專利名稱：一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培育轉(zhuǎn)基因植物的方法與應(yīng)用，具體說是一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病毒是農(nóng)作物生產(chǎn)上的主要病害之一，植物病毒有時(shí)會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成災(zāi)難性的影響，培育高抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。
近年來研究發(fā)現(xiàn)，基因沉默機(jī)制是植物抵御病毒入侵的一種防御機(jī)制(Covey，SN，1997，Nature，385(27)781-782)，基因沉默現(xiàn)象最早是1990年Napoli等(NapoliC，et al.1990，Plant Cell，2279-289；Van der Krol Ar，et al.1990，PlantCell，2291-299)在研究轉(zhuǎn)查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)基因chs的矮牽牛植株中發(fā)現(xiàn)的。由于不但外源的chs基因不能表達(dá)，內(nèi)源的chs基因的表達(dá)也被沉默了，稱之為共抑制(co-suppression)。不但轉(zhuǎn)化的基因可以發(fā)生基因沉默現(xiàn)象，宿主的內(nèi)源基因也可以被轉(zhuǎn)基因或病毒誘導(dǎo)而沉默(Ruiz MT，et al.，1998，PlantCell，10(6)937-946；Dalmay T，et al.，2000，Plant Cell，12(3)369-379)。這種基因沉默現(xiàn)象普遍存在于植物、動(dòng)物、細(xì)菌及真菌中(Land，KM.2001，Trends inGenetics，17(7)379)。
研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)病毒來源基因的植物也可以發(fā)生“恢復(fù)”現(xiàn)象，被病毒感染后的轉(zhuǎn)基因植物的新生葉片具有針對(duì)這種病毒的抗性，植物內(nèi)的轉(zhuǎn)基因也同時(shí)發(fā)生沉默現(xiàn)象(Covey，SN，et al.1997，Nature，385(27)781-782)。此外當(dāng)攜帶有植物基因的病毒侵染植物時(shí)，植物內(nèi)源的相應(yīng)基因也可以被沉默(Jones L，et al.1999，PlantCell，11(12)2291-301；Burton RA，et al.2000，Plant Cell，12(5)691-706)。含有非病毒或非植物來源的轉(zhuǎn)基因植物，用攜帶有此基因的病毒侵染后，這種基因也同樣可以發(fā)生沉默。因此，病毒既是基因沉默的對(duì)象，又是基因發(fā)生沉默的誘導(dǎo)因子(Ratcliff，F(xiàn)G.et al.1999，The Plant Cell，11，1207-1215)。當(dāng)植物受到病毒侵染后會(huì)啟動(dòng)基因沉默機(jī)制，使病毒不能在其體內(nèi)進(jìn)行繁殖，植株表現(xiàn)出免疫或高抗；轉(zhuǎn)錄后基因沉默是植物抵御病毒入侵的一種免疫機(jī)制(Voinnet，O.2001，Trendsin Genet，17449-459；Matzke，MA.et al，2002，Adv Genet，46235-75；PlasterkRH.Science，2002，17；296(5571)1263-5；Baulcombe DC，Trends Microbiol，2002，10(7)306-8)。
基因沉默機(jī)理的研究，使得根據(jù)基因沉默機(jī)理培育出抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物成為可能。對(duì)基因沉默應(yīng)用一個(gè)關(guān)鍵的問題就是如何提高目的基因發(fā)生沉默的機(jī)率。雖然利用病毒載體可以簡(jiǎn)便有效地誘導(dǎo)基因失活，但病毒載體的限制決定了對(duì)某些特定宿主中的特有基因無法進(jìn)行研究利用；另外，雖然利用轉(zhuǎn)化方法可以產(chǎn)生基因沉默，但是自然條件下產(chǎn)生基因沉默的效率較低。因此，如果能提供一種可以有效提高目的基因在轉(zhuǎn)基因宿主中失活的方法，由此方法就可以培育高抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以有效提高目的基因在轉(zhuǎn)基因宿主中失活，由此培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法。
一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟a.查閱宿主密碼子的使用頻率，確定稀有密碼子，修飾目的基因中的密碼子，把目的基因中某些密碼子突變成宿主植物中的稀有同義密碼子；b.構(gòu)建含有密碼子修飾目的基因的用于植物轉(zhuǎn)化的載體；c.轉(zhuǎn)化植物，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株；d.檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株，篩選目的基因發(fā)生基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株，獲得高抗病毒轉(zhuǎn)基因植株。
為了便于篩選，所述載體中還含有選擇標(biāo)記基因。
所述稀有密碼子為使用頻率在0-10‰之間的密碼子。
所述載體可以為原核表達(dá)載體，也可以為真核表達(dá)載體。
一般情況下是在GenBank等基因庫中查閱宿主密碼子的使用頻率，所述的目的基因是指具有研究意義和應(yīng)用價(jià)值的基因。
所述突變方法包括一切以突變目的基因中密碼子為稀有同義密碼子為目的的常規(guī)突變方法，如定點(diǎn)突變等。用于轉(zhuǎn)化宿主的方法包括一切可以將外源基因?qū)胨拗鲀?nèi)的常規(guī)方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)，基因槍法等。
用本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞系及植株均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的方法在植物育種，特別是培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物中具有重要的理論及實(shí)際意義。
本發(fā)明的依據(jù)是每種生物體內(nèi)都有許多的tRNA池(pool)，即有一定的tRNA豐度。如果某種tRNA缺乏或被大量使用，相應(yīng)的tRNA池就會(huì)變小(Ikemura T.1985，Mol.Biol.Evol.，213-35；Antezana MA，1999，J Mol Evol，49(1)36-43)，一般來說稀有tRNA的池比豐富tRNA的池更容易被變小。當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)不同的花生過敏原時(shí)發(fā)現(xiàn)，cDNA中含AGA/AGG密碼子達(dá)8-10％的Arah 1、2、6比含AGA/AGG密碼子達(dá)0.8％的Ara h 5表達(dá)量要低很多。在不改變密碼子含量的情況下，在細(xì)菌中表達(dá)大腸桿菌的編碼精氨酸稀少tRNA的argU、ileY和lueW基因，使精氨酸稀少密碼子含量高的Arah1、2、6表達(dá)提高了100多倍(Kleber-Janke T，et al.2000，Protein Expr Purif，19419-424)。如果把GA重復(fù)片斷插入lacZ編碼框(ORF)中，特意產(chǎn)生移碼突變，產(chǎn)生了許多稀有密碼子，研究發(fā)現(xiàn)由于稀有密碼子的增多，相應(yīng)的tRNA被大量使用，導(dǎo)致翻譯在核糖體A位點(diǎn)空缺的機(jī)率增大，表達(dá)水平下降(Bregeon D，et al.2001，GenesDev，152295-306)。Chen等發(fā)現(xiàn)在LacZ起始密碼子的后面插入4個(gè)連續(xù)的大腸桿菌很少使用的精氨酸Arg的密碼子，結(jié)果造成LacZ翻譯效率的下降，并且增加稀有密碼子與起始密碼子之間的距離，翻譯效率會(huì)有所增加。對(duì)此解釋是在翻譯起始的早期，由于tRNA的缺乏，造成核糖體停頓時(shí)間過長(zhǎng)，發(fā)生“移動(dòng)堵塞”(traffic jam)，增加了核糖體的不穩(wěn)定性，容易引起mRNA的降解(Chen，GFT.，et al.1990，Nucl AcidsRes.181465-1473)。利用同義的稀少密碼子替換酵母中磷酸甘油酸激酶(PGK1)中正常的密碼子，發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量減少了10倍以上(Hoekema A.，et al.1987，Mol.Cell.Biol.72914-2924)。同樣利用本方法構(gòu)建的表達(dá)載體中的目的基因含有大量的稀有密碼子，在導(dǎo)入宿主體內(nèi)表達(dá)時(shí)，相應(yīng)mRNA更易于被降解(Rocher EJE.et al.1998，Plant physiol.1171445-1461)，目的基因的表達(dá)就會(huì)降低或甚至被完全關(guān)閉。
本發(fā)明對(duì)馬鈴薯X病毒外殼蛋白(coat protein，cp)基因中的某些密碼子進(jìn)行了同義稀有密碼子的替換，使其含有較多的稀有密碼子。構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體后轉(zhuǎn)化煙草，分子檢測(cè)cp基因表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)未修飾cp基因的煙草失活率為6.25％，而轉(zhuǎn)密碼子修飾cp基因的煙草有35％的cp基因發(fā)生了失活，ELISA結(jié)果表明其在蛋白表達(dá)水平上也明顯低于密碼子未修飾cp基因的表達(dá)，說明本發(fā)明方法關(guān)閉基因的有效性。對(duì)于轉(zhuǎn)基因的煙草機(jī)械接毒的結(jié)果表明，發(fā)生cp基因失活的轉(zhuǎn)基因煙草比未失活的轉(zhuǎn)基因煙草有更多的植株表現(xiàn)完全免疫或高抗癥狀，表明了此方法在培育高抗病毒植物上的有效性。


圖1為載體pBCPM的結(jié)構(gòu)圖譜圖2為攜帶有修飾密碼子的PVX外殼蛋白基因表達(dá)載體pCPM2300的結(jié)構(gòu)圖譜圖3為部分轉(zhuǎn)pCPM2300載體T0代煙草植株P(guān)CR分析的電泳圖譜圖4為部分轉(zhuǎn)pCPM2300載體T0代植株的Northern blot分析圖5為部分轉(zhuǎn)pCPISAPH載體T0代植株的Northern blot分析圖6為接毒后PVX癥狀比較圖7為恢復(fù)癥狀比較圖8為癥狀比較圖9為感病葉癥狀圖10為PVX外殼蛋白基因的序列和氨基酸序列具體實(shí)施方式
實(shí)施例1馬鈴薯病毒X(PVX)外殼蛋白基因的密碼子修飾首先查閱GenBank找到煙草Nicotiana tabacum及馬鈴薯病毒X(PVX)外殼蛋白基因(coat protein，CP)中所有密碼子的使用頻率，確定煙草中的稀有密碼子(如表1所示)。
表1、煙草Nicotiana tabacum(T)和馬鈴薯外殼蛋白基因(P)*

*各密碼子使用頻率來自GenBank數(shù)據(jù)庫T表示煙草，P表示馬鈴薯病毒首先以含有PVX外殼蛋白基因的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出不含突變的野生型外殼蛋白基因，插入到克隆載體pBlueKS的Xba I和Kpn I之間，構(gòu)建成pBCPW。另外設(shè)計(jì)5條含有限制性酶切位點(diǎn)和相應(yīng)突變的引物(如表2所示)。
表2、外殼蛋白基因定點(diǎn)突變引物

以pBCPW為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)及限制性內(nèi)切酶的方法，擴(kuò)增出含有修飾密碼子的相應(yīng)片段，與外殼蛋白基因的未突變部分及載體，通過三片段連接構(gòu)建到克隆載體上，測(cè)序證明正確。然后再以突變成功的載體為模板，通過不同的引物組合最終擴(kuò)增出在基因的不同位置含有修飾密碼子的外殼蛋白基因，命名為pBCPM(結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示)。
實(shí)施例2含PVX外殼蛋白基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建把含有突變的PVX外殼蛋白基因pBCPM(具體序列如圖10所示，基因中每個(gè)密碼子的下面是氨基酸，堿基序列中用黑體表示的是要突變的堿基，為序列表中的序列1，黑體上的堿基為突變后的堿基，為序列表中的序列2；箭頭代表引物及引物的方向；陰影部分是右邊限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列)置于CaMV的35S啟動(dòng)子下，然后用EcoR I和Hind III酶切pSPRCPM，把含有PVX外殼蛋白基因的表達(dá)結(jié)構(gòu)P35S-CPM-Tnos插入到pCNPTII2300中，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pCPM2300(結(jié)構(gòu)圖譜如圖2所示)，同時(shí)構(gòu)建了含有野生型外殼蛋白基因的植物表達(dá)載體pCPW2300。參照BIO-DAD公司電激儀的說明書，將此植物表達(dá)載體通過電激法轉(zhuǎn)化到根農(nóng)桿菌LBA4404。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得將含植物表達(dá)載體pCPM2300和pCPW2300的根農(nóng)桿菌LBA4404接于20ml YEB液體培養(yǎng)基中(含Km，Rif各50mg/L)28℃避光培養(yǎng)過夜，次日按2％-4％轉(zhuǎn)接到無抗菌素的YEB培養(yǎng)基中(含乙酰丁香酮100μM/L)，劇烈振蕩培養(yǎng)3h。測(cè)OD值稀釋至相應(yīng)濃度(OD約0.5)。取無菌的煙草葉片并且切成葉盤狀，加入相應(yīng)濃度的根癌土壤桿菌液浸泡3-5min后將葉盤轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3d。然后經(jīng)75mg/L Kan的嚴(yán)格篩選，獲得抗性小芽。得到的抗性小芽再經(jīng)含75mg/L Kan的培養(yǎng)基上進(jìn)一步生根成完整的抗性植株。待植株長(zhǎng)至3-4片真葉時(shí)，進(jìn)行開放式水培養(yǎng)，長(zhǎng)出新根后移栽溫室。
實(shí)施例4T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株的分子檢測(cè)1、煙草總DNA的提取取煙草新鮮葉片0.3mg置于研缽中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml 60℃預(yù)熱的CTAB緩沖液(30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％的巰基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)。60℃保溫30min，其間輕搖數(shù)次。然后加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中加入2/3倍體積異丙醇，形成的沉淀既是DNA，加入少許洗液(體積份數(shù)為76％的乙醇，10mmol/L NH4Ac)洗滌沉淀一次，干燥后用500μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA)溶解DNA。隨后加入RNase A(終濃度10mg/L)，37℃保溫30min，依次用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提一次，水相加入2.5倍體積無水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于100μl無菌水中。
2、PCR檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)pCPW2300(46株)和pCPM2300(74)煙草T0代共120個(gè)抗性克隆分化成的植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。取1μl DNA做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。50μl的反應(yīng)體系中包括5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液、1μl 10mM引物Pl、1μl 10mM引物P2、1μl DNA模板、4μl 2.5mM dNTP，補(bǔ)加無菌水至總體積50μl。PCR反應(yīng)條件如下94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min、52℃復(fù)性1min、72℃延伸1.5min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取10μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，圖中1.DL2000 Marker；2.陽性對(duì)照，pCPISAPH2300質(zhì)粒；3.負(fù)對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因植株；4-12.轉(zhuǎn)pCPISAPH載體的轉(zhuǎn)基因植株。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，正常長(zhǎng)根的煙草植株均為cp基因轉(zhuǎn)化植株。
3、煙草總RNA的提取取1g新鮮的煙草葉片，液氮中研磨成粉末轉(zhuǎn)入離心管，加2ml變性液混勻；加0.1倍體積的2M NaAc(pH4.5)，混勻后加入1倍體積的水飽和酚混勻，再加入0.2體積的氯仿∶異戊醇(49∶1)，強(qiáng)力振蕩混勻后冰浴15min。10,000g，4℃離心20min；吸取上清，加入等體積的異丙醇混勻后于-20℃下放置1h；10,000，4℃下離心15分鐘后棄上清，用4M的LiCL重懸后再次離心，RNA沉淀用2ml DEPC處理水溶解后，用等體積的水飽和酚，水飽和酚氯仿，氯仿分別抽提一次，最后上清加入1/10體積的3M NaAc(pH5.4)及2倍體積的無水乙醇沉淀RNA，10,000g離心15min后棄上清，沉淀用75％的乙醇洗一次，RNA沉淀吹干后用50μl無RNase的水溶解，放置于-70℃?zhèn)溆谩?br> 4、Northern Blot分析對(duì)所有pCPM2300轉(zhuǎn)化植株及部分pCPW2300轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行Northern blot分析。取20μg RNA于1.2％的變性膠中電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的3/4處，用20×SSC轉(zhuǎn)移到Hybond-N+(Amersham pharmacia)膜上，轉(zhuǎn)移后的膜在2×SSC中洗一下，80℃真空固定2h。在含有7％SDS(W/V)的0.5 M磷酸鈉緩沖液中65℃預(yù)雜交2h。用[α-32P]dCTP(Amersham pharmacia)隨機(jī)引物法進(jìn)行探針標(biāo)記(Promega標(biāo)記試劑盒)。65℃雜交過夜，0.1×SSC中65℃洗膜，壓X光片，放射性自顯影，結(jié)果如圖4、圖5所示，圖4中a1-8為突變外殼蛋白基因(cp)雜交帶；b18s rRNA；圖5中a1，為pCNPT-II負(fù)對(duì)照；2-12為未突變外殼蛋白基因(cp)雜交帶；b18s rRNA。從圖中可以看出突變外殼蛋白基因(cp)發(fā)生了基因的失活(圖4中1、2、8和9樣品未雜交出目的條帶)，并且cp基因的mRNA數(shù)量明顯低于未突變外殼蛋白基因(cp)mRNA的數(shù)量水平。
實(shí)施例5體外轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)基因煙草的接毒1、PVX病毒載體的體外轉(zhuǎn)錄用Promega質(zhì)粒純化試劑盒過柱純化pP2C2S PVX病毒載體，用Spe I酶切使其線性化后，用Promega體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。首先加入體外轉(zhuǎn)錄緩沖液，再依次加入ATP，UTP，CTP(各2mM)、0.2mM GTP、0.5mM m7G(5’)PPP(5’)G帽子、RNA酶抑制劑(Pharmacia)、線性DNA和T7RNA聚合酶，于37℃反應(yīng)30min后，再次加入GTP至終濃度為2mM，37℃反應(yīng)1h后，水飽和酚/氯仿抽提一次，加入1/10體積的NaAc(pH5.4)和2倍體積的無水乙醇沉淀RNA，獲得PVX RNA病毒。
2、機(jī)械接毒用獲得的PVX RNA病毒對(duì)pCPW2300及pCPM2300轉(zhuǎn)基因煙草T0代進(jìn)行機(jī)械接毒。侵染前用35μl水(DEPC處理，含50mM磷酸緩沖液pH 7.0，5μg/μl皂土)溶解體外轉(zhuǎn)錄的RNA沉淀。將PVX病毒涂抹于用金剛沙(600 grit Carborundum)輕微打磨的煙草葉片上后，侵染煙草于25℃光照培養(yǎng)16小時(shí)后再于20℃暗培養(yǎng)8小時(shí)，之后25℃培養(yǎng)，觀測(cè)記錄各植株的病毒侵染癥狀，結(jié)果如表3及圖6-9所示。
表3、侵染煙草各癥狀比率

圖6中 A未接毒非轉(zhuǎn)基因植株；B未接毒的轉(zhuǎn)pCPM2300植株；Ccp基因失活的轉(zhuǎn)pCPM2300植株表現(xiàn)出免疫癥狀；Dcp基因弱表達(dá)的轉(zhuǎn)pCPM2300植株表現(xiàn)出高抗癥狀；圖7中A非轉(zhuǎn)基因植株；B、CpCPW2300轉(zhuǎn)基因植株；D、EpCPM2300轉(zhuǎn)基因植株；圖8中ApCPW2300轉(zhuǎn)基因植株高抗癥狀；BpCPM2300高抗癥狀；CpCPM2300轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)癥狀；DpCPW2300轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)癥狀；E非轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)癥狀；F非轉(zhuǎn)基因植株感染癥狀。從表3的數(shù)據(jù)和圖6-9的結(jié)果可以看出，發(fā)生cp基因失活的轉(zhuǎn)基因煙草比未失活的轉(zhuǎn)基因煙草有更多的植株表現(xiàn)完全免疫或高抗癥狀，表明了此方法在培育高抗病毒植物上的有效性。
序列表<160>2<210>1<211>731<212>DNA<213>馬鈴薯病毒X(Potexvirus，Potato virus X)<400>1gctctagaga tgtcagcacc agctagcaca acacagccca tagggtcaac tacctcaact 60accacaaaaa ctgcaggcgc aactcctgcc acagcttcag gcctgttcac catcccggat 120ggggatttct ttagtacagc ccgtgccata gtagccagca atgctgtcgc aacaaatgag 180gacctcagca agattgaggc tatttggaag gacatgaagg tgcccacaga cactatggca 240caggctgctt gggacttagt cagacactgt gctgatgtag gatcatccgc tcaaacagaa 300atgatagata caggtcccta ttccaacggc atcagcagag ctagactggc agcagcaatt 360aaagaggtgt gcacacttag gcaattttgc atgaagtatg ctccagtggt atggaactgg 420atgttaacta acaacagtcc acctgctaac tggcaagcac aaggtttcaa gcctgagcac 480aaattcgctg cattcgactt cttcaatgga gtcaccaacc cagctgccat catgcccaaa 540gaggggctca tccggccacc gtctgaagct gaaatgaatg ctgcccaaac tgctgccttt 600gtgaagatta caaaggccag ggcacaatcc aacgactttg ccagcctaga tgcagctgtc 660actcgaggtc gtatcactgg aacaacaacc gctgaggctg ttgtcactct accaccacca 720taaggtaccc c 731<210>2<211>序列的長(zhǎng)度<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gctctagaga tgtcagcgcc agcgagcaca acacagccca tagggtcaac tacctcaact 60accacaaaaa ctgcaggcgc gacgccggcg acagcgtcag gcctgttcac catcccggat 120ggggatttct ttagtacagc ccgtgccata gtagccagca atgctgtcgc aacaaatgag 180gacctcagca agattgaggc tatttggaag gacatgaagg tgcccacaga cactatggca 240caggctgctt gggacttagt cagacactgt gctgatgtag gatcatccgc tcaaacagaa 300atgatagata caggtcccta ttccaacggc atcagcagag ctagactggc ggcggcgatt 360aaagaggtgt gcacacttag gcaattttgc atgaagtatg ctccagtggt atggaactgg 420atgttaacga acaactcgcc gccggcgaac tggcaagcac aaggtttcaa gcctgagcac 480aaattcgctg cattcgactt cttcaatgga gtcaccaacc cagctgccat catgcccaaa 540
gaggggctca tccggccacc gtctgaagct gaaatgaatg ctgcccaaac tgctgccttt 600gtgaagatta caaaggccag ggcacaatcc aacgactttg ccagcctaga tgcagctgtc 660actcgaggtc gtatcactgg aacaacaacc gctgaggctg ttgtcactct accaccacca 720taaggtaccc c 73權(quán)利要求
1.一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟a.查閱宿主密碼子的使用頻率，確定稀有密碼子，修飾目的基因中的密碼子，把目的基因中某些密碼子突變成宿主植物中的稀有同義密碼子；b.構(gòu)建含有密碼子修飾目的基因的用于植物轉(zhuǎn)化的載體；c.轉(zhuǎn)化植物，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株；d.檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株，篩選目的基因發(fā)生基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株，獲得高抗病毒轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述載體中還含有選擇標(biāo)記基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述稀有密碼子為使用頻率在0-10‰之間的密碼子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述載體為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。
5.用權(quán)利要求1的方法得到的細(xì)胞系。
6.用權(quán)利要求1的方法得到的植株。
7.權(quán)利要求1的方法在植物育種中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1的方法在培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育高抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法與應(yīng)用，本發(fā)明的方法包括以下步驟a.查閱宿主密碼子的使用頻率，確定稀有密碼子，修飾目的基因中的密碼子，把目的基因中某些密碼子突變成宿主植物中的稀有同義密碼子；b.構(gòu)建含有密碼子修飾目的基因的用于植物轉(zhuǎn)化的載體；c.轉(zhuǎn)化植物，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株；d.檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株，篩選目的基因發(fā)生基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株，獲得高抗病毒轉(zhuǎn)基因植株。利用本發(fā)明的方法可以培育高效穩(wěn)定的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1519322SQ03100708
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月21日
發(fā)明者朱禎, 馮德江, 鄭翔, 朱 禎 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所