專利名稱：一種快速細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供一種快速細(xì)菌細(xì)胞裂解試 劑配方。
背景技術(shù)：
細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)與食品的腐敗變質(zhì)、食品被污染的程度有密切關(guān)系，是 對(duì)人體健康可能造成危害的一種信號(hào)，國(guó)內(nèi)外己把這個(gè)指標(biāo)作為衡量食品 被微生物污染程度的重要指標(biāo)。細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)，作為食品衛(wèi)生安全的必檢 項(xiàng)目，則必須進(jìn)行抽查取樣送交至技術(shù)中心檢測(cè)。當(dāng)前，細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)，
國(guó)內(nèi)外普遍采用的是平板計(jì)數(shù)法，這種方法需要對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)24 48 小時(shí)，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需專業(yè)人士操作，不易現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)、極大影響工作效率。所以開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的用于食品衛(wèi) 生現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的儀器，在食品衛(wèi)生安全控制中將具有重大的需求及現(xiàn)實(shí) 意義。
三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法是現(xiàn)階段國(guó)外研究和應(yīng)用較多的一種 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法，因該法無(wú)需進(jìn)行微生物培養(yǎng)，且操作簡(jiǎn)單，測(cè)試速度 快，所以目前此方法已受到廣泛關(guān)注。三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法的
理論基礎(chǔ)是基于待測(cè)食品或器具一定表面積上所含的細(xì)菌個(gè)數(shù)是一定的， 且每種細(xì)菌個(gè)體所含的三磷酸腺苷(ATP)量在常態(tài)下都處在同一個(gè)數(shù)量 級(jí)上。其檢測(cè)基本原理是首先利用細(xì)菌細(xì)胞裂解劑將細(xì)菌細(xì)胞破碎，釋放
出胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)，在熒光素酶的催化作用下，三磷酸腺苷(ATP) 與熒光素反應(yīng)釋放熒光，熒光強(qiáng)度與三磷酸腺苷(ATP)量成比例，而三 磷酸腺苷(ATP)量與樣品中細(xì)菌總數(shù)成比例，因此根據(jù)所檢測(cè)到的生物 熒光量，依據(jù)熒光強(qiáng)度與細(xì)菌總數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即可得知樣品中細(xì)菌總數(shù)。 在三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法檢測(cè)中，其關(guān)鍵步驟是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞 的裂解，細(xì)菌細(xì)胞裂解劑裂解釋放三磷酸腺苷(ATP)的效率直接決定生 物熒光檢測(cè)法的檢測(cè)精度和檢測(cè)限。進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞裂解時(shí)，有三個(gè)因素需 要考慮，作為細(xì)菌細(xì)胞裂解劑，除了能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞膜釋放三磷酸腺苷 (ATP);同時(shí)應(yīng)能夠抑止胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)降解酶，三磷酸腺苷(ATP) 降解酶可降解三磷酸腺苷(ATP)從而降低熒光強(qiáng)度；最后所引入的細(xì)菌 細(xì)胞裂解劑不能夠?qū)ψ罱K的三磷酸腺苷(ATP)生物熒光反應(yīng)產(chǎn)生影響。 目前使用的細(xì)菌細(xì)胞裂解法有乙醇法，丁醇法、表面活性劑法、超聲波法 和電場(chǎng)法等。在乙醇法和丁醇法中，乙醇和丁醇試劑較為溫和，裂解效率 較低，裂解時(shí)間30min，且乙醇和丁醇的引入可對(duì)后續(xù)引入的熒光試劑產(chǎn) 生影響，致使本法應(yīng)用范圍受到限制；利用表面活性劑(如十二垸基磺酸 鈉、曲拉通等)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解，三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率較高， 但表面活性劑不能抑止三磷酸腺苷(ATP)降解酶，同時(shí)長(zhǎng)碳鏈化合物的 引入可對(duì)熒光試劑產(chǎn)生較為明顯的影響，利用該方法進(jìn)行生物熒光檢測(cè)時(shí) 最低檢測(cè)限較高，通常需要104 105 CFU/ml濃度的細(xì)菌總數(shù)，滿足不了
實(shí)際檢測(cè)要求。超聲波法和電場(chǎng)法是近期出現(xiàn)的利用物理方法進(jìn)行細(xì)菌細(xì) 胞裂解的方法，但利用這些方法通常需要配備專用儀器，使其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè) 應(yīng)用受到限制。因此開發(fā)一種裂解速度快、三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率高、 同時(shí)抑止三磷酸腺苷(ATP)降解酶、操作方便的細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑具有 重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述裂解方法的不足，給三磷酸腺苷(ATP) 生物熒光檢測(cè)法提供一種裂解速度快、三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率高、且 同時(shí)可抑止三磷酸腺苷(ATP)降解酶、操作方便，易于配制且成本較低 的細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，從而大大提高三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法檢測(cè) 速度，建立一種方便快捷的細(xì)菌總數(shù)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，可解決大量的食品衛(wèi) 生現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工作的難題。
本發(fā)明的又一目的是提供一種試劑，該試劑可用于三磷酸腺苷(ATP) 生物熒光法中對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行快速裂解；同時(shí)可抑止細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺 苷(ATP)降解酶；三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率高；可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)， 滿足食品衛(wèi)生檢測(cè)的需要。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種快速細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑配方，用于三磷酸腺苷(ATP)生物熒光 法中對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行快速裂解；其試劑配方包括至少一種酸性細(xì)菌細(xì)胞裂
解試劑和至少一種堿性中和試劑，并添加至少一種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑和至少一種
無(wú)機(jī)鹽溶劑；
酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，是從氯酸、高氯酸、硫酸、硝酸、三氯乙 酸、焦磷酸、氫氟酸、焦硫酸、鹽酸、乙酸中至少選取一種組成；
堿性中和試劑，是從碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨 水、氫氧化鈣、氫氧化鎂中至少選取一種組成；
有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑，是從蛋白粉、L-2， 6-二氨基己酸鹽酸鹽、N-羥甲基蛋 氨酸鈣、葡萄糖酸內(nèi)酯、a-氨基-p-羥基丁酸、D-葡萄糖酸鈉、鄰苯甲 酰磺酰胺鈉、氯化-J3-羥乙基-N,N,N-三甲基銨、葡萄糖、乙酸三甲銨內(nèi) 鹽、葡萄糖酸鈣、果糖中至少選取一種組成；
無(wú)機(jī)鹽溶劑，是從碳酸鋇、碘化鈉、二氯氧化鋯、氟化鉀、六水合 溴化鎂、無(wú)水鉀鎂礬、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸鉀、硝酸鉀、硝酸 鈉中至少選取一種組成。
所述的試劑配方，其所述酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑濃度在0.01 1.0 mol/L之間選取。
所述的試劑配方，其所述酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，其細(xì)菌細(xì)胞裂解 時(shí)間在1 10 min之間選取。
所述的試劑配方，其所述堿性中和試劑濃度在0.01 1.0 mol/L之 間選??；其pH值在6. 5 8. 5之間。
所述的試劑配方，其所述堿性中和試劑，其中和時(shí)間在1 60 s之 間選取。
所述的試劑配方，其所述有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑濃度在0. 01 0. 50 mol/L之間選取。
所述的試劑配方，其所述無(wú)機(jī)鹽溶劑濃度在0. 01 0. 50 mol/L之間
選取。
本發(fā)明的試劑配方，用于三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法中對(duì)細(xì)菌細(xì) 胞進(jìn)行快速裂解，同時(shí)可抑止細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)降解酶；三
磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率高；可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，滿足食品衛(wèi)生檢測(cè)的
需要。


圖l是利用本細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑配方快速裂解大腸桿菌的測(cè)試對(duì)比示
意圖2是利用本細(xì)菌細(xì)胞裂解劑進(jìn)行細(xì)菌梯度稀釋樣品的裂解檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提出了一種快速細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑配方，該試劑至少包括以下
四種試劑
至少一種酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，所述酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑從氯 酸、高氯酸、硫酸、硝酸、三氯乙酸、焦磷酸、氫氟酸、焦硫酸、鹽酸、
乙酸中選取，濃度在0.01 1.0 mol/L之間選取，優(yōu)選濃度0.03 mol/L， 裂解時(shí)間在1 10 min之間選取，優(yōu)選裂解時(shí)間5 min。
該試劑與細(xì)菌細(xì)胞作用，擴(kuò)大細(xì)菌細(xì)胞壁的空隙度，增加細(xì)菌細(xì)胞膜 的通透性，從而釋放出胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)。
至少一種堿性中和劑，所述堿性中和劑從碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化
鈉、氫氧化鉀、氨水、氫氧化鈣、氫氧化鎂中選取，濃度在0.01 1.0mol/L 之間取定，優(yōu)選濃度O. 03 mol/L，中和時(shí)間在1 60 s之間選取，優(yōu)選中 和時(shí)間10 s。
該試劑的引入可對(duì)細(xì)菌細(xì)胞裂解液進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)試劑pH值在6. 5 8. 5之間，優(yōu)選pH值7.8。
至少一種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑，所述有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑從蛋白粉、L-2， 6-二氨基己 酸鹽酸鹽、N-羥甲基蛋氨酸鈣、葡萄糖酸內(nèi)酯、cx-氨基-e-羥基丁酸、 D-葡萄糖酸鈉、鄰苯甲?；酋０封c、氯化-6-羥乙基-N，N，N-三甲基銨、 葡萄糖、乙酸三甲銨內(nèi)鹽、葡萄糖酸鈣、果糖中選取，濃度在0.01 0.50 mol/L之間選取，優(yōu)選濃度O. 20 mol/L。
所選用的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑可使檢測(cè)樣品中細(xì)菌能夠保持正常的新陳代謝， 從而使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)水平維持一個(gè)較高的水平，增加三 磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率。
至少一種無(wú)機(jī)鹽溶劑，所述無(wú)機(jī)鹽溶劑從碳酸鋇、碘化鈉、二氯氧 化鋯、氟化鉀、六水合溴化鎂、無(wú)水鉀鎂礬、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、 碳酸鉀、硝酸鉀、硝酸鈉中選取，所用濃度在0.01 0.50 mol/L之間選 取，優(yōu)選濃度O. 20 mol/L。
所選用無(wú)機(jī)鹽溶劑具有調(diào)節(jié)滲透壓的功能，可使樣品中細(xì)菌細(xì)胞處在 一個(gè)正常的滲透壓范圍內(nèi)，增加細(xì)菌細(xì)胞的穩(wěn)定性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述
實(shí)施例l
從下列化合物所示濃度制備一種試劑
化合物 濃度
高氯酸 0. 10 mol/L
氫氧化鉀 0. 10 mol/L
葡萄糖酸鈣 0. 15 mol/L
氯化鉀 0. 15 mol/L
實(shí)施例2
從下列化合物所示濃度制備一種試劑
化合物 濃度
硫酸 0. 10 mol/L
氫氧化鉀 0. 20 mol/L
果糖 0. 25 mol/L
碘化鈉 0. 25 mol/L
實(shí)施例3
從下列化合物所示濃度制備一種試劑
化合物 濃度
三氯乙酸 0.03 mol/L
氫氧化鈉 0. 03 mol/L
葡萄糖 0. 20 mol/L
氯化鈉 0. 20 mol/L
將以上試劑按所示濃度進(jìn)行混合，并調(diào)節(jié)pH在6. 5 8.5之間，從而 制備出細(xì)菌細(xì)胞裂解劑。利用上述試劑組合的一種，對(duì)含有一定量大腸桿 菌樣品(lX107CFU/mL)進(jìn)行有無(wú)細(xì)菌裂解劑對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中首先取細(xì) 菌懸浮液30 nL加入檢測(cè)池中，弓l入30 (iL配好的細(xì)菌細(xì)胞裂解劑混合均 勻，裂解時(shí)間5min，將檢測(cè)池移入熒光檢測(cè)儀中(如日本F4500，自主 研發(fā)細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)儀TX2007-1)，啟動(dòng)檢測(cè)，20 s后利用注射裝置注入熒 光反應(yīng)劑100i^L，記錄熒光信號(hào)，對(duì)比測(cè)試結(jié)果如圖l所示。由圖l可 以看出，相對(duì)于無(wú)細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑引入的樣品，利用本細(xì)菌細(xì)胞裂解試 劑可對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行快速裂解，5min內(nèi)即可得到較高的三磷酸腺苷(ATP) 產(chǎn)出率。圖2是利用本細(xì)菌細(xì)胞裂解劑進(jìn)行細(xì)菌梯度稀釋樣品的裂解檢測(cè) 結(jié)果圖，由圖2可以看出，在細(xì)菌總數(shù)101 107 CFU/mL的范圍內(nèi)，本細(xì) 菌細(xì)胞裂解劑均由較高的細(xì)菌裂解能力，三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率高， 發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)菌總數(shù)在對(duì)數(shù)情況下成線性關(guān)系，可檢測(cè)到10 CFU/mL濃度 的細(xì)菌樣品，可以滿足微生物三磷酸腺苷(ATP)生物熒光檢測(cè)法中對(duì)細(xì) 菌細(xì)胞快速裂解的需要。
以上實(shí)施例只是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。在上述說(shuō) 明的基礎(chǔ)上，可以對(duì)本發(fā)明作許多改進(jìn)和改變。在所附權(quán)利要求書的范圍 內(nèi)，本發(fā)明可以有不同于上述的其它實(shí)現(xiàn)方式，選用其它關(guān)聯(lián)試劑、改變 試劑濃度等方法均在本發(fā)明專利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種快速細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑配方，用于三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法中對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行快速裂解；其特征在于，該試劑配方包括至少一種酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑和至少一種堿性中和試劑，并添加至少一種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑和至少一種無(wú)機(jī)鹽溶劑；酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，是從氯酸、高氯酸、硫酸、硝酸、三氯乙酸、焦磷酸、氫氟酸、焦硫酸、鹽酸、乙酸中至少選取一種組成；堿性中和試劑，是從碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、氫氧化鈣、氫氧化鎂中至少選取一種組成；有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑，是從蛋白粉、L-2，6-二氨基己酸鹽酸鹽、N-羥甲基蛋氨酸鈣、葡萄糖酸內(nèi)酯、α-氨基-β-羥基丁酸、D-葡萄糖酸鈉、鄰苯甲?；酋０封c、氯化-β-羥乙基-N，N，N-三甲基銨、葡萄糖、乙酸三甲銨內(nèi)鹽、葡萄糖酸鈣、果糖中至少選取一種組成；無(wú)機(jī)鹽溶劑，是從碳酸鋇、碘化鈉、二氯氧化鋯、氟化鉀、六水合溴化鎂、無(wú)水鉀鎂礬、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸鉀、硝酸鉀、硝酸鈉中至少選取一種組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑配方，其特征在于，所述酸性細(xì)菌細(xì)胞 裂解試劑濃度在0. 01 1. 0 mol/L之間選取。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑配方，其特征在于，所述酸性細(xì)菌細(xì)胞 裂解試劑，其細(xì)菌細(xì)胞裂解時(shí)間在1 10 min之間選取。
4. 如權(quán)利要求l所述的試劑配方，其特征在于，所述堿性中和試劑 濃度在O. 01 1.0 mol/L之間選??；其pH值在6. 5 8. 5之間。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑配方，其特征在于，所述堿性中和試劑， 其中和時(shí)間在1 60 s之間選取。
6. 如權(quán)利要求l所述的試劑配方，其特征在于，所述有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑濃 度在0. 01 0. 50 mol/L之間選取。
7. 如權(quán)利要求l所述的試劑配方，其特征在于，所述無(wú)機(jī)鹽溶劑濃 度在0. 01 0. 50 mol/L之間選取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑配方，涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，該試劑配方包括至少一種酸性細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑和至少一種堿性中和試劑，并添加至少一種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)劑和至少一種無(wú)機(jī)鹽溶劑。該試劑具有細(xì)菌細(xì)胞裂解速度快、三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)出率高、同時(shí)可抑止細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)降解酶，操作方便，易于配制，且成本較低等優(yōu)點(diǎn)，很適合在微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域里對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行快速裂解用。
文檔編號(hào)C12N1/06GK101368157SQ20071012028
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2007年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日
發(fā)明者何保山, 周愛玉, 岳偉偉, 羅金平, 蔡新霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所