(guò)該病毒的裂解性復(fù)制溶解腫瘤細(xì)胞而治療癌癥。此外，單純皰疹病毒的編碼感染細(xì)胞多肽34.5(infectedcellpolypeptides,ICP34.5)的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因已分別被證實(shí)對(duì)人體正常細(xì)胞有害但不影響單純皰疹病毒在腫瘤細(xì)胞中的增殖，因此可以通過(guò)敲除所述三個(gè)基因中的一個(gè)或幾個(gè)制備單純皰疹病毒載體(參見(jiàn)"Mappingofherpessimplexvirus-1neurovimlencetogamma134.5，agenenonessentialforgrowthinculture",JChou等人，5Wewce，Vol250,Issue4985,1262-1266，1990年9月；TreatmentofMalignantGliomasUsingGanciclovir-hypersensitive,RibonucleotideReductase-deficientHerpesSimplexViralMutant,ToshihiroMineta等人，Cawcer/^earc/z54，3963-3966,1994年8月；以及CN12838030。所述單純皰疹病毒載體可以以空載體的形式感染腫瘤細(xì)胞，通過(guò)病毒載體的迅速增殖殺傷腫瘤細(xì)胞；也可以攜帶抗腫瘤外源基因(例如粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)，通過(guò)病毒載體增殖和外源基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，感染不同人種的I型單純皰疹病毒基因組具有明顯不同的限制性內(nèi)切酶分解模式，即存在限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)(參見(jiàn)"Quantitativeanalysisofgenomicpolymorphismofherpessimplexvirustype1strainsfromsixcountries:studiesofmolecularevolutionandmolecularepidemiologyofthevirus",H.Sakaoka等人，JournalofGeneralVirology,Vol75，513-527，1994)，單純皰疹病毒17+株從白色人種中分離，因此，將易于感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株，敲除編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)后所得的載體，在用于對(duì)黃色人種進(jìn)行基因治療時(shí)，存在病毒感染率低、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度慢的缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是克服現(xiàn)有缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因的單純皰疹病毒載體用于黃色人種基因治療時(shí)病毒感染率低、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度慢的缺點(diǎn)，提供一種缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因的單純皰疹病毒載體，該病毒載體用于黃色人種基因治療時(shí)，病毒感染率高、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度快。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供包括上述病毒載體的重組病毒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供包括上述病毒載體和/或上述重組病毒的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種包括上述病毒載體和/或上述重組病毒的藥物組合物。本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)易于感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株敲除編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)后所得的載體，在用于對(duì)黃色人種進(jìn)行基因治療時(shí)，存在病毒感染率低、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度慢的缺點(diǎn)，從成年中國(guó)人口角皰疹中分離出單純皰疹病毒(分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學(xué)名為//^;^S/m/tecWn^pe/，于2006年6月14日保藏至位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1736)，并對(duì)該病毒進(jìn)行了基因組全序列測(cè)定和分析，確定了該臨床分離株與I型單純皰疹病毒17+株在編碼囊膜蛋白的基因方面存在的差異。而且本發(fā)明的發(fā)明人還敲除了單純皰疹病毒編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，得到毒性低、可以攜帶更多目的基因的單純皰疹病毒載體。本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，所述病毒載體具有囊膜蛋白，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)該病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.l、SEQID:NO,3、SEQID:NO,5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列中的一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，所述病毒具有編碼囊膜蛋白的基因，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)該病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.l、SEQID:NO,3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列中的一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括病毒載體和目的基因，其中，所述病毒載體為本發(fā)明所述的單純皰疹病毒載體。本發(fā)明還提供了一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其中，所述病毒為本發(fā)明提供的病毒載體和/或重組病毒。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明提供的病毒載體和/或重組病毒。本發(fā)明提供了一種分離自黃色人種且缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因的單純皰疹病毒載體，該病毒載體對(duì)于黃色人種宿主細(xì)胞的特異性侵染率高，復(fù)制速度快，毒性低，因此可以直接用于侵染并溶解黃色人種的腫瘤細(xì)胞，也可以作為病毒載體攜帶基因藥物至黃色人種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因治療。此外，與現(xiàn)有的分離自白色人種且敲除編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因得到的I型單純皰疹病毒17+株載體相比，本發(fā)明病毒載體用于其他人種多發(fā)腫瘤細(xì)胞時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解能力更強(qiáng)。本發(fā)明涉及的單純皰疹病毒的分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學(xué)名為//er/7MS/m/fecWms/，于2006年6月14日保藏至位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1736。圖1為本發(fā)明涉及單純皰疹病毒的電子顯微鏡照片(放大52000倍)；圖2為正常人乳腺癌細(xì)胞系MCF—7培養(yǎng)96小時(shí)的生長(zhǎng)情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)；圖3為培養(yǎng)MCF—7細(xì)胞48小時(shí)后，按病毒活性顆粒/細(xì)胞數(shù)的比值(MOI)為0.1轉(zhuǎn)染本發(fā)明病毒后再培養(yǎng)48小時(shí)的生長(zhǎng)情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)；圖4為本發(fā)明病毒載體對(duì)人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的藥效照片；圖5為本發(fā)明病毒載體對(duì)結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的曲線；圖6為表達(dá)由本發(fā)明病毒載體攜帶的綠色熒光蛋白基因的人鼻咽癌細(xì)胞。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，所述病毒載體具有囊膜蛋白，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列中的一種或幾種。所述囊膜蛋白一般為糖蛋白，與病毒載體侵染宿主細(xì)胞有關(guān)，例如病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)和病毒糖蛋白D(gD)都與吸附/穿入宿主細(xì)胞有關(guān)，它們還都可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞融合，并都有誘生宿主細(xì)胞中和抗體的作用；病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)都能誘生細(xì)胞毒作用。由于本發(fā)明的單純皰疹病毒載體的囊膜蛋白，例如SEQID:NO.l所示的病毒糖蛋白B、SEQID:N0.3所示的病毒糖蛋白C、SEQID:NO.5所示的病毒糖蛋白D、SEQID:N0.7所示的病毒糖蛋白G和SEQID:NO.9所示的病毒糖蛋白M中的一種或幾種，與野生型單純皰疹病毒17+敲除編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因得到的病毒載體的相應(yīng)囊膜蛋白相比，發(fā)生了變異，囊膜蛋白的立體結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞的相應(yīng)靶標(biāo)(例如細(xì)胞表面受體)更吻合，因此能進(jìn)入宿主細(xì)胞尤其是黃色人種宿主細(xì)胞的病毒載體更多，因而使病毒載體感染率明顯提高。組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸殘基，按照側(cè)鏈極性可以分成四類1、非極性的氨基酸如丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro);2、極性不帶電荷的氨基酸如甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr);3、帶正電荷的氨基酸如精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His);4、帶負(fù)電荷的氨基酸如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見(jiàn)"生物化學(xué)"(第二版)上冊(cè)，沈同、王鏡巖，第82-83頁(yè)，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質(zhì)中如果發(fā)生同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中所起的作用如提供正電荷或形成疏水囊袋結(jié)構(gòu)的作用沒(méi)有改變，因此對(duì)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)并不會(huì)產(chǎn)生影響，因此仍然可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的功能。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser禾口Asn、Ala禾卩Val、Ser禾BGly、Tyr禾卩Phe、Ala禾卩pro、Lys禾口Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會(huì)影響蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)和功能。所述同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代可以發(fā)生在上述囊膜蛋白的任意一個(gè)氨基酸殘基位置上。相反，不同類別的氨基酸殘基發(fā)生取代，會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能出現(xiàn)差異。例如與單純皰疹病毒17+敲除編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因得到的病毒載體比較，本發(fā)明單純皰疹病毒載體因囊膜糖蛋白的堿基發(fā)生了不同類別的取代，如單純皰疹病毒17+載體的病毒糖蛋白B的第79位氨基酸殘基為賴氨酸，而本發(fā)明單純皰疹病毒載體的病毒糖蛋白B的第79位氨基酸殘基為蘇氨酸，因此本發(fā)明的單純皰疹病毒載體更易感染黃色人種。對(duì)所述SEQID:NO.l所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.l中第79位為絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸或甘氨酸的氨基酸序列。對(duì)所述SEQID:N0.3所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列可以為SEQID:NO.3中第201位為谷氨酸的氨基酸序列和/或SEQID:NO.3中第295位為賴氨酸或精氨酸的氨基酸序列。對(duì)所述SEQID:NO.5所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列可以為SEQID:NO.5中第369位為賴氨酸或精氨酸的氨基酸序列。對(duì)所述SEQID:NO.7所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.7中第3位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第86位為天冬氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第116位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第118位為天冬氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第130位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第151位為甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第153位為天冬氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第162位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第164位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第208位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和第236位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:NO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列可以為SEQID:NO.9中第440位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和/或SEQID:N0.9中第446位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列。本發(fā)明所述氨基酸序列優(yōu)選選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO,3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:NO.9所示的氨基酸序列中的一種或幾種。更優(yōu)選所述氨基酸序列為SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:N0.9所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，所述病毒載體具有編碼囊膜蛋白的基因，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:N0.7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:NO,9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列中的一種或幾種。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，組成蛋白質(zhì)的20種不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個(gè)密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第二版，1989，見(jiàn)950頁(yè)附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，決定一個(gè)氨基酸的密碼子大多不止一個(gè)，三聯(lián)體密碼子中第三個(gè)核苷酸的置換，往往不會(huì)改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以不同。本領(lǐng)域人員根據(jù)公知的密碼子表，從本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，完全可以推導(dǎo)出能夠編碼它們的核苷酸序列，通過(guò)生物學(xué)方法(如PCR方法、突變方法)或化學(xué)合成方法得到所述核苷酸序列，應(yīng)用到重組技術(shù)以及基因治療當(dāng)中，因此該部分核苷酸序列都應(yīng)該包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。相同道理，利用本文公開(kāi)的DNA序列，也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第二版，1989)進(jìn)行，通過(guò)修改本發(fā)明提供的核苷酸序列，得到與本發(fā)明所述囊膜蛋白功能一致的氨基酸序列。優(yōu)選所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.10所示的核苷酸序列，以及對(duì)所述SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:N0.6、SEQID:NO.8或SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對(duì)所述SEQID:N0.2所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.2中第144位為胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第183位為腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第186位為A、G或T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第210位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第219位為G的核苷酸序列、SEQID:NO,2中第237位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第865位為T的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第867位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1161位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第1410位為T、G或C的核苷酸序歹ij、SEQID:NO.2中第1513位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1515位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2095位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2097位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2196位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2530位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2532位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.2中第2562位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:NO.4所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.4中第120位為G、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第177位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第267位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第597位為T的核苷酸序列、SEQID:NO,4中第865位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第867位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第1059位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第1149位為T、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.4中第1368位為T、G或C的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:N0.6所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.6中第75位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第90位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第822位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第870位為G的核苷酸序列、SEQID:N0.6中第948位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第963位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1095位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1099位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1101位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1105位為A的核苷酸序列和SEQID:NO.6中第1107位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:NO.8所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.8中第9位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第108位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第228位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第258位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第261位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第270位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第327位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第336位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第345位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第348位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第351位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第354位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第390位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第396位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第430位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第432位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第453位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第459位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第472位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第474位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第486位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第492位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第501位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第624位為A、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.8中第708位為A、T或G的核苷酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.10中第27位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第136位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第138位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第315位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第489位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第609位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第618位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第643位為A的核苷酸序歹U、SEQID:NO.10中第645位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第728位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第762位為T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第784位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第786位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第954位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第966位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1320位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1338位為T的核苷酸序列和SEQID:NO.10中第1344位為A的核苷酸序列中的一種或幾種。單純皰疹病毒的立即早期基因(immediateearlyphase,IE)指病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞就立即利用宿主細(xì)胞表達(dá)(一般在l小時(shí)內(nèi))的基因，由于單純皰疹病毒載體對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力還與該病毒載體的立即早期基因編碼的感染細(xì)胞多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)豐度有關(guān)，即編碼感染細(xì)胞多肽的立即早期基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的豐度越高，則病毒載體在宿主細(xì)胞中的增殖速度越快。因此更優(yōu)選所述病毒載體還包括一種具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列，即一種立即早期基因編碼的感染細(xì)胞多肽表達(dá)豐度更高的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.ll所示的氨基酸序列、SEQID:NO.13所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.ll或SEQID:NO.13所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:NO.ll進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.ll中第34位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.ll中第102位為絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.ll中第281位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.ll中第351位為精氨酸或組氨酸的氨基酸序列和SEQID:NO.ll中第360位為賴氨酸或組氨酸的氨基酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:N0.13進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.13中第36位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第178位為賴氨酸或精氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第179位為賴氨酸或組氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第180位為賴氨酸或組氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.3中第181位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第206位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第383位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選所述病毒載體還包括一種具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列為SEQID:NO.ll所示的氨基酸序列和/或SEQID:NO.13所示的氨基酸序列。所述編碼囊膜蛋白的基因中，所述囊膜蛋白更優(yōu)選選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:NO,9所示的氨基酸序列的囊膜蛋白中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選所述核苷酸序列選自SEQID:NO,2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列中的一種或幾種。更進(jìn)一步優(yōu)選所述核苷酸序列為SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列。更優(yōu)選所述病毒載體還包括一種編碼具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:NO，12所示的核苷酸序列、SEQID:N0.14所示的核苷酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.12或SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對(duì)所述SEQID:NO.12所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.12中第102位為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或鳥(niǎo)嘌呤(G)的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第306位為A、T或胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第570位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第612位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第652位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第654位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第729位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第843位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第1053位為G的核苷酸序列和SEQID:NO.12中第1080位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對(duì)所述SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.14中第108位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第465位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第519位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第534位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第535位為A的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第537位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第540位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO,14中第588位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO,14中第618位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.14中第1149位為A、T或G的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選所述病毒載體還包括一種編碼具有促進(jìn)病毒載體增殖功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列為SEQID:N0.12所示的核苷酸序列和/或SEQID:NO.14所示的核苷酸序列。用于制備本發(fā)明所述病毒載體的單純皰疹病毒可以為核苷酸序列與NCBI中ID:NC一001806的I型單純皰疹病毒17+的核苷酸序列具有99.5%的同源性的單純皰疹病毒，二者的差別如表1所示。表1中的"變異位置"為ID:NC001806的I型單純皰疹病毒17+的全序列核苷酸的堿基編號(hào)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>本發(fā)明單純皰疹病毒載體不僅在侵染黃色人種宿主細(xì)胞的能力方面增強(qiáng)，而且用于其他人種多發(fā)腫瘤細(xì)胞時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解能力更強(qiáng)。本發(fā)明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括病毒載體和目的基因，其中，所述病毒載體為本發(fā)明的單純皰疹病毒載體。本發(fā)明的單純皰疹病毒載體不僅可以單獨(dú)作用裂解殺傷腫瘤細(xì)胞，而且還可以通過(guò)傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的單純皰疹病毒載體可以攜帶0.1-50kb的目的基因，優(yōu)選攜帶10-40kb的目的基因。所述目的基因可以為抗腫瘤活性的基因，例如編碼前體藥物激活蛋白的基因、編碼腫瘤抑制蛋白的基因、編碼細(xì)胞凋亡因子(pro-apoptoticfactors)前體的基因和編碼免疫刺激蛋白的基因中的一種或幾種。所述免疫刺激蛋白可以為自身具有細(xì)胞毒性的蛋白、能夠刺激/增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的蛋白。當(dāng)然本發(fā)明的病毒載體也可以用來(lái)將一種或幾種目的基因傳遞至需要其表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，該細(xì)胞可以是非腫瘤細(xì)胞例如神經(jīng)細(xì)胞，所述一種或幾種目的基因可以為編碼改變對(duì)疼痛刺激應(yīng)答或緩解慢性疼痛的多肽的基因，所述多肽例如能夠隔絕例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、其它疼痛調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣分子的蛋白，物質(zhì)P以及其它神經(jīng)肽。所述一種或幾種目的基因也可以為編碼能夠刺激變性性疾病中損傷神經(jīng)再生長(zhǎng)或防止神經(jīng)進(jìn)一步變性的多肽的基因。所述目的基因還可以包括調(diào)控序列，例如所述一種或幾種目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子。所述目的基因也可以包括標(biāo)記基因(例如，編碼P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白或其它熒光蛋白的基因)或其產(chǎn)物調(diào)節(jié)其它基因表達(dá)的基因。所述目的基因除可以是DNA夕卜，還可以是mRNA、tRNA或rRNA，還可以包括通常與轉(zhuǎn)錄序列相關(guān)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和下游增強(qiáng)子元件。.本發(fā)明還提供了一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其中，所述病毒為本發(fā)明的單純皰疹病毒載體和/或重組病毒。單純皰疹病毒載體可以定義為缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因的單純皰疹病毒，與正常單純皰疹病毒一樣，也需要在宿主細(xì)胞內(nèi)完成其生活史，因此所述病毒載體和重組病毒的傳代增殖以及活化需要在宿主細(xì)胞中進(jìn)行。而在體外感染有本發(fā)明單純皰疹病毒載體和/或重組病毒的宿主細(xì)胞，也可以作為基因治療的藥物導(dǎo)入體內(nèi)。所述宿主細(xì)胞可以是各種能夠培養(yǎng)本發(fā)明病毒載體和/或重組病毒的宿主細(xì)胞，例如非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、原代兔腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)以及人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(WI-38細(xì)胞)。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明的單純皰疹病毒載體和/或重組病毒。本發(fā)明的單純皰疹病毒載體可以單獨(dú)使用裂解殺傷腫瘤細(xì)胞；還可以攜帶目的基因制備重組病毒，所述重組病毒單獨(dú)使用通過(guò)傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的單純皰疹病毒載體和本發(fā)明的重組病毒也可以同時(shí)使用。本發(fā)明的單純皰疹病毒載體、本發(fā)明的重組病毒以及它們的混合物都還可以包括藥物可接受的載體或賦形劑，以藥物組合物的形式使用。所述藥物可接受的載體或賦形劑指無(wú)毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料，例如，包括但不限于鹽水、緩沖鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適于胃腸外、舌下、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、頰內(nèi)、腫瘤內(nèi)或表皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。適于胃腸外給藥的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨使用前在無(wú)菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、內(nèi)二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、保護(hù)劑和分散劑佐劑，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。優(yōu)選加入滲透壓調(diào)節(jié)劑如糖類、氯化鈉、氯化鉀。表皮給藥包括在皮膚、黏膜上以及在肺和眼表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選為栓劑，它可以通過(guò)將本發(fā)明的載體與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合制備，所述賦形劑或載體在室溫為固態(tài)，在體溫下為液態(tài)，因此在直腸或陰道腔內(nèi)熔化并釋放出活性化合物。優(yōu)選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明提供的單純皰疹病毒載體和/或重組病毒，每毫升所述注射液中含有10(2)-10(10)空斑形成數(shù)的所述病毒載體和/或重組病毒。所述藥學(xué)上可接受的載體可以為pH值為4.0-9.0的磷酸緩沖液。所述注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以所述注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01-30重量％，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。使用所述注射液進(jìn)行時(shí)，給予的病毒量范圍為103-101()空斑形成數(shù)(pfti)、優(yōu)選105-108pfo、更優(yōu)選106-108pfb。當(dāng)注射本發(fā)明所述藥用組合物時(shí)，注射用量可以為本領(lǐng)域常用的劑量，至多500微升、一般1-200微升、優(yōu)選1-10微升；但是根據(jù)所述腫瘤和接種部位，也可以使用至多10毫升的劑量。因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量?jī)H作為參考。所述劑量可以根據(jù)各種參數(shù)、尤其根據(jù)待治療患者的年齡、體重和病癥、疾病或病癥的嚴(yán)重程度以及給藥途徑來(lái)確定。此外，對(duì)于癌癥患者優(yōu)選的給藥途徑是直接注射到腫瘤內(nèi)。本發(fā)明所述藥物組合物注射液也可以系統(tǒng)給藥，也可以將本發(fā)明的藥物組合物注射液注射到為腫瘤供血的血管內(nèi)給藥。最優(yōu)選給藥途徑取決于所述腫瘤的位置和大小。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基均為市售商品。實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明單純皰疹病毒載體的制備。(1)病毒的采集成年中國(guó)男性，37歲，漢族，多次口角皰疹反復(fù)發(fā)作病史，無(wú)其他疾病，呈典型I型單純皰疹病毒復(fù)發(fā)感染臨床表現(xiàn)——口角周圍出現(xiàn)皰疹樣水泡兩天后取樣。取15毫升的無(wú)菌離心管，盛有3毫升無(wú)菌的含100微克/毫升卡那霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)，所述緩沖液中含有9克/升的NaCl、0.21克/升的KH2P04以及0.97克/升的Na2HP04.12H20;用無(wú)菌棉簽擠壓皰疹樣水皰至淡黃色分泌物流出，然后用棉簽蘸取該分泌物，將所得棉簽帶有分泌物的一端在上述PBS緩沖液中涮洗10秒鐘。取出棉簽，用滅菌微量加樣器將所得含有分泌物的緩沖液吹吸均勻。(2)病毒的接種、培養(yǎng)和純化用含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以5X105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)，37'C下在5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，至每孔Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿80X。然后在無(wú)菌環(huán)境下，向上述六孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入200微升的(1)得到含有分泌物的PBS緩沖液(采樣后l小時(shí)完成接種)。繼續(xù)在5XC02培養(yǎng)箱中37'C下培養(yǎng)24小時(shí)后，在無(wú)菌環(huán)境下，在光學(xué)顯微鏡下以100倍的放大倍數(shù)觀察Vero細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒噬斑;用滅菌微量加樣器吸取單個(gè)的病毒噬斑10微升，將10微升吸取的液體混入100微升的DMEM培養(yǎng)基中，并用微量加樣器將所得含有病毒的DMEM培養(yǎng)基吹吸均勻。在無(wú)菌環(huán)境下，向另外一個(gè)長(zhǎng)滿80XVero細(xì)胞的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入上述得到含有純化病毒的DMEM培養(yǎng)基，感染該Vero細(xì)胞。在5%(^02培養(yǎng)箱中37'C下培養(yǎng)獲得純化的本發(fā)明單純皰疹病毒。(3)病毒的生物學(xué)特性分析如圖1所示，52000倍電鏡下觀察到(2)純化的病毒具有典型的單純皰疹病毒形態(tài)衣殼呈二十面體對(duì)稱，直徑為100納米左右。衣殼外由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜，包括囊膜的病毒直徑為150至200納米。此外發(fā)明人委托杭州華大基因公司還對(duì)(2)純化的病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如上述表l所示，所得病毒與NCBI中編號(hào)為ID:NC—001806的1型單純皰疹病毒17+的序列同源性為99.5%。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)得到的全基因組序列進(jìn)行了分析，得到如SEQID:N0.2、SEQID:NO,4、SEQID:N0.6、SEQID:N0.8，以及SEQID:NO.10所示的編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列，并由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.l(病毒糖蛋白B)、SEQID:NO.3(病毒糖蛋白C)、SEQID:NO.5(病毒糖蛋白D)、SEQID:NO.7(病毒糖蛋白G),以及SEQID:NO.9(病毒糖蛋白M)所示的囊膜蛋白的氨基酸序列。通過(guò)與ID:NCJ)01806的相應(yīng)基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)(2)得到的純化病毒編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列存在變異。此外還得到了如SEQID:N0.12以及SEQID:NO,14所示的編碼感染細(xì)胞多肽的立即早期基因的核苷酸序列，并由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.ll(感染細(xì)胞多肽a22)以及SEQID:NO.13(感染細(xì)胞多肽a27)。(4)編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的敲除。按照CN1283803C記載的方法，分別敲除編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，得到如表2所示的一組單純皰疹病毒載體。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的單純皰疹病毒載體對(duì)黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)的溶解能力。(1)單純皰疹病毒載體滴度的測(cè)定用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在7個(gè)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以5X105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)(美國(guó)ATCC)，37'C下在5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，至每孔Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿80%備用。無(wú)菌條件下，收集分別培養(yǎng)有實(shí)施例1表2所示7種單純皰疹病毒載體的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物的上清培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基分別梯度稀釋成1X1()2倍液、1X103倍液、1X1()4倍液、1X105倍液、1X1()6倍液以及1X107倍液，每種稀釋液各100微升。無(wú)菌條件下，棄去上述六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)好的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后每孔加入上述稀釋用的不含血清的DMEM培養(yǎng)基1毫升，接著將上述制得的6個(gè)濃度的一種病毒載體稀釋液分別加入6個(gè)孔中，每孔100微升。每種病毒載體加在一個(gè)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，共得到7個(gè)加有病毒載體的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染有病毒載體的Vero細(xì)胞六孔培養(yǎng)板置于5XC02培養(yǎng)箱中37'C下培養(yǎng)1小時(shí)，無(wú)菌條件下棄去孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入2毫升羧甲基纖維素培養(yǎng)基(將羧甲基纖維素粉末與PBS溶液按照重量體積比2:125混合后，在4"C冰箱保存12小時(shí)，溶解完全后121.3t:滅菌30分鐘，無(wú)菌條件下，將所得無(wú)菌1.6重量體積％的羧甲基纖維素PBS溶液與含10Q%FBS的DMEM按體積1:2混合制得)。置于5%(:02培養(yǎng)箱中37"C下培養(yǎng)48小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液將細(xì)胞潤(rùn)洗2次，棄去PBS溶液，加入2毫升含有0.1體積％的戊二醛(美國(guó)Sigma)的PBS溶液，25"C下放置10分鐘。再次將細(xì)胞用PBS溶液潤(rùn)洗兩次，棄去PBS溶液，加入l毫升0.1重量體積％的結(jié)晶紫溶液(用20體積%乙醇作為溶劑配制)，25。C下放置IO分鐘。用純凈水潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，用吸水紙擦干六孔板背面的水，將六孔板置于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)空斑。計(jì)算得出如表3所示每毫升病毒載體原液形成的空斑數(shù)，即病毒載體原液的滴度，單位為空斑形成單位/毫升(pfWml)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>(2)人鼻咽癌細(xì)胞的培養(yǎng)37。C下在5XC02培養(yǎng)箱中用6毫升含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)接種在25平方厘米的培養(yǎng)瓶中的CNE-1細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所)48小時(shí)，用放大100倍的倒置顯微鏡CNE-1細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。無(wú)菌條件下，加入0.25°/。的胰蛋白酶1毫升，在37。C下消化所述處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞5分鐘。用倒置顯微鏡觀察CNE-1細(xì)胞在培養(yǎng)基溶液中游離后，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋成1乂104個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，微量進(jìn)樣器吹打均勻后加入96孔板中，每孔加IOO微升細(xì)胞懸液，在37"C、5%(:02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(3)病毒載體的轉(zhuǎn)染以及人鼻咽癌細(xì)胞存活率的測(cè)定用已知滴度的步驟(1)的單純皰疹病毒載體原液，按照步驟(1)的方法以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)為0.1轉(zhuǎn)染上述培養(yǎng)的CNE-1細(xì)胞。其中對(duì)照孔加入與病毒原液等體積的含1。/。小牛血清DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照孔CNE-1細(xì)胞和被轉(zhuǎn)染的CNE-1細(xì)胞都在37-C下5°/^02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)用MTT法(具體方法記載在"測(cè)定細(xì)胞存活和增殖的MTT方法的建立"，鄭永唐等人，免疫學(xué)雜志，1992年，第8巻，第4期，第266-269頁(yè))測(cè)定細(xì)胞存活率。用型號(hào)為DG-3022的酶聯(lián)免疫儀(華東電子管廠制造)在570納米下測(cè)定OD值，細(xì)胞存活率由下式計(jì)算細(xì)胞存活率=(轉(zhuǎn)染孔光吸收值/對(duì)照孔光吸收值)xioo%。細(xì)胞存活率的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5。對(duì)比例1本對(duì)比例說(shuō)明現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒載體對(duì)黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)的溶解能力。按照實(shí)施例1的方法，以單純皰疹病毒17+制備7種單純皰疹病毒載體，缺失基因情況如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>按照實(shí)施例2的方法，以相同病毒載體滴度的單純皰疹病毒17+轉(zhuǎn)染黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所)，在同樣的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的CNE-1細(xì)胞，并按照實(shí)施例2的方法測(cè)定CNE-1細(xì)胞的存活率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>從表5可以看出，轉(zhuǎn)染本發(fā)明單純皰疹病毒載體的CNE-1細(xì)胞的存活率大大低于轉(zhuǎn)染現(xiàn)有技術(shù)單純皰疹病毒17+載體的CNE-1細(xì)胞的存活率，而CNE-1細(xì)胞為典型的黃色人種多發(fā)人鼻咽癌的腫瘤細(xì)胞，說(shuō)明本發(fā)明的病毒載體，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒17+載體而言，特異性對(duì)黃色人種的腫瘤細(xì)胞的溶解能力更強(qiáng)。實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的單純皰疹病毒載體對(duì)一般腫瘤細(xì)胞的溶解能力。按照實(shí)施例2的方法，用本發(fā)明的單純皰疹病毒載體分別在兩種不同的感染復(fù)數(shù)(MOI=0.1和MOI=l)下轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和人肺腺癌細(xì)胞A549(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第二研究所)，并測(cè)試轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞的存活數(shù)，結(jié)果如表6所示。對(duì)比例2本對(duì)比例說(shuō)明現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒17+載體對(duì)一般腫瘤細(xì)胞的溶解能力。按照實(shí)施例2的方法，用單純皰疹病毒17+載體分別在兩種不同的感染復(fù)數(shù)(MOI=0.1和MOI=l)下轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，并測(cè)試轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞的存活數(shù)，結(jié)果如表6和表7所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>從表6和表7可以看出，無(wú)論在低感染復(fù)數(shù)(MOI=0.1)還是高感染復(fù)數(shù)(MOI=l)的情況下，轉(zhuǎn)染本發(fā)明單純皰疹病毒載體24小時(shí)的三種腫瘤細(xì)胞系的存活率都大大低于轉(zhuǎn)染現(xiàn)有技術(shù)單純皰疹病毒17+載體的三種腫瘤細(xì)胞系的存活率，說(shuō)明本發(fā)明的病毒載體對(duì)一般腫瘤細(xì)胞的溶解能力也好于現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒17+載體。此外，圖2展示了正常人乳腺癌細(xì)胞系MCF—7培養(yǎng)96小時(shí)的生長(zhǎng)情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)，從圖2可以看出，正常人乳腺癌細(xì)胞系MCF—7培養(yǎng)96小時(shí)后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，密集生長(zhǎng)排列；圖3展示了培養(yǎng)MCF—7細(xì)胞48小時(shí)后，按病毒活性顆粒/細(xì)胞數(shù)的比值(MOI)為0.1轉(zhuǎn)染本發(fā)明病毒載體后再培養(yǎng)48小時(shí)的生長(zhǎng)情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)，從圖3可以看出，多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞數(shù)目大大減少。從兩張照片對(duì)比可以看出，本發(fā)明的單純皰疹病毒載體對(duì)一般腫瘤細(xì)胞都具有更強(qiáng)的溶解能力。實(shí)施例4本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明提供的重組病毒及其制備方法。按照CN1283803C記載的方法，向?qū)嵤├?中得到的病毒載體7中，分別在編碼感染細(xì)胞多肽34.5(infectedcellpolypeptides,ICP34.5)的基因位置上插入由hCMV的IE啟動(dòng)子引導(dǎo)的人類GM-CSF基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因位置上插入由MMLV啟動(dòng)子引導(dǎo)的編碼綠色熒光蛋白的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因的基因位置上插入由RSV啟動(dòng)子引導(dǎo)的編碼紅色熒光蛋白的基因。所述基因的序列可以在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查到，用得到的重組病毒按照實(shí)施例2的方法，以感染復(fù)數(shù)為0.1轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)可以在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察到如圖6所示的，表達(dá)綠色熒光蛋白的人鼻咽癌細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，用型號(hào)為DG-3022的酶聯(lián)免疫儀(華東電子管廠制造)在450納米下，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(BDOptEIAsethumanGM-CSF，CatalogNo:555126、綠色熒光蛋白試劑盒和紅色熒光蛋白試劑盒)，分別測(cè)定人GM-CSF、綠色熒光蛋白以及紅色熒光蛋白在人鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果如表8所示。對(duì)比例3按照實(shí)施例4所述的方法，不同的是用對(duì)比例2得到單純皰疹病毒17+載體G制備重組病毒，收集轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，用型號(hào)為DG-3022的酶聯(lián)免疫儀(華東電子管廠制造)在450納米下，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(BDOptEIAsethumanGM-CSF，CatalogNo:555126、綠色熒光蛋白試劑盒和紅色熒光蛋白試劑盒)，分別測(cè)定人GM-CSF、綠色熒光蛋白(GFP)以及紅色熒光蛋白(RFP)在人鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>從表8可以看出，轉(zhuǎn)染本發(fā)明重組單純皰疹病毒24小時(shí)的黃色人種腫瘤細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量，都大大高于轉(zhuǎn)染現(xiàn)有技術(shù)重組單純皰疹病毒17十的表達(dá)量，說(shuō)明本發(fā)明的重組病毒感染黃色人種腫瘤細(xì)胞的能力更強(qiáng)。實(shí)施例5本實(shí)施例說(shuō)明含有本發(fā)明病毒載體的藥物組合物及其制備方法。(1)注射液的配制將按照表9所示的劑量分別配制一組磷酸鹽緩沖液，121"C下滅菌60分鐘。在無(wú)菌條件下，以0.45微米的微孔濾膜過(guò)濾實(shí)施例2的步驟(1)已知滴度的單純皰疹病毒載體7原液，或者以0.45微米的微孔濾膜過(guò)濾按照實(shí)施例4所述的方法在單純皰疹病毒載體7編碼ICP34.5的基因位置上插入由hCMV的IE啟動(dòng)子引導(dǎo)的人類GM-CSF基因的重組細(xì)胞原液(重組細(xì)胞原液的滴度按照實(shí)施例2的方法測(cè)定)去除細(xì)胞碎片，收集濾液至無(wú)菌離心管中，8000轉(zhuǎn)/分離心1小時(shí)，棄去上清，按照表9所示的病毒滴度，將所得病毒載體或重組病毒沉淀分散在上述高溫滅菌后的磷酸緩沖液中，即得兩組(分別包括病毒載體和重組病毒)本發(fā)明注射液。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>本實(shí)施例中，陰性對(duì)照藥物為不含病毒的滅菌磷酸緩沖液；陽(yáng)性對(duì)照藥物為注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，批號(hào)050202，規(guī)格200毫克/支，上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。(2)細(xì)胞水平藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2的方法，以感染復(fù)數(shù)MOI=l的病毒注射液感染黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)。結(jié)果如表10所示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>從表10可以看出，本發(fā)明的注射液對(duì)黃色人種多發(fā)的CNE-1細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，陽(yáng)性對(duì)照藥能在24小時(shí)內(nèi)殺死腫瘤細(xì)胞，但是陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)正常細(xì)胞的毒性也很大。此外，從表IO還可以看出，重組病毒對(duì)腫瘤的殺傷能力強(qiáng)于病毒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，進(jìn)而說(shuō)明含有本發(fā)明重組病毒的藥物組合物不僅具有溶瘤作用，并且可以在被重組病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因。(3)人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，Balb/c裸鼠，4-6周齡，16-20克，雌性，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。傳代荷瘤鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)至直徑約2-3厘米時(shí)，無(wú)菌條件下取出瘤塊，按照每克腫瘤組織3-4毫升生理鹽水的比例，制成腫瘤細(xì)胞勻漿，給予每只小鼠右前肢腋部皮下接種0.2毫升；或者將瘤塊切割成1立方厘米的小瘤塊，用套管針接種到裸鼠右側(cè)腋部皮下。待各組動(dòng)物接種的腫瘤生長(zhǎng)到動(dòng)物體表能觀察到約0.6厘米X0.6厘米的腫塊時(shí)，隨機(jī)分16組(本發(fā)明配方14組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組)，每組7只開(kāi)始用步驟(1)的本發(fā)明病毒注射液以及陽(yáng)性對(duì)照藥物、陰性對(duì)照藥物腫瘤瘤體內(nèi)局部注射給藥。于第1天、第4天和第7天瘤內(nèi)注射，注射容積為100微升。本發(fā)明步驟(1)病毒載體或重組病毒的給藥劑量為2.5X107pfU/kg，陽(yáng)性對(duì)照藥為環(huán)磷酰胺，陽(yáng)性對(duì)照藥的給藥劑量為100mg/kg，陰性對(duì)照藥為與本發(fā)明病毒注射液等體積的磷酸緩沖液。最后一次給藥后，每周稱體重，測(cè)定動(dòng)物體表能觀察到的腫瘤體積，繼續(xù)觀察2周左右，腫瘤體積變化曲線見(jiàn)圖5(本發(fā)明病毒載體7+配方2)，然后頸部脫臼處死動(dòng)物，剝離取出瘤塊稱重，可得出腫瘤抑制率-10(^/。X本發(fā)明病毒注射液組或陽(yáng)性對(duì)照藥組平均瘤塊重量/陰性對(duì)照藥平均瘤塊重量，結(jié)果見(jiàn)表ll。圖4為陰性對(duì)照藥(第一行)、陽(yáng)性對(duì)照藥(第二行)、本發(fā)明病毒載體7配方2注射液(第三行)以及本發(fā)明重組病毒配方2注射液(第四行)所取出的瘤塊照片，空白位置的小鼠死亡。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>從表11和圖4、圖5可以看出，本發(fā)明病毒載體和重組病毒對(duì)人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，本發(fā)明組的抑制率范圍為28.0%-77.0%，雖然陽(yáng)性對(duì)照藥的抑制率對(duì)腫瘤的抑制作用也很明顯，但是陽(yáng)性對(duì)照藥的死亡率很高，因而本發(fā)明的病毒載體或重組病毒的注射液更安全。此外，從表11還可以看出，含有重組病毒的注射液表達(dá)了抗腫瘤的GM-CSF，因此其對(duì)腫瘤的殺傷能力強(qiáng)于含有病毒載體的注射液。SEQUENCELISTING<110>北京奧源和力生物技術(shù)有限公司<120>單純皰疹病毒載體和重組病毒及宿主細(xì)胞及其藥物組合物<130>I71990YH<160>14<170>PatentInversion3.4<210>1<211>904<212>PRT<213>單純皰疹病毒I型(HerpesSimplexVirusTypeI)<400>1MetArgGinGlyAlaProAlaArgGlyArgArgT卬Phe1510ValValTrp15AlaLeuLeuGlyLeuThrLeuGlyValLeuValAlaSerAlaAlaPro202530SerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsn354045GlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaProGlyProAlaProThr505560Gly65ProAspArgProProLysAlaProGly85Arg70AspLysAsnAsnAlaLysLysThrVal90ProLysPro75AlaAlaGlyProThrPro80HisAlaThr95LeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsn100105110PheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGlu115120125GinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGlu130135140GlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLys145150155160AlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGly165170175HisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProVal180185190ProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArg195200205SerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHis210215220ArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAla225230235240ThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnPro245250255SerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslie260265270ValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheVal275280285LeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArg290295300GluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLys305310315320GinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAla325330335ThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrVal340345350AlaT卬AspT卬ValProLysArgProSerValCysThrMetThrLys355360365TrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPhe370375380ArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThr385390395400GluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAsp405410415AlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThr420425430HislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPhe435440445<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>ThrVallieHisAlaAspAlaAsnAlaAlaMetPheAlaGlyLeuGly725730735AlaPhePheGluGlyMetGlyAspLeuGlyArgAlaValGlyLysVal740745750ValMetGlylieValGlyGlyValValSerAlaValSerGlyValSer755760765SerPheMetSerAsnProPheGlyAlaLeuAlaValGlyLeuLeuVal770775780LeuAlaGlyLeuAlaAlaAlaPhePheAlaPheArgTyrValMetArg785790795800LeuGinSerAsnProMetLysAlaLeuTyrProLeuThrThrLysGlu805810815LeuLysAsnProThrAsnProAspAlaSerGlyGluGlyGluGluGly820825830GlyAspPheAspGluAlaLysLeuAlaGluAlaArgGluMetlieArg835840845TyrMetAlaLeuValSerAlaMetGluArgThrGluHisLysAlaLys850855860LysLysGlyThrSerAlaLeuLeuSerAlaLysValThrAspMetVal865870875880MetArgLysArgArgAsnThrAsnTyrThrGinValProAsnLysAsp885890895GlyAspAlaAspGluAspAspLeu900<210>2<211>2715<212>DNA<213>單純皰疹病毒I型(He卬esSimplexVirusTypeI)<400>2atgcgccagggcgcccccgcgcgggggcgccggtggttcgtcgtatgggcgctcttgggg60ttgacgctgggggtcctggtggcgtcggcggctccgagttcccccggcacgcctggggtc120gcggccgcgacccaggcggcgaatgggggccctgccactccggcgccgcccgcccctggc180cccgccccaacgggggacccgaaaccgaggaagaacaaaaaaccgaaacccccaacgccg240ccgcgccccgccggcgacaacgcgaccgtcgccgcgggccacgccaccctgcgcgagcac300ctgcgggacatcaaggcggagaacaccgatgcaaacttttacgtgtgcccaccccccacg360ggcgccacggtggtgcagttcgagcagccgcgccgctgcccgacccggcccgagggtcag420aactacacggagggcatcgcggtggtcttcaaggagaacatcgccccgtacaagttcaag480gccaccatgtactacaaagacgtcaccgtttcgcaggtgtggttcggccaccgctactcc540cagtttatggggatctttgaggaccgcgcccccgtccccttcgaggaggtgatcgacaag600atcaacgccaagggggtctgtcggtccacggccaagtacgtgcgcaacaacctggagacc660accgcgtttcaccgggacgaccacgagaccgacatggagctgaaaccggccaacgccgcg720acccgcacgagccggggctggcacaccaccgacctcaagtacaacccctcgcgggtggag780gcgttccaccggtacgggacgacggtaaactgcatcgtcgaggaggtggacgcgcgctcg840gtgtacccgtacgacgagtttgtgctggcgactggcgactttgtgtacatgtccccgttt900tacggctaccgggaggggtcgcacaccgaacacaccagctacgccgccgaccgcttcaag960caggtcgacggcttctacgcgcgcgacctcaccaccaaggcccgggccacggcgccgacc1020acccggaacctgctcacgacccccaagttcaccgtggcctgggactgggtgccaaagcgc1080ccgtcggtctgcaccatgaccaagtggcagg郷tggacgagatgctgcgctccgagtac1140ggcggctccttccgattctcctccgacgccatatccaccaccttcaccaccaacctgacc1200gagtacccgctctcgcgcgtggacctgggggactgcatcggcaaggacgcccgcgacgcc1260atggaccgcatcttcgcccgcaggtacaacgcgacgcacatcaaggtgggccagccgcag1320tactacctggccaatgggggctttctgatcgcgtaccagccccttctcagcaacacgctc1380gcggagctgtacgtgcgggaacacctccgagagcagagccgcaagcccccaaaccccacg1440cccccgccgcccggggccagcgccaacgcgtccgtggagcgcatcaagaccacctcctcc1500atcgagttcgcccggctgcagtttacgtacaaccacatacagcgccatgtcaacgatatg1560ttgggccgcgttgccatcgcgtggtgcgagctgcagaatcacgagctgaccctgtggaac1620gaggcccgcaagctgaaccccaacgccatcgcctcggccaccgtgggccggcgggtgagc1680gcgcggatgctcggcgacgtgatggccgtctccacgtgcgtgccggtcgccgcggacaac1740gtgatcgtccaaaactcgatgcgcatcagctcgcggcccggggcctgctacagccgcccc1800ctggtcagctttcggtacgaagaccagggcccgttggtcgaggggcagctgggggagaac1860aacgagctgcggctgacgcgcgatgcgatcgagccgtgcaccgtgggacaccggcgctac1920ttcaccttcggtgggggctacgtgtacttcgaggagtacgcgtactcccaccagctgagc1980cgcgccgacatcaccaccgtcagcaccttcatcgacctcaacatcaccatgctggaggat2040cacgagtttgtccccctggaggtgtacacccgccacgagatcaaggacagcggcctactg2100gactacacggaggtccagcgccgcaaccagctgcacgacctgcgcttcgccgacatcgac2160acggtcatccacgccgacgccaacgccgccatgttcgcgggcctgggcgcgttcttcgag2220gggatgggcgacctggggcgcgcggtcggcaaggtggtgatgggcatcgtgggcggcgtg2280gtatcggccgtgtcgggcgtgtcctccttcatgtccaacccctttggggcgctggccgtg2340ggtctgttggtcctggccggcctggcggcggccttcttcgcctUcgctacgtcatgcgg2400ctgcagagcaaccccatgaaggccctgtacccgctaaccaccaaggagctcaagaacccc2460accaacccggacgcgtccggggagggcgaggagggcggcgactttgacgaggccaagcta2520gccgaggccagggagatgatacggtacatggccctggtgtcggccatggagcgcacggaa2580cacaaggccaagaagaagggcacgagcgcgctgctcagcgccaaggtcaccgacatggtc2640atgcgcaagcgccgcaacaccaactacacccaagttcccaacaaagacggtgacgccgac2700gaggacgacctgtga2715<210>3<211>423<212>PRT<213>單純皰疹病毒I型(He卬esSimplexVirusTypeI)<400>3LysProThrSerThrProLysSerProProThrSerThrProAspPro151015LysProLysAsnAsnThrThrProAlaLysSerGlyArgProThrLys202530ProProGlyProValTrpCysAspArgArgAspProLeuAlaArgTyr354045GlySerArgValGinlieArgCysArgPheArgAsnSerThrArgMet505560GluPheArgLeuGinlieTrpArgTyrSerMetGlyProSerProPro65707580lieAlaProAlaProAspLeuGluGluValLeuThrAsnlieThrAla859095ProProGlyGlyLeuLeuValTyrAspSerAlaProAsnLeuThrA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AspGluLeuCysSerArg405410415ArgArgLeuAaAsplieLysAsplieAlaSerPheValPheVallie420425430LeuAlaArgLeuAlaAsnArgValGluArgGlyValAlaGlulieAsp435440445TyrAlaThrLeuGlyValGlyValGlyGluLysMetHisPheTyrLeu450455460ProGlyAlaCysMetAlaGlyLeulieGlulieLeuAspThrHisArg465470475480GinGluCysSerSerArgValCysGluLeuThrAlaSerHislieVal485490495AlaProProTyrValHisGlyLysTyrPheTyrCysAsnSerLeuPhe500505510<210>14<211>1539<212>腿<213>單純皰疹病毒I型(HerpesSimplexVirusTypeI)<400>14atggcgactgacattgatatgctaattgac'ctcggcctggacctctccgacagcgatctg60gacgaggacccccccg郷cggcgg卿gccgccgcgacgacctggcatcggacagcagc120ggggagtgttcctcgtcggacgaggacatggaagacccccacgg柳ggacggaccggag180ccgatactcgacgccgctcgcccggcggtccgcccgtctcgtccagaagaccccggcgta240CCC3gC3CCCagacgcctcgtccgacggagcggcagggccccaacg3tcctC33CC3gCg300CCCC3C3gtgtgtggtcgcgcctcggggcccggcgaccgtcttgctcccccgagcagcac360gggggcaaggtggcccgcctCC33CCCCC3CCg3CC333gcccagcctgcccgcggcgga420cgccgtgggcgtcgcaggggtcggggtcgcggtggtcccggggccgccgatggtttgtcg480g3CCCCCgCCggcgtgccccC柳3CC33tCgC33CCCggggggaccccgCC3CCggggC540gggtggacggacggccccggCgCCCCCC3tggcgaggcgtggcgcggaagtgagcagccc600g3CCC3CCCgg鄉(xiāng)cccgcggacacggggcgtgcgccaagC3CCCCCCCCgctaatgacg660ctggcgattgcccccccgccCgCgg3CCCCcgcgccccggCCCCgg3gCgaaaggcgccc720gccgccgacaCC3tCg3CgCC3CC3CgCggttggtcctgcgctccatctccgagcgcgcg780gcggtcgaccgcatcagcgagagctttggccgcagcgcacaggtcatgcacgaccccttt840ggggggcagccgtttcccgccgcgaatagcccctgggccccggtgctggcgggccaagga900gggccctttgacgccgagaccagacgggtctcctgggaaaccttggtcgcCC3CggCCCg960agcctctatcgcacttttgccggcaatcctcgggccgcatcgaccgccaaggccatgcgcgactgcgtgctgcgccaagaaaatttcatcgcgtggtgcaagatgtgcatccaccacaacgggacggccgcggctgtgctggataacctctacctgaaggcgcgaggcctgtgcggcctggacattaaggacattgcatccttcgtgtttgagcgtggcgtcgcggagatcgactacgcgcatUctacctccccggggcctgcatggcgcaggagtgttcgagtcgtgtctgcgagttggtgcacggcaaatatttttaUgcaactccgaggcgctggcctccgccgacgagacgctgctgccgctgcgcccccaggaccccattatcgccacgcgcctgcggccctttctccagtgcgacgaactgtgttcgcggcggcgtctggcggtcattctggccaggctcgccaaccgcgtcacccttggtgtcggggtcggag柳agatgggcctgatcgaaatcctagacacgcaccgcacggccagtcacatcgtcgcccccccgtacctgtUtag00000000984062840301223345511111111權(quán)利要求1、一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，所述病毒載體具有囊膜蛋白，其特征在于，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)該病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQIDNO.1所示的氨基酸序列、SEQIDNO.3所示的氨基酸序列、SEQIDNO.5所示的氨基酸序列、SEQIDNO.7所示的氨基酸序列、SEQIDNO.9所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列中的一種或幾種。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒載體，其中，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:NO.9所示的氨基酸序列中的一種或幾種。3、一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因，所述病毒載體具有編碼囊膜蛋白的基因，其特征在于，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)該病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO,7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對(duì)所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:NO,5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列中的一種或幾種。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體，其中，所述氨基酸序列選自SEQID-NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:NO.9所示的氨基酸序列中的一種或幾種。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體，其中，所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.10所示的核苷酸序列，以及對(duì)所述SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:N0.6、SEQID:NO.8或SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒載體，其中，所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進(jìn)病毒載體侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列中的一種或幾種。7、一種重組病毒，所述重組病毒包括病毒載體和目的基因，其特征在于，所述病毒載體為權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的病毒載體。8、一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述病毒為權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的病毒載體和/或權(quán)利要求7所述的重組病毒。9、一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的病毒載體和/或權(quán)利要求7所述的重組病毒。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的病毒載體和/或權(quán)利要求7所述的重組病毒，每毫升所述注射液中含有102-101()空斑形成數(shù)的所述病毒載體和/或重組病毒。11、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體為pH值為4.0-9.0的磷酸緩沖液。12、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以所述注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01-30重量％，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。全文摘要本發(fā)明提供了一種分離自黃色人種、缺失編碼感染細(xì)胞多肽34.5的基因、編碼感染細(xì)胞多肽6的基因和編碼感染細(xì)胞多肽47的基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因的單純皰疹病毒載體，該病毒載體對(duì)于黃色人種宿主細(xì)胞的特異性侵染率高，復(fù)制速度快，毒性低，因此可以直接用于侵染并溶解黃色人種的腫瘤細(xì)胞，也可以攜帶基因藥物至黃色人種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因治療。文檔編號(hào)C12N15/33GK101376892SQ200710120848公開(kāi)日2009年3月4日申請(qǐng)日期2007年8月28日優(yōu)先權(quán)日2007年8月28日發(fā)明者琦李,李巍東,李秉珅,超田申請(qǐng)人:李小鵬