專利名稱：：培育微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物的方法及專用轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及培育微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物的方法及專用轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段。技術(shù)背景植物細(xì)胞分裂素(Cytokinins)在植物的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。它能促進(jìn)細(xì)胞分裂;莖的分化；促進(jìn)光合作用；加強(qiáng)植物營養(yǎng)代謝；增強(qiáng)植物抗衰老能力和對環(huán)境的抵抗力。例如，當(dāng)植物受高溫脅迫時，植物細(xì)胞分裂素能使植物迅速產(chǎn)生自身調(diào)控，使植物恢復(fù)正常生長狀態(tài)。植物細(xì)胞分裂素還能迅速傳送到感病部位以增加植物的抵抗力。植物細(xì)胞分裂素還具有抗蟲和促進(jìn)傷口愈合的功能。植物細(xì)胞分裂素對植物體內(nèi)能量的吸收和儲藏代謝有顯著的促進(jìn)作用，有利于提高農(nóng)作物產(chǎn)量(Mok等Cytokinins:Chemistryactivityandfunction.BocaRaton,FL:CRCpress(1994);Dewitte等Dynamicsofcytokininsinapicalshootmeristemsofaday-neutraltobaccoduringfloraltransitionandflowerformation.PlantPhysiol.119，111-121，1999;Kerstetter等Shootmeristemformationinvegetativedevelopment,PlantCell9，1001-1010.1997)。植物細(xì)胞分裂素Cytokinins同所有激素一樣，屬于微量調(diào)節(jié)，故此，生物調(diào)節(jié)反應(yīng)必須在細(xì)胞體內(nèi)允許的植物激素濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。調(diào)節(jié)反應(yīng)的速度和強(qiáng)度在細(xì)胞允許的生理濃度范圍內(nèi)，激素含量越高，作用越大。農(nóng)桿菌中細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶基因—異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(&0轉(zhuǎn)入植物，已經(jīng)證明在植物體內(nèi)能合成植物激素Cytokinins(SmigockiAC等Cytokinin-to-auxinratiosandmorphologyofshootsandtissuestransformedbyachimericisopentyltransferasegene-PlantPhysiol91:808-811，1989;vanderGraaffEE等Altereddevelopmentofiira/^'c/c!AS7'51^^aJiaoacarryingthe4§^o/scfe_rii//fftUffle/3Cie/51genepartiallyduetoethyleneeffects.PlantGrowRegul34:305-315，2001)。同時也證明Cytokinins在植物體內(nèi)大量增加，導(dǎo)致植物生長嚴(yán)重不正常，甚至死亡(GengS等Effectsof_z'/^geneexpressiononthephysiologicalandchemicalcharacteristicsofylrfe肌'57'as朋朋L..PlantSci160:691-698，2001)，古戈此，Cytokinins的應(yīng)用必須控制在植物正常生長的有效范圍內(nèi)。用強(qiáng)啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)ipf基因，Cytokinins過量產(chǎn)生，嚴(yán)重影響植物的生長，所以研究i/^基因弱表達(dá)的方式是運(yùn)用植物細(xì)胞分裂素對植物生長發(fā)育產(chǎn)生積極作用的有效途徑?；蚴巧矬w染色體上的一段DNA序列?；虻谋磉_(dá)，表達(dá)的模式，時空的調(diào)控，量的變化是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，它的表達(dá)受啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。包括.-基因表達(dá)在染色體結(jié)構(gòu)水平上的調(diào)控；轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；翻譯及翻譯后加工的調(diào)控。在同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的雙基因融合表達(dá)有兩種方式，即轉(zhuǎn)錄融合(transcriptionalfusion)禾口番羽i畢融合(translationalfusion)。轉(zhuǎn)錄融合是指融合的雙基因各自擁有一個完整的閱讀框架，各自保留其翻譯的啟始密碼子和終止密碼子，雙基因之間以短核甘酸片段連接，融合的雙基因在轉(zhuǎn)錄過程中被轉(zhuǎn)錄成一條mRNA分子，但raRNA分子被核糖體翻譯成兩種獨立的蛋白質(zhì)；而翻譯融合是指融合的雙基因的第一基因去除終止密碼子，第二基因去除啟始密碼子，融合的雙基因在轉(zhuǎn)錄過程中被轉(zhuǎn)錄成一條mRNA分子，但mRNA被核糖體翻譯成一個包括兩個基因的蛋白質(zhì)(RogersSG等EvidenceforribosomescanningduringtranslationinitiationofmRNAsintransformedplantcells.PlantMol.Biol.Rep.3:111-116，1985;PeabodyDS等EffectofupstreamreadingframesontranslatedefficiencyinSimianVirus40recombinants.Mol.CellBio.6:2704—2711，1986)。根據(jù)Kozak核糖體轉(zhuǎn)錄翻譯原則，受控于同一啟動子的轉(zhuǎn)錄融合基因，由于核糖體在翻譯的過程中，受到第一基因終止密碼子和雙基因之間短核甘酸片段的影響，有一些核糖體不能跨越這兩種障礙，啟動子將就近優(yōu)先啟動，既相對獨立的雙基因如果受控于同一啟動子，距離啟動子近的基因的表達(dá)量將大大的高于距離啟動子遠(yuǎn)的基因的表達(dá)量(KozakM，HowdoeucaryoticribosomeselectinitiationregioninmessengerRNA.Cell15:1109-1123，1986;VanDuijnLP等SecondarystructureandexpressioninvivoandinvitroofmessengerRNAintowhichupstreamAUGcodonhavebeeninserted.Eur.J.Biochem.172:59-66，1988)。圖i表示雙基因轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)核糖體的翻譯過程。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用^f基因轉(zhuǎn)錄融合其他功能基因在轉(zhuǎn)基因植物中微量增加植物細(xì)胞分裂素，對植物生長發(fā)育產(chǎn)生積極作用的方法及其^t基因轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，含有i;^基因轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段的表達(dá)盒、重組植物表達(dá)載體和細(xì)胞系。本發(fā)明所提供的可微量增加植物中植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，其自5'—3'方向的排列順序依次為除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(&t)外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG組合的脫氧核糖核苷酸片段和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因。所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列如序列表中的序列1所示，由240個氨基酸殘基組成。所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因是具有完整閱讀框架的基因，來源于農(nóng)桿菌。它的核苷酸序列具體可為自GenBankAccessionNumberAF242881的5'末端第7864-8586位脫氧核糖核苷酸。所述除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因外的功能基因是任何具有功能的基因。所述雙基因中間的插入片段由排列中不具有ATG組合的四種脫氧核糖核苷酸組成，具體長度可為2-60bp。含有任何功能基因與^^基因轉(zhuǎn)錄融合雙基因的表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述表達(dá)盒自5'—3'方向的排列順序依次為組成型強(qiáng)啟動子、除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因外的任何功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG組合的四種脫氧核糖核苷酸序列、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因和多聚A尾。其中，所述啟動子具體可為組成型啟動子，可來源于微生物或植物，如CaMV35S啟動子(序列表中的序列2)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄融合雙基因由于同受一個啟動子和polyA的控制，是一個完整的轉(zhuǎn)錄單位。在轉(zhuǎn)錄過程中被轉(zhuǎn)錄成一條包括兩個基因的mRNA。該轉(zhuǎn)錄融合雙基因mRNA被翻譯為獨立的兩個蛋白質(zhì)。第一個功能基因由于距離啟動子近，其mRNA受到強(qiáng)啟動子作用，過量表達(dá)，合成的蛋白質(zhì)含量高；而第二個基因，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因由于受到其前面第一個基因的終止子和雙基因之間插入的核苷酸堿基影響了核糖體對它的翻譯，合成的蛋白質(zhì)含量低。含有上述任一種轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，或上述任一種表達(dá)盒的任何重組植物表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述任一種轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，或上述任一種表達(dá)盒，或上述任一種重組植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的培育微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述任一種轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，或上述任一種表達(dá)盒，或上述任一種重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，得到微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的方法適合于單子葉植物和雙子葉植物。實驗證明，本發(fā)明方法獲得的微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為生長快，側(cè)枝多，葉綠素含量高，延期衰老。本發(fā)明將植物細(xì)胞分裂素合成酶關(guān)鍵酶基因i;^與其他基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄融合，并將^^基因置于轉(zhuǎn)錄融合雙基因的第二位置，兩基因之間插入一段核苷酸序列。由于ipt基因的翻譯受到第一基因和兩基因之間插入核苷酸序列的影響，將大大降低它的表達(dá)，使植物細(xì)胞分裂素(Cytokinins)在轉(zhuǎn)基因植物中微量增加，使其對植物生長發(fā)育產(chǎn)生積極作用轉(zhuǎn)入該轉(zhuǎn)錄融合雙基因的轉(zhuǎn)基因植物植物生長快，側(cè)枝多，葉綠素含量高，延期衰老。另外第一基因過量表達(dá)，所以在生產(chǎn)實踐中需要大量生產(chǎn)的蛋白均可以放于此處表達(dá)。本發(fā)明可用于植物的品質(zhì)改良中，特別是可用于要轉(zhuǎn)入對植物生長有阻礙作用基因的轉(zhuǎn)基因植物的品質(zhì)改良中，如抗逆植物的品質(zhì)改良。抗逆基因?qū)χ参锏纳L有阻礙作用，將它與異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因^t轉(zhuǎn)錄融合，^^基因的弱表達(dá)，可改善轉(zhuǎn)基因植物的生長。本發(fā)明將植物細(xì)胞分裂激素合成關(guān)鍵酶-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt與其他基因以轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)的方式轉(zhuǎn)入到植物中，使植物中微量增加植物細(xì)胞分裂激素，在植物(如糧食作物，經(jīng)濟(jì)作物)的分子育種中，特別是轉(zhuǎn)基因育種中具有廣闊的應(yīng)用前圖1為雙基因轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)的核糖體翻譯示意圖。圖2為pVKH-35S-pA植物表達(dá)載體的物理圖譜，其中35S為CaMV35S啟動子(見序列2)圖3為ipf和^^組成的轉(zhuǎn)錄融合雙基因的植物表達(dá)載體的物理圖譜A:pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體。B:pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體。圖4為ipt基因轉(zhuǎn)錄檢測、GUS染色檢測和cytokinins含量測定。圖A:pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因植物GUS蛋白的生物化學(xué)染色。圖B:pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因植物植物細(xì)胞分裂素cytokinins圖C:用RT-PCR的方法檢測pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因植物中基因的mRNA水平。圖5為轉(zhuǎn)基因植物的生長發(fā)育，對照為野生型擬南芥。圖5-A:pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。1為對照；2為轉(zhuǎn)pVKH-ipt-GUS植物。圖5-B:pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥在培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成邊沿波浪型葉片。1為轉(zhuǎn)pVKH-ipt-GUS植物；2為對照。圖5-C:pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥在土壤中培養(yǎng)60天。1為對照；2禾n3為轉(zhuǎn)pVKH-ipt-GUS植物。圖5-G:pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因擬南芥在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。1和4為對照；2和3為轉(zhuǎn)pVKH-GUS-ipt植物。圖5-H，I:pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因擬南芥在土壤中培養(yǎng)30天和45天。l和4為對照；2和3為轉(zhuǎn)pVKH-GUS-ipt植物。圖6為i;^或i/^和JWW5^基因轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體的物理圖譜。圖6-A:pVKH-AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體。圖6-B:pVKH-AtGolS2植物表達(dá)載體。圖7為ipf轉(zhuǎn)錄融合^Wo75^基因的轉(zhuǎn)基因煙草的生長發(fā)育狀況。圖7-A:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草轉(zhuǎn)基因煙草在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。1為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草；2為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草；3為對照非轉(zhuǎn)基因煙草。圖7-B和圖7-D:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周；圖7-D示7-B的根的發(fā)育。l為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草;2為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草;3為對照:非轉(zhuǎn)基因煙草。圖7-C:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周，最后移栽到土壤培養(yǎng)3周。l為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草；2為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草。圖8為轉(zhuǎn)基因植物在鹽，干旱和低溫脅迫的條件下的生長情況。圖8-A:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草在正常、鹽脅迫和干旱脅迫的條件下65天。l為轉(zhuǎn)基因煙草對照在鹽脅迫的條件下；2轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草在干旱脅迫的條件下；3為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草在鹽脅迫的條件下；4為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草在非脅迫的條件下。圖8-C:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在正常、鹽脅迫和干旱脅迫的條件下65天。l為對照，非轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫的條件下；2轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在干旱脅迫的條件下；3為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在鹽脅迫的條件下；4為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在非脅迫的條件下。圖8-B:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在8度人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)65天。l為對照非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草；3為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草。圖8-D:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在8度人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)65天后轉(zhuǎn)移到正常條件下培養(yǎng)45天。l為對照非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草；3為轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草。圖9為轉(zhuǎn)基因植物葉片葉綠素含量測定結(jié)果.圖9-A:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照(CK)在低溫脅迫下的葉綠素含量。圖9-B:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照(CK)在非脅迫下的葉綠素含量。圖9-C:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照(CK)在鹽脅迫下的葉綠素含量。圖9-D:轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照(CK)在干旱脅迫下的葉綠素含量。圖10為ipt或jX與J融合表達(dá)載體的物理圖譜圖10-A:轉(zhuǎn)pVKH-AOC煙草轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體。圖10-B:轉(zhuǎn)pVKH-A0C-ipt煙草轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體。圖ll為^t轉(zhuǎn)錄融合基因的轉(zhuǎn)基因煙草在自然條件下生長發(fā)育圖11-A:轉(zhuǎn)pVKH-A0C-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AOC煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。CK表示對照非轉(zhuǎn)基因煙草，A0C-ipt表示轉(zhuǎn)pVKH-A0C-ipt煙草，A0C表示轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草。圖11-B:轉(zhuǎn)pVKH-A0C-ipt煙草和轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周。A0C-ipt表示轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草，A0C表示轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草。圖ll-C:轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草和轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周，最后移栽到土壤培養(yǎng)5周。A0C-ipt表示轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草，A0C表示轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草。右側(cè)兩盆為轉(zhuǎn)pVKH-A0C-ipt煙草。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因i;^與報告基因^^轉(zhuǎn)錄融合在擬南芥中的表達(dá)一、植物表達(dá)載體pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得農(nóng)桿菌C^ro&cteri咖t鵬e/"acj'e/sC58)中異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt(自GenBankAccessionAF242881的5'末端第7864-8586位與大腸桿菌G^c力en'c力ia6bh'W3110)中的6^報告基因(GenBankAccessionNumberAC—000091.1(1695971-1697785位)以ipt-GUS和GUS-ipt兩種排列方式轉(zhuǎn)錄融合。在ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因之間插入24個核苷酸(AGATCCGTCGAGTGGCCAAATTCC);而在GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因之間插入6個核苷酸(TCTAGA)。然后與CaMV35S組成型強(qiáng)啟動子(序列表中的序列2)連接，可置于任何植物表達(dá)載體中，本實施將它們放在帶有CaMV35S啟動子的pVKH-35S-PA(圖2)植物表達(dá)載體中，得到pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt(圖3)。具體方法如下pVKH-ipt-GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建如下&t基因是從農(nóng)桿菌中分離得到的。&f基因的分離用引物GGCGAATTCACTGCAAAAAACTTATGGAC(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶fcoWI識別位點)和TAAGAGCTCGGGCTGGCGTAACCTAAT(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶&cI識別位點)，農(nóng)桿菌DNA為模板進(jìn)行PCR，然后將PCR產(chǎn)物用fco7I和SacI酶切，連接到pBluescriprII(購自Takara公司)中間載體的和feeI位點上，得到重組載體pBS-ipt。^^基因用GUS-1:GCGGAGCTCATGTTACGTCCTGTAGAAA(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶&cI識別位點)和GUS-2:ATTGTCGACTCATTGTTTGCCTCCCTGC(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶5"aJI識別位點)為引物，大腸桿菌(fsc力en'c力W3110)DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用&cI和I酶切，連接到pBluescriprII&cI和5k/I酶切位點的中間載體上，得到pBS-GUS。j'/^基因和a^基因的轉(zhuǎn)錄融合，首先用feei和5"wi酶切pBS-GUS，得到帶&cI和5^7I粘性末端的^^基因片段；用同樣5"acI和&〗I酶切pBS-ipt，獲得帶有&cI和5"aJI粘性末端的pBS-ipt線型載體；然后將它們連接，得到ipf基因和6^5"基因的轉(zhuǎn)錄融合中間載體pBS-ipt-GUS。用^boTI酶切pBS-ipt-GUS質(zhì)粒，Klenow酶補(bǔ)平，然后用6kZI酶切，得到5'端是平末端、3'端帶有5"WI的ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段。用5朋WI酶切植物表達(dá)載體pVKH-35S-pA，Klenow酶補(bǔ)平，然后用I酶切，獲得5，端是平末端、3，端帶有&7I的pVKH35線型植物表達(dá)載體，然后與5'端是平末端、3'端帶有&〗I的ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段連接，得到pVKH-ipt-GUS植物表達(dá)載體。將pVKH35S-ipt-GUS用0&2+誘導(dǎo)化學(xué)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用真空抽濾法通過GV3101將pVKH35S-ipt-GUS轉(zhuǎn)入到擬南芥(Arabidopsis6b7咖Ws)。通過在25Pg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選，獲得125株轉(zhuǎn)基因植物。pVKH-GUS-ipt植物表達(dá)載體的構(gòu)建用GUS-1:GCGGAGCTCATGTTACGTCCTGTAGAAA(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶5"scI識別位點)和GUS-3:ATTTCTAGATCATTGTTTGCCTCCCTGC(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)為引物)，pBS-GUS為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用&cI和IsI進(jìn)行酶切，與用同樣I和屈aI進(jìn)行酶切的pBluescriprII中間載體連接，得到pBS-GUS(b)。用ipt-l:GTGAGATCTATGGACCTGCATCTAATTT(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)和ipt-2:CAGGTCGACGGCTGGCGTAACCTAATAC(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)為引物，pBS-ipt為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用屈sl和5^1進(jìn)行酶切，然后與用同樣JteI和5"WI進(jìn)行酶切的pBS-GUS(b)載體連接，得到中間載體pBS-GUS-ipt。然后用i5WM6II和I酶切pBS-GUS-ipt，得到5，端是平末端，3'端帶有5"WI的GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段。用A朋WI酶切植物表達(dá)載體pVKH-35S-pA，Klenow酶補(bǔ)平，然后用I酶切，獲得5，端是平末端，3，端帶有5"WI的pVKH35線型植物表達(dá)載體，然后與5'端是平末端，3'端帶有5"WI的GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段連接，得到pVKH-GUS-ipt植物表達(dá)載體。將pVKH-GUS-ipt用C誘導(dǎo)化學(xué)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用真空抽濾法通過GV3101將pVKH35S-GUS-ipt轉(zhuǎn)入到擬南芥(ArabidopsisCa/腿Z;i3)。通過在25Pg/ral潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選得到115轉(zhuǎn)基因植物，通過在25Pg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基上重復(fù)3代篩選，獲得20個基因單一插入的轉(zhuǎn)基因植物株系(Lines)。二、pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定，同時以野生型的擬南芥作為對照，進(jìn)行以下實驗。1:按照如下方法檢測ipf基因在ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因和GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因的raRNA水平將pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt抗性轉(zhuǎn)基因苗移栽到MS+25Pg/ml潮霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，然后收集100mg左右的轉(zhuǎn)基因植物幼苗，用TRIi(大連寶生物公司)方法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在40(！1的反應(yīng)體系中進(jìn)行，其中包括5叫上述提取的總RNA,2(il(5pmol/pl)OligodT，8|al5XRTbuffer,4DTT(10mM),2(ildNTP(10raM)，2(il逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)條件為42°C，50分鐘，然后在7(TC，15分鐘停止反應(yīng)。PCR反應(yīng)以ipt基因特異引物(從基因的108-407bp片斷)ipt-3:TTTCGCTTGATCGGGTCC和ipt-4:GGTCTCTTGGTCGGGTAACTTG為引物，上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果如圖4-C所示，表明在pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因植物中，i/^基因在ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因和GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因的mRNA水平相同。圖4中，對照是野生型的擬南芥，ipt-GUS表示轉(zhuǎn)pVKH-ipt-GUS擬南芥，GUS-ipt表示轉(zhuǎn)pVKH-GUS-ipt擬南芥。2:按照如下方法檢測植物激素cytokinins在ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因和GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因轉(zhuǎn)基因植物中的含量用化學(xué)方法分析pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因苗在MS+25Pg/ml潮霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天和30天的轉(zhuǎn)基因幼苗中的植物激素cytokinins的含量。植物激素的提取和定量分析參照(GuoJianchun等Interactiveeffectsofcytokinins,lightandsucroseonthephenotypesandthesynthesesofanthocyanins，ligninsincytokininover-producingtransgenicAn3/^V0p57's，Journalofplantgrowthregulation24(2):93-101，2005)所描述的方法進(jìn)行。每種類型的植物分析了lg新鮮材料被分成兩組。實驗設(shè)2次重復(fù)，每次重復(fù)pVKH-ipt-GUS、pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因苗和對照各500mg新鮮材料，200株(苗齡為12天)；50株(苗齡為30天)。由于pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥不能開花結(jié)籽，所用的苗是TO代的抗性轉(zhuǎn)基因苗，而pVKH-GUS-ipt是單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因純合子第三代苗。在pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因植物中，苗齡為12天時，其植物細(xì)胞分裂素分別是正常植株的20-15倍；苗齡為30天時，其植物細(xì)胞分裂素分別是正常植物10-15倍；而在pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因植物中，在苗齡為12天時，其植物細(xì)胞分裂素是正常植物的l-2倍(圖4-B，圖中兩個柱分別代表兩組分析)。對照是非轉(zhuǎn)基因的擬南芥。3:按照如下方法檢測GUS酶活性在ipt-GUS轉(zhuǎn)錄融合雙基因和GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因轉(zhuǎn)基因植物中活性化學(xué)染色的方法參照(GuoJianchun等Interactiveeffectsofcytokinins,lightandsucroseonthephenotypesandthesynthesesof肌thocyanins,ligninsincytokininover-producingtransgenic^n3力i(yc"psis，Journalofplantgrowthregulation24(2):93-101，2005)所描述的方法進(jìn)行。GUS酶活性在pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因植物中，酶活性很高，在整個植物中均能檢測到藍(lán)色，且顏色深，說明ftt基因表達(dá)的強(qiáng)度大(圖4-A)。在20個單一插入的pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因株系中(lines)，有18個株系被檢測到高的GUS酶活性，有2個株系沒有被檢測到GUS酶活性。而GUS酶活性在pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因植物中，酶活性很弱，只有在莖的頂端檢測得到藍(lán)色(圖4-A)，pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因株系中，只有45%的株系被檢測到弱的GUS酶活性(圖4-A)。對照是非轉(zhuǎn)基因的擬南芥。4:ipt-GUS和GUS-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因轉(zhuǎn)基因植物生長的形態(tài)學(xué)觀察將轉(zhuǎn)入pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt植物表達(dá)載體通過抗性篩選的轉(zhuǎn)基因苗各10株移栽到MS+25Pg/ral潮霉素MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各10株移栽到土壤，在光周期為16h光照/8h黑暗，22。C，光強(qiáng)度為20000LX的人工氣候箱中培養(yǎng)。在pVKH-ipt-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中，由于過量增加植物細(xì)胞分裂素，植物生長表現(xiàn)為嚴(yán)重抑制，如在培養(yǎng)基中根發(fā)育停止(表1)，莖干和莖的頂端增大，葉的邊緣發(fā)育成波浪型(圖5-A，B);在土壤栽培的條件下，植物生長發(fā)育很慢，且發(fā)育嚴(yán)重不正常，花不能正常發(fā)育，沒有種子形成(圖5-C)。但是在pVKH-GUS-ipt轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中，植物細(xì)胞分裂素微量增加，所以植物無論在培養(yǎng)基中還是在土壤生長的條件下都表現(xiàn)為比野生型的擬南芥生長快，開花早，側(cè)枝多(圖5-G，H，I)。_表l:在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因植物根的發(fā)育_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例2、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt與肌醇半乳糖苷合成酶基因JWA^轉(zhuǎn)錄融合在煙草中的表達(dá)一、植物表達(dá)載體pVKH-AGolS2-ipt和pVKH-AtGolS2的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得低分子量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可溶性棉子糖(Raffnose)和肌醇半乳糖苷在植物抗寒及抗旱方面起了重要作用。而肌醇半乳糖苷酶(GolS)是催化UDP-半乳糖生化合成棉子糖家族反應(yīng)的第一步。擬南芥中共有七種^^S基因，分別命名為AtGolSl-7,它們的同源性很高，其中J^b^5^是由冷脅迫誘導(dǎo)的，力Wo/5^(AB:062849)受高鹽禾卩干旱誘導(dǎo)(Taji等，importantrolesofdrought-andcold-induciblegenesforgalactinolsynthaseinstresstoleranceinArabidopsisthalia亂TheplantJournal,2002，29(4):417-426，2002)。在植物表達(dá)載體pVKH-GUS-ipt中，將^6W5^基因取代f〃5"基因，構(gòu)建pVKH-AGolS2-ipt表達(dá)載體，并同時構(gòu)建pVKH-AtGolS2表達(dá)載體(圖6)轉(zhuǎn)入煙草。在AGolS2-ipt轉(zhuǎn)錄融合中，J6W5^基因和^^基因之間插入了4個核苷酸(TAAG)具體方法如下pVKH-AtGolS2植物表達(dá)載體的構(gòu)建A6W5^基因(AB062849)是從擬南芥中分離得到。用TRI皿(大連寶生物公司)方法提取擬南芥總RNA，然后用大連寶生物公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄在42r60inin，99°C10min條件下進(jìn)行。^foZ5^基因的分離用上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以AT-3:GTAGGATCCACAAAGAAGATGGCACCTGA(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶識別位點)和AT-4:GCAGTCGACTATTGTCGGGAGCATTGTT(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94°C30min，55°C30min，72°C70min，30個循環(huán)。得到約1100bp的^6W5^基因片段。PCR產(chǎn)物連接到pMD-18-T-載體上(大連寶生物公司)，然后送到上海生工進(jìn)行測序，將測序正確的重組表達(dá)載體命名為pMD-18-AtGolS2。由于^C基因5'端引物加有I酶切位點，3'引物加有I酶切位點，用核酸內(nèi)切酶As/b〃I和5k7I對PMD-18-AtGolS2進(jìn)行酶切，得到帶有5柳#I和5"WI粘性末端的JWd5^基因片段；用同樣I和5^/I酶對pVKH-35S-pA進(jìn)行酶切，獲得帶有5棚#I和I粘性末端的pVKH35線型植物表達(dá)載體，然后與帶有A朋WI和5"WI粘性末端的Jf&Z^基因片段連接，獲得pVKH-AtGolS2植物表達(dá)載體。用pVKH-AtGolS2作為模板，AT-3和AT-4為引物進(jìn)行PCR，結(jié)果獲得約1100bp大小的^6b76^基因片段。將pVKH-AtGolS2用Ca"誘導(dǎo)化學(xué)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用葉盤法通過GV3101將pVKH-AtGolS2轉(zhuǎn)入到煙草(船c"&朋^&c咖L)(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所)。通過在40^g/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選，獲得12株轉(zhuǎn)基因煙草植物(T0)。pVKH-AtGolS2-ipt植物表達(dá)載體構(gòu)建以pMD-18-AtGolS2質(zhì)粒為模板，以AT-1:GTAGTCGACACAAAGAAGATGGCACCTGA(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)和AT-2:GCAGAATTCTATTGTCGGGAGCATTGTT(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶fco7I識別位點)為引物，PCR反應(yīng)在94r30min，55°C45min，72°C70min，30個循環(huán)條件下進(jìn)行，獲得約1100bp的力Wo75^基因片段，然后用6^7I和v^o7I雙酶切力WoZ5^基因片段的PCR產(chǎn)物和pBS-ipt(中間載體)，獲得帶有I和fcMI粘性末端的A6b7W基因和帶同樣酶切位點的pBS-ipt線性載體，T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pBS-AtGolS2-ipt(中間載體)。以pBS-AtGolS2-ipt為模板，以AT-3:GTAGGATCCACAAAGAAGATGGCACCTGA(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶識別位點)和ipt-2:GCAGTCGACACATTCCGAACGGATG(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)為引物，PCR反應(yīng)在94"30min，52°C45min，72°C2min，30個循環(huán)條件下進(jìn)行，得到約1800bp的AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因的片段，連接pMD-18-T載體，得到了pMD-18-T-AtGolS2-ipt中間表達(dá)載體。用I和5"WI酶切pMD-18-T-AtGolS2-ipt中間表達(dá)載體，得到帶JZ^I和5^I粘性末端的AtGo12-ipt片段，同時用IaI和Sa7I酶切pVKH-A0C-ipt(圖10-B)，切除A0C-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因，得到帶I和I粘性末端的pVKH-35S線性載體骨架，然后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pVKH-AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)載體。將pVKHS-AtGolS2-ipt用Ca2+誘導(dǎo)化學(xué)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用葉盤法通過GV3101將pVKH-At2-ipt轉(zhuǎn)入到煙草。通過在40Pg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選，獲得10株轉(zhuǎn)基因煙草(T0)。同時以非轉(zhuǎn)基因煙草作為轉(zhuǎn)基因煙草對照，進(jìn)行以下實驗。將轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草T0代抗性植株，用CTAB化提取基因組DNA(王關(guān)林等，植物基因工程，2002)作為模板，AT-1和AT-2或ipt-3和ipt-4為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果在轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草中得到大小為1100bp和300bp兩條帶；在轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草中只得到一條1100bp的帶。將轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草T0代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，觀察其生長情況。每種煙草各種10株。將轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草T0代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周，觀察其生長情況。每種煙草各種10株。將轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草T0代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周，最后移栽到土壤培養(yǎng)3周，觀察其生長情況。每種煙草各種10株。結(jié)果表明在無誘導(dǎo)的自然條件下，pVKH-AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)基因煙草無論是在培養(yǎng)基中還是在土壤中都比pVKH-AtGolS2轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照生長快些，并且根系發(fā)達(dá)(圖7-A，B，C)，非轉(zhuǎn)基因煙草對照和pVKH-AtGolS2轉(zhuǎn)基因煙草的生長情況相近。2)將轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草T0代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到土壤培養(yǎng)3周后，讓其置于脅迫的條件下。只用150mM的鹽水澆灌，4天澆一次，每次200ml，讓植物處于鹽脅迫的狀態(tài)；或用自來水澆灌，但減少一半的澆水次數(shù)，8天澆水一次，每次200ml,讓其處于干旱脅迫的狀態(tài)；或用自來水澆灌，但放置于8度人工氣候培養(yǎng)箱中，4天澆一次，每次200ml,讓其處于低溫脅迫的狀態(tài)；以上三種脅迫處理連續(xù)保持65天。同時設(shè)置非脅迫條件對照即正常條件下培養(yǎng)自來水澆灌，4天澆一次，每次200ml。每種煙草各各種10株。pVKH-AtGolS2和pVKH-AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出一定的耐鹽性、耐旱性和耐寒性。其生長狀況比非轉(zhuǎn)基因煙草對照生長好。pVKH-AtGolS2在鹽脅迫和干旱脅迫條件下植物生長比非脅迫條件下植物的生長稍微慢些(圖8-A)。pVKH-AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫和干旱脅迫的條件下同非脅迫的條件下，植物的大小沒有多大的區(qū)別，均表現(xiàn)為生長旺盛，壯而稍矮(圖8-C)。在低溫脅迫的條件下pVKH-AtGolS2-ipt轉(zhuǎn)基因煙草比pVKH-AtGolS2表現(xiàn)為更大的生長優(yōu)勢，植物葉片大而綠，開花遲，當(dāng)轉(zhuǎn)移到正常條件下后，開花和結(jié)籽多(圖8-B，D)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因pVKH-AtGolS2-ipt，pVKH-AtGolS2和對照非轉(zhuǎn)基因苗在以上脅迫條件下65天時測定它們?nèi)~片的葉綠素含量。每種煙草各各種10株。200mg去葉脈的葉片用2-3ml95%酒精研磨勻漿過濾，用95%酒精洗研缽及殘渣，合并濾液用95。/。酒精定容至25ml。然后在663nm和645nm測定它們的吸收光譜，葉綠素含量的計算按照公式C(mg/L)X提取液總量(L)X稀釋倍數(shù)Chl=(mg/g葉)材料鮮重(g)其中葉綠素a，葉綠素b，葉綠素a+b含量的計算為葉綠素a(mg/L)=12.7x0D腦-2.69x0D645;葉綠素b(mg/L)=22.9x0D645-4.86x0D663;葉綠素a+b(mg/L)=8.02x0D663+20.2x0D645。結(jié)果表明轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草在無誘導(dǎo)的自然條件下，和低溫脅迫的條件下其葉片中葉綠素含量比轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草高，特別是在低溫脅迫的條件下，植物葉片持綠期明顯比轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草長，葉綠素含量高(圖9-A)。但是在干旱脅迫的條件下，植物葉片中葉綠素含量在轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草和轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草葉片中幾乎相同(圖9-D);在鹽脅迫的條件下，轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草葉片中葉綠素的含量甚至比轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草葉片葉綠素的含量高(圖9-C)。圖9中，AtGolS2-ipt表示轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2-ipt煙草，AtGolS2表示轉(zhuǎn)pVKH-AtGolS2煙草。實施例3、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因i》t與丙二烯環(huán)化氧化酶^C轉(zhuǎn)錄融合在煙草中的表達(dá)丙二烯環(huán)化氧化酶A0C能把一種不穩(wěn)定的具有立體特異性的丙二烯環(huán)化物催化氧化成(9S，13S)-12-0-(10，15Z)-植物二烯酸，此植物二烯酸是茉莉酸的最終前體。紅樹林海蓮Ler收wierasexa/7^/2ay>的A0C和西紅柿、擬南芥植物中的A0C相比較具有較高的同源性，但西紅柿和擬南芥植物中的A0C沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)耐鹽特性，而海蓮的A0C(AB037929)具有明顯的增強(qiáng)耐鹽性，主要是因為海蓮植物中的AOC蛋白有一個不尋常的70個氨基酸的序列，它與耐鹽特性密切相關(guān)。在植物表達(dá)載體pVKH-GUS-ipt中，將海蓮植物中的^T基因取代^/S基因，構(gòu)建pVKH-AOC-ipt表達(dá)載體，并同時構(gòu)建pVKH-A0C表達(dá)載體(圖10)轉(zhuǎn)入煙草。在A0C-ipt轉(zhuǎn)錄融合中，^T基因與ipt基因之間插入了6個核苷酸(CTTAAG)。具體方法如下pVKH-AOC植物表達(dá)載體構(gòu)建如下JOC基因(AB037929)是紅樹林植物海蓮(份，收Werasexs/7^^^分離得到。按照文獻(xiàn)(曾會才，紅樹林植物海馬齒耐鹽相關(guān)基因克隆，華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2003)中描述的方法提取海蓮總RNA。然后用大連寶生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42"C60min，99°C10rain，5。C5min條件下進(jìn)行。^OC基因(自GenBankAccessionNumberAB037929的5'末端第42至812位)的分離用上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以引物A0C-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶I識別位點)和A0C-4:GCAGTCGACAATCACTAATCGGTG(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶5"WI識別位點)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94°C30min，52°C30rain，72°C45min，30個循環(huán)，得到約780bp片段。PCR產(chǎn)物連接到pMD-18-T載體(大連寶生物公司)上，然后送到上海生工進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的重組載體命名為pMD-18-T-A0C。由于^基因5'端引物加有^3歷^I酶切位點，3，引物加有&JI酶切位點，用核酸內(nèi)切酶I和5"WI對pMD-18-T-A0C進(jìn)行酶切，得到帶有fe/z^I和5"WI粘性末端的^T基因片段；用同樣7fe/^I和5^I酶對pVKH-35S-pA進(jìn)行酶切，獲得帶有&邁#I和&7I粘性末端的pVKH35線型植物表達(dá)載體，然后與帶有BamHI和SalI粘性末端的AOC基因片段連接，獲得pVKH-A0C植物表達(dá)載體。用pVKH-A0C作為模板，引物A0C3-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC和A0C-4:GCAGTCGACAATCACTAATCGGTG為引物進(jìn)行PCR,結(jié)果獲得約780bp大小的^(9C基因片段。將pVKH-AOC用Ca2+誘導(dǎo)化學(xué)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用葉盤法通過GV3101將pVKH-AOC轉(zhuǎn)入到煙草(WcoWa朋fa/^c柳L)(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所)。通過在40Pg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選，獲得10株轉(zhuǎn)基因煙草植物(TO)pVKH-AOC-ipt植物表達(dá)載體構(gòu)建如下以A0C-1:GTAGTCGACAGAAAATGGCTCTTTC(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶&7I識別位點)，AOC-2:GCAGAATTCAATCACTAATCGGTGA(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶^bo/I識別位點)為引物，pMD-18-T-AOC質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)條件下為94°C30rain，52°C30min，72°C45min，30個循環(huán)，擴(kuò)增約780bp的力OC基因。用5"WI和fcoTI雙酶切力基因PCR產(chǎn)物和pBS-ipt中間載體，獲得帶有I和fco7I粘性末端的A0C基因和帶同樣酶切位點的pBS-ipt線性載體，TJ)NA連接酶連接構(gòu)建pBS-A0C-ipt中間載體。用II和laI酶切pBS-A0C-ipt，獲得一端是平端，另一端帶有I酶切位點AOC-ipt;用I酶切植物表達(dá)載體pVKH-35S-pA，Klenow酶補(bǔ)平，然后用5"WI酶切，獲得5'端是平末端，3'端帶有&JI的pVKH35線型植物表達(dá)載體，然后與5'端是平末端，3，端帶有&JI的A0C-ipt轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段連接，得到pVKH-A0C-ipt植物表達(dá)載體。該表達(dá)載體按照如下方法檢測以pVKH-A0C-ipt載體為模板，A0C-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC,ipt-5:GCAGTCGACACATTCCGAACGGATG為引物，在94°C45S，54°C30min，72°C90min，30個循環(huán)條件下，結(jié)果得到和ipf轉(zhuǎn)錄融合雙基因的聯(lián)合片段，約1500bp。以A0C-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC，A0C-4:GCAGTCGACAATCACTAATCGGTG，為引物在94。C30S，52°C30min，72°C45rain，30個循環(huán)條件下，結(jié)果得到力OC基因特異片段約780bp。pVKH-A0C-ipt用0&2+誘導(dǎo)化學(xué)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用葉盤法通過GV3101將pVKH35S-A0C-ipt轉(zhuǎn)入到煙草(Wc"ia朋L)(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所)。通過在40Pg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選，獲得12株轉(zhuǎn)基因煙草(T0)。同時以非轉(zhuǎn)基因煙草作為轉(zhuǎn)基因煙草對照，進(jìn)行以下實驗。將轉(zhuǎn)pVKH-A0C-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草T0代抗性植株，用CTAB化提取DNA(王關(guān)林等，植物基因工程，2002)為模板，A0C-1和A0C-2或ipt-3和ipt-4為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草中得到大小為780bp和300bp兩條帶；在轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草中只得到一條7S0bp的帶。將轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-A0C煙草TO代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，觀察其生長情況。每種煙草各種10株。將轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AOC煙草TO代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周，觀察其生長情況。每種煙草各種10株。將轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草、轉(zhuǎn)pVKH-AOC煙草TO代抗性植株，且經(jīng)過PCR檢測為陽性的苗和非轉(zhuǎn)基因煙草對照在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，然后移栽到沙中培養(yǎng)3周，最后移栽到土壤培養(yǎng)5周，觀察其生長情況。結(jié)果表明在無誘導(dǎo)的自然條件下，轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草無論是在培養(yǎng)基中還是在土壤中都比轉(zhuǎn)pVKH-AOC煙草生長快些(圖ll)。圖ll中，AOC-ipt表示轉(zhuǎn)pVKH-AOC-ipt煙草，AOC表示轉(zhuǎn)pVKH-AOC煙草。每種煙草各種10株。序列表<160>2<210〉1<211〉240<212>PRT〈213〉豐艮癌農(nóng)桿菌(4§ro6<3Cter/w/Z7tw/ze/scie/750<400〉1MetAspLeuHisLeuliePheGlyProThrCysThrGlyLysThrThr151015ThrAlalieAlaLeuAlaGinGinThrGlyLeuProValLeuSerLeu202530AspArgValGinCysCysProGinLeuSerThrGlySerGlyArgPro354045ThrValGluGluLeuLysGlyThrThrArgLeuTyrLeuAspAspArg505560ProLeuValGluGlylielieAlaAlaLysGinAlaHisHisArgLeu65707580lieGluGluValTyrAsnHisGluAlaAsnGlyGlyLeulieLeuGlu859095GlyGlySerThrSerLeuLeuAsnCysMetAlaArgAsnSerTyrTrp100105110SerAlaAspPheArgTrpHislielieArgHisLysLeuProAspGin115120125GluThrPheMetLysAlaAlaLysAlaArgValLysGinMetLeuHis130135140ProAlaAlaGlyHisSerlielieGinGluLeuValTyrLeuTrpAsn145150155160GluProArgLeuArgProlieLeuLysGlulieAspGlyTyrArgTyr165170175AlaMetLeuPheAlaSerGinAsnGinlieThrAlaAspMetLeuLeu180185190GinLeuAspAlaAsnMetGluGlyLysLeulieAsnGlylieAlaGin195200205GluTyrPhelieHisAlaArgGinGinGluGinLysPheProGinVal210215220AsnAlaAlaAlaPheAspGlyPheGluGlyHisProPheGlyMetTyr225230235240〈210〉2<211〉392<212〉DNA〈213〉花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus)<■〉2actccaagaaacagtctcag^gacc3gagggctattgagacttttcaac60a^gggta^tstcggga^cctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcg1203g3aaagg肌gatggcttcttcattgcgat180ctatcgttcaagaatgcctctaccgacagtggtccca肌gatggacccccacccacgagg24033catcgtggcgttccaaccacgtcttcaa3gcaagtgga"ttgatgtgat300atctccactg3cg他gggatgacgcacaatxccactat:ccttxgcaagacccttcctct360atata^ggaagttcatttca"tUgg卿gg3C39權(quán)利要求1、一種轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，其自5′→3′方向的排列順序依次為除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG組合的脫氧核糖核苷酸序列和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，其特征在于所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列是序列表中的序列1;所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列優(yōu)選為自GenBankAccessionNumberAF242881的5'末端第7864-8586位。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，其特征在于所述除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因外的功能基因為所有具有功能的基因；所述除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因外的功能基因具體可為報告基因或抗逆基因；如GUS基因、A6bJ5^基因或海蓮的A0C基因。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，其特征在于所述2-60bp其排列中不具有ATG組合的脫氧核糖核苷酸序列的核苷酸長度為6J4bp。5、含有權(quán)利要求1至4中任一所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段的表達(dá)盒。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒的自5'—3'方向的排列順序依次為組成型強(qiáng)啟動子、除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG組合的脫氧核糖核苷酸序列、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因和多聚A尾。7、含有權(quán)利要求1至4中任一所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段的重組植物表達(dá)載體，或含有權(quán)利要求1至4中任一所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段的細(xì)胞系；或含有權(quán)利要求1至4中任一所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段的重組植物表達(dá)載體的細(xì)胞系。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于所述重組植物表達(dá)載體是含有權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)盒的植物表達(dá)載體。9、一種培育微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求1至4中任一所述的轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，或權(quán)利要求5至6中任一所述的表達(dá)盒，或權(quán)利要求7至8中任一所述的重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，得到微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述植物為雙子葉植物，具體可為煙草。全文摘要本發(fā)明公開了一種培育微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物的方法及專用轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段。該轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段，自5′→3′方向的排列順序依次為組成型強(qiáng)啟動子、除異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG組合的脫氧核糖核苷酸序列和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因。將該轉(zhuǎn)錄融合雙基因片段導(dǎo)入植物中，可獲得微量增加植物細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為生長快，側(cè)枝多，葉綠素含量高，延期衰老。本發(fā)明可用于植物的品質(zhì)改良中，特別是可用于要轉(zhuǎn)入對植物生長有阻礙作用基因的轉(zhuǎn)基因植物的品質(zhì)改良中，如抗逆植物的品質(zhì)改良?？鼓婊?qū)χ参锏纳L有阻礙作用，將它與ipt轉(zhuǎn)錄融合，ipt基因的弱表達(dá)，可改善轉(zhuǎn)基因植物的生長。文檔編號C12N15/62GK101157932SQ200710119770公開日2008年4月9日申請日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者段瑞軍,符少萍,胡新文,郭建春申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所