專利名稱：固相細(xì)胞裂解和捕獲平臺的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞分離細(xì)胞組分，如多肽和核酸。
重組DNA技術(shù)的最近進(jìn)展使得可能在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生大量肽。然而，從宿主細(xì)胞提取和分離靶肽、蛋白質(zhì)、核酸或者其他細(xì)胞組分到目前仍然是多步驟方法，包括首先裂解，然后一個或多個隨后步驟用以從其他細(xì)胞組分分離靶產(chǎn)物。
多種技術(shù)已經(jīng)用于裂解細(xì)胞，每種技術(shù)都具有某些優(yōu)點和缺點。例如，已經(jīng)使用了超聲處理、弗氏壓碎器、勻漿、研磨、冷凍-解凍裂解，和多種其他物理或機械裂解細(xì)胞的方法；參見，例如，Bollag & Edelstein，ProteinExtraction，Protein Methods，27-43(1993)；Schutte & Kula，Biotech.andApp.Biochem.，12559-620(1990)；和Hughes，等人，Methods inMicrobiology，5B1-54(1969)。然而，機械裂解需要可能不易得到的專門設(shè)備，此外，超聲處理也產(chǎn)生熱，其對于某些蛋白質(zhì)是有害的。酶和去污劑也已經(jīng)用于酶促或化學(xué)地裂解細(xì)胞；見，例如，Hughes，等人，Methodsin Microbiology，5B1-54；Andrews & Asenjo，Trends in Biotech.，5273-77(1987)；Wiseman，Process Biochem.，63-65(1969)；和Wolska-Mitaszko，等人，Analytical Biochem.，116241-47(1981)。
然而，酶或者去污劑溶液的加入導(dǎo)致含有待裂解細(xì)胞的溶液的稀釋，此外，所希望的產(chǎn)物必須仍然與所得膜碎片、不希望的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞殘渣分離。
類似地，多種親和捕獲方法已經(jīng)用于純化肽、蛋白質(zhì)和核酸。美國專利號4,569,794、5,310,663和5,594,115描述了包括組氨酸殘基的金屬螯合肽的用途，和所述肽在蛋白質(zhì)純化中的用途。美國專利號4,703,004、4,851,341、5,011,912和6,461,154描述了抗原性FLAG肽，和含有所述肽的蛋白質(zhì)的純化。美國專利號5,654,176描述了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶用于純化蛋白質(zhì)的用途。美國專利號5,998,155描述了抗生物素蛋白/生物素捕獲系統(tǒng)的用途。在每一種這些實例中，靶產(chǎn)物上的親和標(biāo)記或者序列與相應(yīng)配體的相互作用導(dǎo)致靶產(chǎn)物的“捕獲”。然后可以洗除未結(jié)合的組分和其他細(xì)胞殘渣，留下結(jié)合到標(biāo)記-或者序列-特異配體的靶產(chǎn)物。然后用特定洗脫劑釋放結(jié)合的靶產(chǎn)物，導(dǎo)致純化的靶產(chǎn)物。
不利地，與首先裂解宿主細(xì)胞然后純化靶產(chǎn)物有關(guān)的多個步驟增加了分離產(chǎn)物，特別是高通量應(yīng)用中分離產(chǎn)物所需的成本和時間。
發(fā)明概述因此，在本發(fā)明的多個方面，提供了裂解細(xì)胞和捕獲肽、蛋白質(zhì)、核酸或者其他細(xì)胞組分的相對快速、有效的方法。有利地，本發(fā)明的方法和容器不需要離心細(xì)胞溶液以除去可溶的材料、在額外的去污劑裂解液體或者酶抑制劑中吹吸(pipette)(從而稀釋原來的含有細(xì)胞的溶液)，或者進(jìn)行隨后的純化步驟。
因此，簡言之，本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的容器。所述容器含有口、內(nèi)表面，和至少一部分內(nèi)表面上裂解試劑的涂層(coating)，其中當(dāng)含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器中時，涂層中裂解試劑的量足夠形成能夠裂解宿主細(xì)胞的裂解溶液。在一個實施方案中，經(jīng)涂布的內(nèi)表面的面積與容器的體積之比小于約4mm2/μl。
另一方面，本發(fā)明涉及用于從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的容器。該容器含有口、內(nèi)表面、體積、裂解試劑和受支持的捕獲配體?？谧鳛橄蛉萜鲗?dǎo)入液體的入口和從容器除去液體的出口，捕獲配體在容器中的一個位置受到支持，當(dāng)含有完整宿主細(xì)胞或者固體細(xì)胞組分的液體懸浮物通過容器口導(dǎo)入容器時，所述位置允許捕獲配體接觸完整宿主細(xì)胞或者從其來源的固體細(xì)胞組分。
另一方面，本發(fā)明涉及用于從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的多孔板，其中多孔板的至少一個孔含有裂解試劑。裂解試劑(i)涂在孔的至少一部分內(nèi)表面上，或者(ii)為孔中所含的材料塊的形式。
另一方面，本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的方法。該方法包括(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，所述容器具有口、內(nèi)表面、體積、至少一部分內(nèi)表面上的裂解試劑涂層，經(jīng)涂布的內(nèi)表面的面積與容器的體積之比小于約4mm2/μl，和(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成細(xì)胞殘渣。
另一方面，本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的方法。該方法包括(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積、裂解試劑，和受支持的捕獲配體，其中口作為導(dǎo)入液體的入口和從容器除去液體的出口，(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成固態(tài)細(xì)胞殘渣；和(c)在固態(tài)細(xì)胞殘渣存在下用捕獲配體捕獲細(xì)胞組分。
在另一方面，本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的方法。該方法包括(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積、裂解試劑，和受支持的捕獲配體，其中口作為向容器導(dǎo)入液體的入口，(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成固態(tài)細(xì)胞殘渣；(c)在固態(tài)細(xì)胞殘渣存在下用捕獲配體捕獲細(xì)胞組分；(d)從捕獲配體釋放細(xì)胞組分，和(e)回收釋放的細(xì)胞組分。
另一方面，本發(fā)明涉及用于從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的試劑盒。該試劑盒包含本發(fā)明的容器，和從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的使用說明。在另一實施方案中，該試劑盒還含有用于從宿主細(xì)胞提取和/或分離細(xì)胞組分的額外試劑，和/或用于測定或檢測捕獲的細(xì)胞組分的試劑。
另一方面，本發(fā)明涉及制備用于從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的容器的方法，該方法包括將容器的內(nèi)表面與含有裂解試劑的液體接觸并干燥液體以在容器的內(nèi)表面上形成裂解試劑的吸附層。
本發(fā)明的其他目標(biāo)和特征將部分在下文中是顯然的，部分在下文中指出。
附圖簡述

圖1描繪了從HIS-SelectTM高容量板洗脫的物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠圖像。裂解試劑在板的表面上干燥并加入0.1ml細(xì)胞。每個泳道的含量在表1中描述。該圖表明在粗裂解細(xì)胞的存在下蛋白質(zhì)可以結(jié)合到板。在這些條件下可以結(jié)合增量蛋白質(zhì)并用不同試劑洗脫。
圖2描繪了從HIS-SelectTM高容量板洗脫的物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠圖像。將裂解試劑(0.05ml)在板表面上干燥，并向每孔加入0.1ml細(xì)胞或者純蛋白質(zhì)。表3中描述了每個泳道的含量。該圖表明存在和不存在粗裂解細(xì)胞時可以結(jié)合蛋白質(zhì)?？梢栽谶@些條件下結(jié)合和洗脫增量蛋白質(zhì)。
圖3描繪了從HIS-SelectTM高容量板洗脫的物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠圖像。將裂解試劑(0.1ml)在板表面上干燥，并向每孔加入0.1ml細(xì)胞或者純蛋白質(zhì)。表3中描述了每個泳道的含量。該圖表明存在和不存在粗裂解細(xì)胞時可以結(jié)合蛋白質(zhì)?？梢栽谶@些條件下結(jié)合和洗脫增量蛋白質(zhì)。
圖4描繪了使用ANTI-FLAGM2高靈敏性板，來自酶免疫檢測測定的校正吸收(A450)讀數(shù)。圖上具條紋的條形代表具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)果；具有水平線的條形代表具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)/his標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)果；白色條形代表具有his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)果。所用的裂解試劑在實施例4中描述，并通過字母A-H在圖上表示。
圖5描繪了使用HIS-SelectTM高容量板，來自酶免疫檢測測定的校正吸收(A450)讀數(shù)。圖上具條紋的條形代表具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)果；具有水平線的條形代表具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)/his標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)果；白色條形代表具有his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)果。所用的裂解試劑在實施例4中描述，并通過字母A-H在圖上表示。
圖6描繪從HIS-SelectTM容量板洗脫的物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠圖像。將裂解試劑、處理試劑和酶的多種組合在HIS-SelectTM高容量板表面上干燥，并加入含有靶蛋白的細(xì)胞。表6中描述了每個泳道的含量。該圖表明多種裂解試劑能夠裂解細(xì)胞，并且從HIS-SelectTM高容量板成功捕獲和洗脫靶蛋白。
圖7描繪了本發(fā)明的容器。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述1.容器通常，本發(fā)明的容器適于容納液體，該容器包含底部、口和側(cè)壁結(jié)構(gòu)(sidewall formation)。在一個實施方案中，側(cè)壁結(jié)構(gòu)可以具有任意多種幾何形狀；例如，在本實施方案中，側(cè)壁結(jié)構(gòu)可以是圓柱狀、多邊形、錐形或者凹形(例如，半球形)。類似地，在一個實施方案中，底部可以具有任意多種幾何形狀，例如，在本實施方案中，底部可以是平的、曲線形或者甚至含有一個點(例如，倒置圓錐的最低點)?？谧鳛殚_口，液體可以通過其導(dǎo)入容器；在一個實施方案中，口和底部可以是側(cè)壁結(jié)構(gòu)的相反末端，口由側(cè)壁結(jié)構(gòu)頂部的開口定義。因此，在其多種實施方案中，容器可以是圓柱、燒瓶、罐、杯、管瓶、瓶子、柱形或者甚至表面凹陷狀。此外，所述容器可以是一個獨立式的容器，或者其可以是許多物理上結(jié)合的容器之一。因此，在一個實施方案中，容器為單一多孔板的一個孔，所述多孔板為諸如48孔、96孔、384孔、1536孔等多孔板。而且，容器可以具有永久密閉的底部或者底部可以包含帶閥門或者有蓋的開口，液體可以任選通過所述開口除去。
用于提取或提取和親和捕獲肽、蛋白質(zhì)、核酸或者其他細(xì)胞組分的容器可以為多種尺寸并且不需要含有大體積液體。通常，容器將容納小于50L的體積。在一個實施方案中，容器將容納不多于1L但是不小于1.0μl的體積。在另一實施方案中，容器將容納約10μl到約100ml體積。
包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部的容器的內(nèi)表面限定了容器的液體容量。在一個實施方案中，容器的內(nèi)表面限定的表面積與內(nèi)表面限定的體積之比小于約4mm2/μl。在另一實施方案中，容器的內(nèi)表面限定的表面積和體積的比不超過約3mm2/μl。在另一實施方案中，容器的內(nèi)表面限定的表面積和體積的比不超過約2mm2/μl。在另一實施方案中，容器的內(nèi)表面限定的表面積和體積的比不超過約1mm2/μl。
根據(jù)計劃的用途和操作人員的偏愛，容器可以任選密封。因此，在一個實施方案中，容器含有蓋子和帽子，其套在口上以將容器的內(nèi)含物與周圍環(huán)境隔離。在另一實施方案中，容器的頂部對環(huán)境是開放的。從而，例如，當(dāng)容器是多孔板形式時，(i)每個孔可以由單獨的蓋子(例如，塑料蓋包裝材料)密封，(ii)可以通過共同的蓋子密封一部分和多個孔，留下剩余部分的孔對周圍環(huán)境開放，(iii)通過共同的蓋子密封所有孔，或者(iv)所有孔都可以對周圍環(huán)境開放。此外，蓋子可以含有用于向容器導(dǎo)入液體的單個口，或者其可以含有用于向容器導(dǎo)入或者導(dǎo)入和除去液體的多個口。在另一實施方案中，當(dāng)容器的底部含有開口，通過該開口可以任選除去容器中的液體時，容器的口和底部可以都任選加蓋。
通常，可以從多種天然或合成材料形成容器。例如，容器可以是塑料、硅、玻璃、金屬、陶瓷、磁體、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、纖維素、硝酸纖維素、乳膠，等等。
2.捕獲配體和產(chǎn)物純化一旦已經(jīng)裂解宿主細(xì)胞，可以通過使用固定在容器中支持材料上的捕獲配體從其他細(xì)胞殘渣分離細(xì)胞組分。通過容器的內(nèi)表面或者通過置于容器內(nèi)、附著到容器或者其他方式保持在容器中的珠子或者其他支持體直接或間接支持捕獲配體。在一個實施方案中，捕獲配體位于容器的底部上面。在另一實施方案中，捕獲配體位于側(cè)壁結(jié)構(gòu)上。在另一實施方案中，捕獲配體位于容器的底部和側(cè)壁結(jié)構(gòu)上。在另一實施方案中，受支持的捕獲配體位于容器中某一位置，該位置允許捕獲配體暴露于可以存在于容器中的完整宿主細(xì)胞或者從其來源的固體細(xì)胞組分。
有利地，本發(fā)明的試劑、組分和方法允許使用一系列捕獲配體。在一個優(yōu)選實施方案中，捕獲配體能夠分離含有細(xì)胞殘渣的液體懸浮物中的細(xì)胞組分。
用于純化蛋白質(zhì)、肽、DNA、RNA或其他細(xì)胞組分的多種技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且可以與本文描述的容器和方法聯(lián)合使用。見，例如，Becker，等人，Biotech.Advs.，1247-61(1983)。在一個實施方案中，可以使用任意捕獲方法，只要裂解試劑的存在不干擾結(jié)合。例如，蛋白質(zhì)純化的常用方法包括產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，其含有靶蛋白和能夠以高特異性結(jié)合親和基質(zhì)的親和標(biāo)記。從而，一方面，本發(fā)明的容器含有受支持的捕獲配體，其能夠以高特異性結(jié)合靶蛋白或者肽的親和標(biāo)記，從而導(dǎo)致靶蛋白或肽與其他蛋白質(zhì)或者細(xì)胞殘渣的分離。在一些情況中，靶蛋白或者肽天然地含有能夠結(jié)合相應(yīng)捕獲配體的序列。在該情況中，蛋白質(zhì)不必是重組的，只要存在能夠結(jié)合靶蛋白或者肽的捕獲配體?？梢杂糜诓东@蛋白質(zhì)或者肽的熟知的親和捕獲系統(tǒng)的一些特定實例包括(i)金屬螯合層析(例如，鎳或者鈷與組氨酸標(biāo)記相互作用)，(ii)免疫原性捕獲系統(tǒng)，如使用抗原-抗體相互作用的捕獲系統(tǒng)(例如，F(xiàn)LAG肽、c-myc標(biāo)記、HA標(biāo)記，等等)，(iii)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)捕獲系統(tǒng)，和(iv)生物素-抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白捕獲系統(tǒng)。其他技術(shù)包括離子交換層析，包括陰離子和陽離子交換，以及疏水層析，和親硫?qū)游?。也可以使用這些多種捕獲方法的組合，如使用混合模式的層析。這些技術(shù)是常用于純化蛋白質(zhì)的一些技術(shù)。疏水層析、離子交換層析、和多種雜交技術(shù)，如利用對靶DNA或RNA特異的核苷酸序列的雜交技術(shù)，也通常用于純化DNA和RNA。另一種常用的RNA捕獲方法是聚(dT)。因為這些和其他捕獲系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，所有它們僅在本文中簡要描述。
固定化金屬親和層析(“IMAC”)使用蛋白質(zhì)內(nèi)某些殘基對金屬離子的親和性純化蛋白質(zhì)。在IMAC中，將金屬離子固定在固相支持體上，并用于捕獲含有金屬螯合肽的蛋白質(zhì)。金屬螯合肽可以在蛋白質(zhì)中天然發(fā)生，或者蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)，其具有含有金屬螯合肽的親和標(biāo)記。一些最常用的金屬離子包括鎳(Ni2+)、鋅(Zn2+)、銅(Cu2+)、鐵(Fe3+)、鈷(Co2+)、鈣(Ca2+)、鋁(Al3+)、鎂(Mg2+)、錳(Mn2+)和鎵(Ga3+)。從而，在一個實施方案中，容器和/或支持體含有固定在其表面或者部分表面上的金屬離子，其中金屬離子選自鎳(Ni2+)、鋅(Zn2+)、銅(Cu2+)、鐵(Fe3+)、鈷(Co2+)、鈣(Ca2+)、鋁(Al3+)、鎂(Mg2+)、錳(Mn2+)和鎵(Ga3+)。優(yōu)選地，金屬離子是鎳、銅、鈷、或者鋅。最優(yōu)選地，金屬離子是鎳。
以這種方法可以純化含有金屬螯合肽的多種蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，金屬螯合肽可以具有式His-X，其中X選自Gly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe、Met、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、和Pro，如在Smith，等人(1986)美國專利號4,569,794中更完整描述，將所述專利并入本文作為參考。金屬螯合肽還可以具有式(His-X)n，其中X選自Asp、Pro、Glu、Ala、Gly、Val、Ser、Leu、Ile或Thr，n為3到6，如在Sharma，等人(1997)美國專利號5,594,115中更完整描述，將所述專利并入本文作為參考。在另一個實施方案中，金屬螯合肽包括式(His)y的聚(His)標(biāo)記，其中y為至少2-6，如在Dobeli，等人(1994)美國專利號5,310,663中更完整描述，將所述專利并入本文作為參考。金屬螯合肽的其他實例將是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在一個實施方案中，捕獲配體是如WO 01/81365中描述的金屬螯合物。更具體地，在該實施方案中，捕獲配體是來源于金屬螯合物成分(1)的金屬螯合物 (I)其中Q是載體；S1是間隔區(qū)(spacer)；L是-A-T-CH(X)-或-C(＝O)-；A是醚、硫醚、硒醚或者酰胺鍵；T是鍵或者經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基或者鏈烯基；X是-(CH2)kCH3、-(CH2)kCOOH、-(CH2)kSO3H、-(CH2)kPO3H2、-(CH2)kN(J)2、或-(CH2)kP(J)2、優(yōu)選-(CH2)kCOOH或-(CH2)kSO3H；k為0到2的整數(shù)；J為烴基或者取代烴基；Y為-COOH、-H、-SO3H、-PO3H2、-N(J)2、或-P(J)2，優(yōu)選-COOH；Z為-COOH、-H、-SO3H、-PO3H2、-N(J)2或-P(J)2，優(yōu)選-COOH；和i為0到4的整數(shù)，優(yōu)選1或2。
通常，載體Q可以包含能夠衍生化以偶聯(lián)的任意固態(tài)或者可溶材料或者化合物。固體(或者不可溶)載體可以選自瓊脂糖、纖維素、異丁烯酸共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯、紙、聚酰胺、聚丙烯腈、聚乙二烯、聚砜、硝酸纖維素、聚酯、聚乙烯、硅、玻璃、乳膠、塑料、金、氧化鐵和聚丙烯酰胺，但是也可以是能夠衍生化以允許組分的剩余部分偶聯(lián)到載體Q的任意不溶或者固體化合物?？扇苄暂d體包括蛋白質(zhì)、核酸，包括DNA和RNA，和寡核苷酸、脂類、脂質(zhì)體、合成的可溶性聚合物、蛋白質(zhì)、聚氨基酸、白蛋白、抗體、酶、鏈霉抗生物素蛋白、肽、激素、生色染料、熒光染料、熒光染料或任意其他檢測分子、藥物、小有機化合物、多糖和任意其他可溶化合物，這些可溶性載體能夠衍生化以允許組分的剩余部分偶聯(lián)到載體Q。在一個實施方案中，載體Q是本發(fā)明的容器。在另一實施方案中，載體Q是本發(fā)明的容器內(nèi)提供的物體。
載體側(cè)翼的間隔區(qū)S1含有原子鏈，其可以是飽和或不飽和的，經(jīng)取代或未取代的、線性或環(huán)狀的、或者直鏈或分枝的。通常，限定間隔區(qū)S1的原子鏈由不超過約25個原子組成；換句話說，間隔區(qū)的主鏈由不超過25個原子組成。更優(yōu)選地，限定間隔區(qū)S1的原子鏈由不超過約15個原子，更優(yōu)選不超過約12個原子組成。限定間隔區(qū)S1的鏈原子通常選自碳、氧、氮、硫、硒、硅和磷，優(yōu)選選自碳、氧、氮、硫和硒。此外，鏈原子可以用不同于氫的原子，如羥基、酮基(＝O)或者?；?，如乙?；〈蛘呤俏慈〈?。從而，鏈可以任選包括烴基或者取代烴基區(qū)之間的一個或多個醚、硫醚、硒醚、酰胺或者胺鍵。代表性間隔區(qū)S1包括亞甲基、亞烷基氧基(-(CH2)aO-)、亞烷基硫醚(-(CH2)aS-)、亞烷基硒醚(-(CH2)aSe-)、亞烷基酰胺(-(CH2)aNR1C(＝O)-)、亞烷基羰基(-(CH2)aC(＝O)-)，和它們的組合，其中a通常為1到約20，R1為氫或者烴基，優(yōu)選烷基。在一個實施方案中，間隔區(qū)S1是親水的中性結(jié)構(gòu)并且不含有任何酰胺鍵或者取代基或者在多肽的純化期間可以帶電的其他鍵或者取代基。
如上面提到的，接頭L可以是-A-T-CH(X)-或-C(＝O)-。當(dāng)L是-A-T-CH(X)-時，螯合成分相應(yīng)于式 其中Q、S1、A、T、X、Y和Z如前面定義。在該實施方案中，醚(-O-)、硫醚(-S-)、硒醚(-Se-)或酰胺(-NR1C(＝O)-)或(-C(＝O)NR1-)其中R1是氫或烴基)鍵通過取代或未取代的烷基或鏈烯基區(qū)與分子的螯合部分分開。如果T不是鍵，那么T優(yōu)選是取代或未取代的C1到C6烷基或者取代或未取代的C2到C6鏈烯基。更優(yōu)選地，A為-S-、T為-(CH2)n-，n為0到6，通常0到4的整數(shù)，更通常0、1或2。當(dāng)L為-C(＝O)-時，螯合成分相應(yīng)于式 其中Q、S1、i、Y和Z如前面定義。
在優(yōu)選實施方案中，序列-S1-L-聯(lián)合是不超過約35個原子的鏈，所述原子選自碳、氧、硫、硒、氮、硅和磷，更優(yōu)選僅碳、氧、硫和氮，更優(yōu)選僅碳、氧和硫。為了減小非特異結(jié)合的可能性，當(dāng)存在氮時，其優(yōu)選為酰胺部分形式。此外。如果碳鏈原子用氫之外的任何其他原子取代，它們優(yōu)選用羥基或者酮基取代。在優(yōu)選實施方案中，L含有來自氨基酸或者其酯如甲酯或乙酯的部分(有時稱作片段或殘基)，所述氨基酸為例如，胱氨酸、同型胱氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、天冬氨酸、半胱磺酸。
代表性螯合物成分包括下面的




其中Q為載體，Ac為乙?；?br> 在另一實施方案中，捕獲配體為美國專利號5,047,513中描述類型的金屬螯合物。更具體地，在該實施方案中，捕獲配體為式NH2-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COOH)2的氨三乙酸衍生物的金屬螯合物。
其中x為2、3或4。在該實施方案中，氨三乙酸衍生物固定在任一種前述載體Q上。
在其中捕獲配體為WO 01/81365或美國專利號5,047,513中描述的金屬螯合物的這些實施方案中，金屬螯合物優(yōu)選含有選自鎳(Ni2+)、鋅(Zn2+)、銅(Cu2+)、鐵(Fe3+)、鈷(Co2+)、鈣(Ca2+)、鋁(Al3+)、鎂(Mg2+)、錳(Mn2+)的金屬離子。在尤其優(yōu)選的實施方案中，金屬螯合物含有鎳(Ni2+)。
可用于本發(fā)明上下文中的另一種常規(guī)純化技術(shù)是使用免疫原性捕獲系統(tǒng)。在此類系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)或者肽上的表位標(biāo)記允許基于表位標(biāo)記對支持體上固定的相應(yīng)配體(例如，抗體)的親和力純化附著的蛋白質(zhì)。此類標(biāo)記的一個實例是序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)；對該序列具有特異性的抗體由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)以FLAG商標(biāo)出售；此類標(biāo)記的另一個實例是序列Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，或DLYDDDDK(SEQ.ID.NO.2)；對該序列具有特異性的抗體由Invitrogen(Carlsbad，CA)出售。此類標(biāo)記的另一實例是3X FLAG序列Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ.ID.NO.3)；對該序列具有特異性的抗體由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)出售。從而，在一個實施方案中，容器含有對SEQ.ID.NO.1具有特異性的固定化抗體；在另一實施方案中，容器含有對SEQ.ID.NO.2具有特異性的固定化抗體。在另一實施方案中，容器含有對SEQ.ID.NO.3具有特異性的固定化抗體。例如，在另一實施方案中，由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)出售的ANTI-FLAGM1、M2或M5抗體固定在該容器的內(nèi)表面或者其一部分上，和/或容器內(nèi)的珠子或者其他支持體上。
其他標(biāo)記也可以基于它們對附著到基底的相應(yīng)配體的親和性用于純化重組蛋白質(zhì)。此類其他標(biāo)記的一些實例包括c-myc、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、A型流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)和β-半乳糖苷酶等等。通過相應(yīng)配體附著到本發(fā)明的容器和/或支持體，可以從其他蛋白質(zhì)和細(xì)胞殘渣純化含有這些親和標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)，如本文描述。通過將對蛋白質(zhì)或者肽序列或者該序列的部分具有親和性的配體附著到本發(fā)明的容器和/或支持體，可以以類似方式純化非重組蛋白質(zhì)。適宜配體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。
在另一實施方案中，通過將含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的蛋白質(zhì)與固定化谷胱甘肽接觸可以純化所述蛋白質(zhì)。由于GST對其底物的親和力，蛋白質(zhì)得到純化。此類系統(tǒng)更完整地在例如，美國專利號5,654,176中描述，將所述專利并入本文作為參考。從而，在另一實施方案中，谷胱甘肽固定在該容器的內(nèi)表面或者其一部分上，和/或容器內(nèi)的珠子或者其他支持體上。
通過使用生物素或生物素類似物聯(lián)合抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的衍生物也可以純化蛋白質(zhì)。例如，在一個實施方案中，當(dāng)鏈霉抗生物素蛋白固定在本發(fā)明的容器和/或支持體上時，可以基于生物素對鏈霉抗生物素蛋白的親和性純化生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。類似地，如美國專利號5,506,121(并入本文作為參考)描述的含有鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以基于標(biāo)記對鏈霉抗生物素蛋白的親和性純化。在另一實施方案中，當(dāng)生物素固定在本發(fā)明的容器和/或固體支持體上時，可以基于生物素對抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的親和性純化含有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的蛋白質(zhì)?？股锼氐鞍?生物素或生物素/鏈霉抗生物素蛋白親和純化技術(shù)的使用是本領(lǐng)域熟知的，并且描述于例如，Sambrook和Russell，Molecular CloningA LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，2001。
使用離子交換層析或者疏水層析也可以純化蛋白質(zhì)和DNA或RNA。在離子交換層析中，固定在固相支持體上的帶電顆?？赡娼Y(jié)合具有表面電荷的蛋白質(zhì)或者DNA。例如，離子交換捕獲配體可以含有氮基、羧基、磷酸基，或者磺酸基團。離子交換捕獲配體的實例包括二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基[2-羥基丙基]氨基乙基(QAE)、羧基甲基(CM)和磺基丙基(SP)和磷酰基。在疏水層析中，基于與固定在固相支持體上的不可溶疏水基團的疏水相互作用純化在表面具有疏水基團的蛋白質(zhì)或者DNA。疏水配體的實例為硅、苯基、己基、辛基和C18基團。從而，在一個實施方案中，帶電顆粒固定在本發(fā)明的容器和/或支持體的表面上。在另一實施方案中，不溶性疏水基團固定在本發(fā)明的容器和/或支持體的表面上。
其他適宜的捕獲配體包括例如，激素、氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、多肽、凝集素、酶、酶底物、酶抑制劑、輔因子、核苷酸、寡核苷酸(例如，寡脫氧胸苷酸)、多核苷酸、糖、糖類、寡糖、藥物和染料。
多種其他純化技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且可以與本發(fā)明的容器和方法聯(lián)合使用。一些此類技術(shù)在例如，Kenney & Fowell，Methods in MolecularBiology，卷11，Practical Protein Chromatography(1992)；Hanson &Ryden，Protein PurificationPrinciples，High Resolution Methods，andApplications(1989)；Dean，等人，Affinity ChromatographyA PracticalApproach(1987)；Hermanson，等人，Immobilized Affinity LigandTechniques(1992)；和Jakoby & Wilchek，Affinity Techniques，EnzymePurification，Part B，in Methods in Enzymology，卷34(1974)中描述。
一旦細(xì)胞組分結(jié)合到捕獲配體，可以例如，通過使用水或緩沖液洗除細(xì)胞殘渣。洗滌后，結(jié)合的細(xì)胞組分可以從其與捕獲配體的結(jié)合釋放并且除去用于表征或定量。靶細(xì)胞組分的釋放可以使用多種洗脫技術(shù)完成，所述技術(shù)包括改變pH或溫度，或者通過競爭結(jié)合。特定洗脫技術(shù)將根據(jù)所用的捕獲系統(tǒng)而變，但是將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。備選地，當(dāng)捕獲的組分仍然附著到固定化配體時可以檢測所述組分。多種分析技術(shù)是公知的，包括，例如，ELISA、酶分析，和蛋白質(zhì)檢測等等。
3.聚合物涂層在一個實施方案中，捕獲配體直接結(jié)合容器的內(nèi)表面。備選地，捕獲配體可以結(jié)合覆蓋容器表面的聚合物基質(zhì)。換句話說，捕獲配體可以直接結(jié)合聚合物基質(zhì)，其又結(jié)合或固定到容器的內(nèi)表面上。例如，捕獲配體可以是金屬螯合成分，其結(jié)合到衍生化葡聚糖聚合物基質(zhì)，所述基質(zhì)覆蓋聚苯乙烯或者其他塑料底質(zhì)。從而，聚合物基質(zhì)可以用于增加有效表面積(通過具有比下面的底質(zhì)呈現(xiàn)更大表面積的基質(zhì))，從而使得捕獲配體的密度增加。備選地，或者額外地，聚合物基質(zhì)可以比容器壁具有更大或更小疏水性從而呈現(xiàn)比基底的天然表面具有更大(或備選地更小)疏水性的表面。
通過多種方法可以形成或應(yīng)用聚合物涂層。例如，通過原位聚合可以形成聚合物涂層；在該方法中，單體混合物溶于含有引發(fā)劑的溶劑中，激活后，在容器壁的表面上進(jìn)行聚合。備選地，可以將完全生長的聚合物固定在容器壁的表面上。此類方法在例如，Sundberg等人，美國專利號5,624,711中描述。
在其中應(yīng)用聚合物涂層的優(yōu)選實施方案中，聚合物涂層來源于結(jié)合容器壁的兩種聚合物的混合物。通常，一種或兩種此類聚合物含有反應(yīng)基，其受到活化時將含有此類反應(yīng)基的聚合物分子化學(xué)地結(jié)合到容器壁和/或所述分子自身交聯(lián)或與其他聚合物分子交聯(lián)。此外，一種或兩種此類聚合物可以含有可活化基團，其提供本文描述的捕獲配體的附著點。此類聚合物涂層和它們的形成方法一般在美國專利申請公開號2003/0032013 A1中描述。
通過選擇所用的具體聚合物和反應(yīng)基的量可以控制基底上聚合物基質(zhì)的密度?？梢赃x擇和調(diào)節(jié)反應(yīng)基的數(shù)目和類型和捕獲配體的數(shù)目和分子量，如下文詳細(xì)描述。聚合物基質(zhì)可以附著到基底的全部或者僅基底的一部分。例如，可以為容器壁的僅一部分或者多孔板壁的僅一部分孔提供聚合物基質(zhì)。
從聚合物混合物形成的聚合物基質(zhì)通過將容器基底與含有具有重復(fù)單位的多種聚合物分子的聚合物組合物接觸可以制備含有聚合物基質(zhì)的容器，其中至少一些聚合物分子具有共價連接該分子的至少一種反應(yīng)基，其中至少一些聚合物分子具有共價連接該分子的至少一種捕獲配體(或者可激活基團)，其中聚合物分子具有至少100kDa的平均分子量，并且其中至少25％的聚合物分子具有至少一種反應(yīng)基和共價連接到所述分子的至少一種捕獲配體。反應(yīng)基經(jīng)激活而將至少一些聚合物分子直接共價結(jié)合到容器基底和誘導(dǎo)聚合物分子之間交聯(lián)形成附著到容器基底的聚合物基質(zhì)。
通常，聚合物基質(zhì)可以包括天然聚合物(或者其衍生物)、合成聚合物(或者其衍生物)、天然聚合物(或者其衍生物)的混合物、合成聚合物(或者其衍生物)的混合物、或者一種或多種天然聚合物(或者其衍生物)與一種或多種合成聚合物(或者其衍生物)的混合物。通常，天然聚合物是在生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的分枝或線性聚合物。天然聚合物的實例包括，但不限于，寡糖、多糖、肽、蛋白質(zhì)、糖原、葡聚糖、肝素、支鏈淀粉、直鏈淀粉、果膠、果膠多糖、淀粉、DNA、RNA和纖維素。可以使用的具體經(jīng)修飾的天然聚合物為使用高碘酸氧化和還原性胺化或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方法將賴氨酸共價插入到葡聚糖分子的可變線性位置產(chǎn)生的葡聚糖-賴氨酸衍生物。相比，合成聚合物是人造分枝或者線性聚合物。合成聚合物的實例包括加成、縮合或者催化劑驅(qū)動的聚合反應(yīng)，即縮合聚合產(chǎn)生的塑料、高彈體和粘合劑、寡聚物、均聚物和共聚物。不管是天然的或合成的，聚合物都可以通過氧化、或者共價附著光反應(yīng)基、親和配體、離子交換配體、疏水配體、其他天然或者合成聚合物，或者間隔區(qū)分子進(jìn)行衍生或修飾。
從而，聚合物基質(zhì)可以含有幾種不同的聚合物類型的一種或多種。代表性聚合物包括，但不限于，基于纖維素的產(chǎn)物，如羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、乙酸纖維素和丁酸纖維素；丙烯酸類產(chǎn)物，如從丙烯酸羥基乙酯、異丁烯酸羥基乙酯、丙烯酸甘油酯、異丁烯酸甘油酯、丙烯酸、異丁烯酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺聚合的產(chǎn)物；基于乙烯基的產(chǎn)物，如聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇；尼龍，如聚己內(nèi)酰胺、聚十二烷基內(nèi)酰胺、聚己二酰己二胺和聚己二酰十二碳二胺；聚氨基甲酸酯；聚乳酸；線性多糖，如直鏈淀粉、葡聚糖、殼聚糖、肝素和透明質(zhì)酸；和支鏈多糖，如支鏈淀粉、透明質(zhì)酸和半纖維素?？梢允褂脙煞N和多種不同聚合物分子的混合物。例如，在一個實施方案中，聚合物分子是葡聚糖和肝素的混合物。在另一實施方案中，葡聚糖與聚Lys-Gly(每20個甘氨酸一個賴氨酸)混合。
通常，聚合物分子優(yōu)選具有至少100kDa的平均分子量(聚合物的總分子量，包括共價連接的官能團)。在一些實施方案中，聚合物分子具有300kDa到6,000kDa的平均分子量。在一些實施方案中，聚合物分子具有400kDa到3,000kDa的平均分子量。在另一實施方案中，聚合物分子具有500kDa到2,000kDa的平均分子量，其中平均分子量是使用多角度光散射和折射率檢測，通過凝膠過濾層析測量的聚合物的重量平均摩爾質(zhì)量(Mw)值。存在的所有鏈長度的聚合物分布的平均Mw基于通過折射率測量的峰的選擇，開始和結(jié)束峰選擇標(biāo)準(zhǔn)為折射率基線三倍的折射率值。如通過實例所示，優(yōu)選的聚合物可以具有1,117kDa的Mw，分子量范圍為112kDa到19,220kDa。
在一個實施方案中，通過固定化聚合物的混合物形成聚合物基質(zhì)，其中混合物中的一部分聚合物分子含有捕獲配體或者可活化基團，使得能夠隨后共價連接捕獲配體，混合物中不同部分的聚合物分子具有共價連接到所述聚合物分子的至少一個反應(yīng)基(用于將聚合物附著到容器壁和如前所述的交聯(lián))。聚合物分子之間反應(yīng)基的相互作用使得形成三維基底。反應(yīng)基熱化學(xué)或光化學(xué)地反應(yīng)(含有光反應(yīng)基的聚合物稱作被光標(biāo)記)。
當(dāng)聚合物分子具有共價連接的捕獲配體(或者可活化基團)時，捕獲配體(或者可活化基團)與聚合物重復(fù)單位的比優(yōu)選分別為約1∶1捕獲到約1∶100。例如，在一個實施方案中，捕獲配體(或者可活化基團)與聚合物重復(fù)單位的比優(yōu)選分別為約1∶1捕獲到約1∶20。當(dāng)聚合物分子具有共價連接的反應(yīng)基時，反應(yīng)基與聚合物重復(fù)單位的比優(yōu)選小于約1∶600，更優(yōu)選地，反應(yīng)基與聚合物重復(fù)單位的比優(yōu)選小于約1∶200。
代表性反應(yīng)基包括，但不限于，用于制備層析介質(zhì)的反應(yīng)基，其包括環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、N-羥基琥珀酰亞胺、醛、肼、馬來酰亞胺、硫醇、氨基、鹵代烷、異硫氰酸酯、碳二亞胺、重氮化合物、tresyl chloride、甲苯磺酰氯，和三氯-S-三嗪。優(yōu)選的反應(yīng)基為α，β不飽和酮光反應(yīng)性基團。代表性光反應(yīng)性基團包括芳基疊氮化物、diazarenes、β-羰基重氮和二苯酮。反應(yīng)性種類為氮賓、卡賓和基。這些反應(yīng)性種類通常能形成共價鍵。優(yōu)選的光反應(yīng)基為光可激活的不飽和酮，如苯乙酮、二苯酮和它們的衍生物。光反應(yīng)基當(dāng)與光接觸時能夠被活化，并且能夠共價連接到固體基底的表面。例如，通過暴露于約3焦耳/cm2到約6焦耳/cm2的紫外線可以活化光反應(yīng)基，這取決于光的強度和暴露時間的長度。根據(jù)光源的強度，暴露時間可以為低至0.5秒/cm2到約32分鐘/cm2。在優(yōu)選實施方案中，光反應(yīng)基通過暴露于約1000毫瓦/cm2到約5000毫瓦/cm2，或約1000毫瓦/cm2到約3000毫瓦/cm2，或約1500毫瓦/cm2到約2500毫瓦/cm2的光下0.5秒/cm2到約5秒/cm2受到激活。
在一個實施方案中，捕獲配體和/或反應(yīng)基通過間隔區(qū)共價附著到聚合物分子。當(dāng)與聚合物基質(zhì)的形成結(jié)合使用時，間隔區(qū)是分子或者共價結(jié)合的分子的組合，所述分子連接聚合物分子和一個或多個捕獲配體或者反應(yīng)基。間隔區(qū)可以與聚合物、聚合物組合物或者聚合物基質(zhì)相同或不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可以利用許多類型的間隔區(qū)并且其選擇和用途取決于聚合物基質(zhì)的計劃的應(yīng)用，例如，賴氨酸分子或者氨基己酸分子。
間隔區(qū)可以通過許多不同的化學(xué)(包括酰胺形成)共價附著到光反應(yīng)基。例如，烴間隔區(qū)的使用極大地增強了聚合物基質(zhì)穩(wěn)定性性能。具有間隔區(qū)的光反應(yīng)基可以通過酰胺鍵以相對于總單體——葡萄糖的受控制的比例偶聯(lián)到優(yōu)選的聚合物葡聚糖的伯胺部分。具有間隔區(qū)的光反應(yīng)基的實例包括，但不限于，苯并苯甲酸氨基己酸、N-琥珀酰亞胺基-N’-(4-疊氮基-水楊基)-6-氨基己酸、N-琥珀酰亞胺基-(4-疊氮基-2-硝基苯基)-氨基丁酸，和N-琥珀酰亞胺基-(4-疊氮基-2-硝基苯基)-6-氨基己酸。這些具有間隔區(qū)的光反應(yīng)基可以與聚合物反應(yīng)產(chǎn)生包括賴氨酸的間隔區(qū)和附著到光反應(yīng)基的最初間隔區(qū)。在附著含有或者不含有額外的間隔區(qū)的光反應(yīng)基之前，通過摻入多種分子，如賴氨酸和氨基己酸也可以生產(chǎn)間隔區(qū)。共價附著聚合物分子的反應(yīng)基的實例是含有通過損失氨基的活性氫結(jié)合到反應(yīng)基的一個或多個化學(xué)實體的賴氨酸部分或殘基的間隔區(qū)。在一個實施方案中，賴氨酸間隔區(qū)貢獻(xiàn)的伯胺的密度代表所希望的捕獲配體和反應(yīng)基的密度。通過本領(lǐng)域公知的方法可以產(chǎn)生含有伯胺或者其他部分的經(jīng)修飾的聚合物，所述其他部分為例如每1到100個聚合物重復(fù)單位1個部分的間隔區(qū)。修飾這些部分以選擇性摻入目的量的反應(yīng)基也是公知的。例如，賴氨酸間隔區(qū)貢獻(xiàn)的伯胺的密度平均對于葡聚糖聚合物的每12個重復(fù)葡萄糖單位為1。該密度相對于光反應(yīng)基的所希望的摻入是非常高的，所述所希望的摻入為例如，每200個重復(fù)單體小于1個光反應(yīng)基。聚合物生產(chǎn)期間溶液中伯胺的濃度可以為4.5微摩爾/ml，而光反應(yīng)基的所希望的摻入將代表0.09微摩爾/ml。因此，在該情況中，對于通過活性酯的所希望的光反應(yīng)基摻入將有50倍過量伯胺。在胺的該濃度下，通過活性酯以所希望的摻入水平加入光反應(yīng)基導(dǎo)致90％以上的摻入效率。通過改變含有活性酯的光反應(yīng)基的量，可以始終如一地實現(xiàn)每200個單體小于1個反應(yīng)基的任意摻入水平。將每個剩余間隔區(qū)部分或者胺有效轉(zhuǎn)化成捕獲配體附著點所需的方法是本領(lǐng)域公知的。數(shù)倍過量胺活性(例如活性酯)衍生試劑用于直接一步或者通過幾步附著捕獲配體。在一些情況中，衍生試劑將給出額外的反應(yīng)基，其取決于其反應(yīng)性，將支配隨后的捕獲配體附著的化學(xué)計量。當(dāng)希望較低的配體密度時，將相應(yīng)降低最初的胺活性衍生試劑。在一些情況中，將通常通過乙?；苌x擇性修飾后剩余的游離胺。
涂布基底表面的第一步是將聚合物組合物與所要涂布的基底表面接觸。用于將聚合物組合物與容器表面接觸的方法取決于待涂布表面的尺寸和形狀?？梢詮亩喾N天然和合成材料，如上面列出的材料制備容器。容器表面可以在涂布前衍生。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方法可以進(jìn)行預(yù)衍生，所述方法包括硅石和玻璃的硅烷化和聚苯乙烯或聚丙烯的等離子體處理以摻入胺、羧基、醇、醛和其他反應(yīng)基或者通過表面的化學(xué)修飾以改變其化學(xué)組成。
如果需要，可以化學(xué)修飾基底的表面以促進(jìn)與聚合物分子上攜帶的反應(yīng)基的共價結(jié)合。此類修飾包括用烴處理基底表面，或者用等離子體處理表面?；瘜W(xué)修飾的闡明性實例是玻璃的硅烷化。在優(yōu)選實施方案中，將MALDI板浸入1mg/mL石蠟?zāi)?parafilm)溶于氯仿的1mg/ml溶液中并干燥。
當(dāng)涂布大于0.1mm2的多孔板、管或者其表面或部分時，通過將聚合物組合物倒入、微量移液或者轉(zhuǎn)移到待涂布的容器或者板的部分，例如孔中，可以將聚合物組合物與容器表面接觸。備選地，通過將表面的部分浸入聚合物組合物的溶液中從而使容器表面與聚合物組合物接觸，也可以涂布大于2mm2的待涂布板、管、容器表面或者支持體的部分。
通過改變加入基底的聚合物組合物濃度和體積可以調(diào)節(jié)或控制附著到容器表面的聚合物的量。一旦聚合物組合物與表面接觸，可以在激活反應(yīng)基前干燥容器表面上的聚合物組合物，例如，通過在黑暗中20-50℃下與氣流孵育蒸發(fā)至干燥。通過使用凍干或者任意其他干燥方法，包括風(fēng)干也可以蒸發(fā)聚合物組合物以除去溶劑?？梢允褂枚喾N干燥方法，條件是干燥步驟不導(dǎo)致反應(yīng)基的過早激活。當(dāng)目測不到水分時認(rèn)為基底足夠干燥。干燥期間，聚合物組合物的聚合物分子自身定向以便與基底表面結(jié)合或者相互作用以促進(jìn)與聚合物組合物的其他聚合物之間或者內(nèi)部交聯(lián)。
然后處理干燥的經(jīng)涂布的固體表面以誘導(dǎo)反應(yīng)基共價結(jié)合基底。對于光反應(yīng)基，它們可以通過照射激活。激活是應(yīng)用外部刺激導(dǎo)致反應(yīng)基結(jié)合基底。具體地，在基底和反應(yīng)基之間形成共價鍵，例如，碳-碳鍵形成。
有許多紫外照射系統(tǒng)能夠遞送光活化聚合物與富含烴的基底結(jié)合所需的總能量(以焦耳測量的劑量)。通過水銀燈可以提供照射，水銀燈具有明顯和公知的照射波長模式。照射的強度需要焦耳在3-6焦耳/cm2內(nèi)。焦耳測量包括時間因子(1焦耳＝瓦×秒)。在一個實施方案中，通過無電極的水銀燈提供照射，該水銀燈通過微波輻射供能。一個六英寸的500瓦/英寸燈具有2,500毫瓦/cm2的額定功率輸出，其在燈與基底約2英寸距離下在UVA范圍內(nèi)測量。該燈可以以80％功率或者約2,000毫瓦/cm2成功運行。用標(biāo)準(zhǔn)低強度UV照射盒制備的樣品板具有測量為約9.0毫瓦/cm2的照射強度(UVA/UVB，約250到350nm)，并且需要大于10焦耳/cm2(10,000毫焦耳)的總能量來提供良好的結(jié)合。這需要樣品板在照射盒中孵育20分鐘以上。使用無電極水銀燈(2,000毫瓦/cm2)照射系統(tǒng)處理的板對于3.5焦耳/cm2的總能量劑量僅需要1.75秒/cm2。更高強度的照射更有效地激活光活性基并因此需要更低的總能量劑量。
在一個實施方案中，可以用9.0毫瓦/cm2的UVA/UVB光照射約30分鐘，總能量約15,000毫焦耳/cm2進(jìn)行激活。在優(yōu)選實施方案中，可以用2,000毫瓦/cm2的UVA/UVB光照射至總能量約3焦耳/cm2到約3焦耳/cm2進(jìn)行激活。孵育時間量和所用的總能量可以根據(jù)結(jié)合聚合物的光反應(yīng)基而變。在最優(yōu)選的實施方案中，通過使用Fusion UV Conveyor System使用水銀無電極燈以2,000毫瓦/cm2，以運輸帶設(shè)置為8英尺/分鐘和400瓦/英寸的燈功率可以通過光照射進(jìn)行激活。輻射計IL290 Light Bug通過傳輸帶運行以證實所希望的能量為3000到4000毫焦耳/cm2范圍內(nèi)。多孔板例如，以約800個板/小時或者約1個板/4到5秒進(jìn)行光照射。
通過改變每毫升溶劑總聚合物的量可以調(diào)節(jié)聚合物組合物的濃度。對于較高濃度的聚合物組合物或者聚合物基質(zhì)/cm2是有利的情況，可以用較少溶劑溶劑化本發(fā)明的聚合物分子。對于較低濃度的聚合物組合物或者聚合物基質(zhì)/cm2是有利的情況，可以用較多溶劑溶劑化本發(fā)明的聚合物分子。換句話說，調(diào)節(jié)聚合物組合物的濃度為0.02到1.0mg/ml溶劑并涂布固體表面，如多孔板，將產(chǎn)生具有可選范圍的總結(jié)合聚合物基質(zhì)的表面。聚合物組合物可以完全可溶或者含有懸浮的不溶聚合物?？梢杂糜谥苽渚酆衔锝M合物的溶劑包括水、醇、酮和任意或所有這些的混合物。溶劑優(yōu)選與所用的基底相容。因為組合物的聚合物可以相互交聯(lián)，所以組合物的流體樣溶液可以變成凝膠。備選地，可以以淤漿的形式產(chǎn)生溶液?？梢杂糜谒鼋M合物的溶劑的實例包括水、醇、酮和任意或所有這些的混合物。
通過在適宜的溶液中孵育以溶解和除去未結(jié)合的聚合物可以除去未結(jié)合的聚合物。例如，可以將多孔板與MOPS緩沖液在25℃過夜孵育，用MPTS緩沖液和蒸餾水每一種洗滌三次，用洗必太(hibitane)溶液洗滌、風(fēng)干、包裝并在低于室溫(2-8℃)下保存。剩余的聚合物形成聚合物基質(zhì)。
所得聚合物涂布的基底優(yōu)選含有密度為至少2μg/cm2，更優(yōu)選密度為4μg/cm2到30μg/cm2，在一些實施方案中，密度為6μg/cm2到15μg/cm2的聚合物基質(zhì)。從而通過控制共價連接聚合物分子的捕獲配體的數(shù)目和/或分子量可以控制聚合物基質(zhì)中捕獲配體(或者可活化基團)的密度。通常，聚合物基質(zhì)中捕獲配體(或者可活化基團)的密度優(yōu)選為至少1納摩爾/cm2。在一些實施方案中，捕獲配體(或者可活化基團)的密度為約1.2納摩爾/cm2到約185納摩爾/cm2。在另一實施方案中，捕獲配體(或者可活化基團)的密度為約1.5納摩爾/cm2到約90納摩爾/cm2，或約1.8納摩爾/cm2到約15納摩爾/cm2。結(jié)果，聚合物基質(zhì)可以使得以至少1納摩爾/cm2的量結(jié)合具有小于3.5kDa的分子量的靶分子。
在優(yōu)選實施方案中，與容器基底接觸的聚合物分子具有共價附著到所述聚合物分子的至少一個捕獲配體(或者可活化基團)并且至少一些聚合物分子沒有共價附著的反應(yīng)基。具有附著的反應(yīng)基和共價捕獲配體的聚合物分子的百分?jǐn)?shù)可以為25％到80％。在另一實施方案中，附著的反應(yīng)基和捕獲配體的百分?jǐn)?shù)可以為40％到75％。在再一實施方案中，附著的反應(yīng)基和捕獲配體的百分?jǐn)?shù)可以為50％到60％。在優(yōu)選實施方案中，具有共價附著的反應(yīng)基和捕獲配體的聚合物分子的百分?jǐn)?shù)可以為約50％。有和沒有反應(yīng)基的聚合物分子混合物的使用增強了三維聚合物基質(zhì)的高功能形成。
如果希望，所形成的聚合物基質(zhì)中捕獲配體可以例如，通過非共價或共價附著捕獲配體衍生化，所述附著捕獲配體可以通過加入不同的捕獲配體或者對現(xiàn)有捕獲配體的化學(xué)修飾來實現(xiàn)，從而進(jìn)一步使得高能力捕獲更多種的靶分子。
在一個實施方案中，容器是多孔聚苯乙烯板，聚合物涂層來自葡聚糖聚合物的混合物，捕獲配體是鎳螯合物，并且聚合物基質(zhì)具有1.5納摩爾/cm2到7.5納摩爾/cm2的捕獲配體密度。在其他實施方案中，捕獲配體是鎵或者鐵螯合物或者捕獲配體是谷胱甘肽。
在另一個實施方案中，容器是多孔聚丙烯板，聚合物涂層來自葡聚糖聚合物的混合物，捕獲配體是寡核苷酸。
在再一個實施方案中，容器是多孔聚苯乙烯板，聚合物涂層來自葡聚糖聚合物的混合物，捕獲配體是鏈霉抗生物素蛋白，并且聚合物基質(zhì)具有1.5μg/cm2到7.5μg/cm2的捕獲配體密度。
此外，在另一個實施方案中，容器是多孔聚苯乙烯板，聚合物涂層來自葡聚糖聚合物的混合物，捕獲配體選自蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)L或者它們的混合物，并且聚合物基質(zhì)具有1.5μg/cm2到7.5μg/cm2的捕獲配體密度。
在另一個實施方案中，容器是聚丙烯柱，聚合物涂層來自葡聚糖聚合物的混合物，捕獲配體是鎳螯合物。
含有聚合物基質(zhì)的容器可以與本文別處更詳細(xì)描述的裂解試劑聯(lián)合使用以裂解細(xì)胞和從所得溶液分離靶細(xì)胞組分?？梢砸匀我膺m宜的方式，如下文描述的方式在容器中提供裂解試劑。在一個實施方案中，裂解試劑吸附到至少一部分聚合物基質(zhì)上。在另一個實施方案中，裂解試劑保持在容器中作為聚合物基質(zhì)頂部的自由流動的粉末。然后可以將含有宿主細(xì)胞的溶液加入到含有聚合物基質(zhì)和裂解試劑的容器。一旦通過裂解試劑從宿主細(xì)胞釋放一些或者所有細(xì)胞組分，就可以通過聚合物基質(zhì)中存在的捕獲配體從細(xì)胞溶液分離靶細(xì)胞組分。
可以構(gòu)建聚合物基質(zhì)使得以0.5μg/cm2到20μg/cm2的量結(jié)合分子量為3.5kDa到500kDa的靶分子，以1μg/cm2到20μg/cm2的量結(jié)合分子量為10kDa到500kDa的靶分子，以2μg/cm2到20μg/cm2的量結(jié)合分子量為10kDa到350kDa的靶分子，以3μg/cm2到15μg/cm2的量結(jié)合分子量為10kDa到350kDa的靶分子。在一些實施方案中，聚合物基質(zhì)能夠以至少2μg/cm2聚合物基質(zhì)的量結(jié)合分子量高達(dá)350kDa的多肽靶分子。
4.裂解試劑為了幫助從宿主細(xì)胞提取或者提取和分離細(xì)胞組分，如肽、蛋白質(zhì)或核酸，本發(fā)明的容器含有裂解試劑。在一個實施方案中，裂解試劑是組合物的裂解試劑并且其濃度導(dǎo)致宿主細(xì)胞的膜破裂并向含有裂解試劑的溶液釋放細(xì)胞內(nèi)含物。在另一個實施方案中，裂解試劑僅僅使得膜足夠可滲透以釋放一些但不是所有其細(xì)胞組分。
可以通過多種方式在容器中提供裂解試劑。在一個實施方案中，裂解試劑(作為干燥組合物)吸附到容器的內(nèi)表面(或者備選地，吸附到覆蓋容器表面的聚合物涂層(如果存在))。在一個此類實施方案中，例如，裂解試劑吸附到容器的至少一部分側(cè)壁結(jié)構(gòu)。在另一個實施方案中，裂解試劑吸附到容器的至少一部分底部。在另一個實施方案中，裂解試劑吸附到容器的底部和側(cè)壁結(jié)構(gòu)每一種的至少一部分。任選地，如果容器含有聚合物基質(zhì)，那么裂解試劑可以吸附到聚合物基質(zhì)的至少一部分表面。在另一個實施方案中，裂解試劑吸附到另一種物體，例如，支持體，如珠子、棒、網(wǎng)孔(如濾器)或者其他多孔物體，所述物體松散地包含在容器的體積內(nèi)或者固定到容器的內(nèi)表面。此類支持體以及容器自身可以由例如，聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、尼龍、聚丙烯酰胺、纖維素、硝酸纖維素、其他塑性聚合物、金屬、磁體或者其他合成物質(zhì)組成。在另一個實施方案中，裂解試劑吸附到容器內(nèi)表面的至少一部分和吸附到物體，例如，支持體，如如珠子、棒、網(wǎng)孔(如濾器)或者其他多孔物體，所述物體松散地包含在容器的體積內(nèi)或者固定到容器的內(nèi)表面。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，可以控制用裂解試劑涂布的表面的表面積比(即，經(jīng)涂布的內(nèi)表面的表面積和/或容器體積內(nèi)包含的經(jīng)涂布的物體的表面積之和)。在一個實施方案中，表面積與體積比SA∶V小于約4mm2/μl，其中SA是容器的經(jīng)涂布的內(nèi)表面和容器的體積內(nèi)含有的任何經(jīng)涂布的物體的表面積，V是容器的體積。在另一個實施方案中，表面積與體積比不超過約3mm2/μl。在另一個實施方案中，表面積與體積比不超過約2mm2/μl。在另一個實施方案中，表面積與體積比不超過約1mm2/μl。
容器的內(nèi)表面和/或容器體積內(nèi)所含物體上裂解試劑的涂層將通常作為干物質(zhì)(例如，水分含量不超過約5wt.％的組合物)吸附。備選地，可以以凝膠或者糊，即粘度大于約10,000厘泊的物質(zhì)的形式提供裂解試劑，其涂布在容器的內(nèi)表面或者內(nèi)表面的一部分，或者還涂布在容器所包括的物體上。
在一個備選實施方案中，提供并作為大塊材料保持在容器內(nèi)而不是作為容器內(nèi)表面或者容器體積內(nèi)所含物體的吸附涂層的裂解試劑，所述大塊材料為例如，基質(zhì)、顆粒、片、或者自由流動的粉末。從而，例如，裂解試劑可以是凍干的基質(zhì)或者凍干的粉末，其獨立于捕獲配體置于容器內(nèi)；在一個實施方案中，一塊凍干裂解試劑置于一層樹脂上，所述樹脂具有結(jié)合該樹脂的捕獲配體。通常，更細(xì)小的顆粒傾向于比更大顆粒更快地溶解。為了使裂解試劑的損失和/或污染的危險最小，優(yōu)選在容器口上提供蓋子。
在另一備選實施方案中，裂解試劑可以作為溶解或者淤漿狀組分存在于容器中。為了避免含有宿主細(xì)胞的任何容器或者懸浮液的不希望的稀釋，在該實施方案中，溶解或者淤漿化裂解試劑的液體優(yōu)選含有高濃度裂解試劑，例如，按重量計大于約10％的裂解試劑。在另一個實施方案中，裂解試劑的濃度按重量計大于約20％。再次，為了使裂解試劑的損失和/或污染的危險最小，優(yōu)選用蓋子覆蓋容器。
通常，裂解試劑可以是任意組合物或者組合物的組合，它們可以化學(xué)地或者酶促地導(dǎo)致宿主細(xì)胞釋放靶細(xì)胞組分。此外，裂解試劑可以任選提供對該組分的保護(hù)，例如，保護(hù)免于降解。從而，裂解試劑可以含有去污劑、分解酶、離液試劑、或者它們的組合。裂解試劑可以還含有緩沖劑、消泡劑、膨脹劑、底物結(jié)合酶、酶抑制劑或者幫助提取和分離細(xì)胞組分的其他添加劑，所述細(xì)胞組分為例如，肽、蛋白質(zhì)、或者核酸。
在一個實施方案中，裂解試劑包含去污劑。本文可以使用多種去污劑，包括陰離子去污劑、陽離子去污劑、非離子去污劑和兩性離子去污劑。代表性去污劑包括鵝脫氧膽酸；鵝脫氧膽酸鈉鹽；膽酸；脫氫膽酸；脫氧膽酸；脫氧膽酸甲酯；毛地黃皂苷；洋地黃毒苷；N，N-二甲基十二烷基氧化胺；多庫酯鈉鹽；甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid)鈉鹽；甘氨膽酸水合物；甘氨膽酸鈉鹽水合物；甘氨脫氧膽酸一水合物；甘氨脫氧膽酸鈉鹽；甘氨石膽酸(glycolithocholic acid)3-硫酸二鈉鹽；甘氨石膽酸乙酯；N-月桂酰肌氨酸鈉鹽；N-月桂酰肌氨酸；十二烷基硫酸鋰；魯戈氏溶液；4型Niaproof 4(即，7-乙基-2-甲基4-十一基硫酸鈉鹽；7-乙基-2-甲基-4-十一基硫酸鈉)；1-辛烷磺酸鈉鹽；1-丁烷磺酸鈉；1-癸烷磺酸鈉；1-十二烷磺酸鈉；無水1-庚烷磺酸鈉；1-壬烷磺酸鈉；一水合1-丙烷磺酸鈉；2-溴乙烷磺酸鈉；水合膽酸鈉；絡(luò)膽酸鈉；脫氧膽酸鈉；一水合脫氧膽酸鈉；十二烷基硫酸鈉；無水己烷磺酸鈉；辛基硫酸鈉；無水戊烷磺酸鈉；?；悄懰徕c；?；敲撗跄懰徕c；?；蛆Z脫氧膽酸(saurochenodeoxycholic acid)鈉鹽；一水合?；敲撗跄懰徕c鹽；水合?；敲撗跄懰徕c鹽；?；鞘懰?-硫酸二鈉鹽；?；切苋パ跄懰徕c鹽；Trizma十二烷基硫酸鹽(即，三(羥基甲基)氨基甲烷月桂基硫酸鹽)；熊去氧膽酸，烷基三甲基溴化銨；苯扎氯銨；芐基二甲基十六烷基氯化銨；芐基二甲基肉豆蔻基氯化銨；芐基十二烷基二甲基溴化銨；芐基三甲基四氯碘酸銨；十六烷基三甲基溴化銨；二甲基二(十八烷基)溴化銨；十二烷基乙基二甲基溴化銨；十二烷基三甲基溴化銨；乙基十六烷基二甲基溴化銨；Girard′s試劑T；十六烷基三甲基溴化銨；N，N′，N′-聚氧乙烯(10)-N-動物脂-1，3-二氨基丙烷；銨溴通佐；三甲基(肉豆蔻基)溴化銨，BigCHAP(即，N，N-二[3-(D-葡糖酰胺基)丙基]膽酰胺)；二(聚乙二醇二[咪唑基羰基])；聚氧乙烯醇，如Brij30(聚氧乙烯(4)月桂基醚)、Brij35(聚氧乙烯(23)月桂基醚)、Brij35P、Brij52(聚氧乙烯2十六烷基醚)、Brij56(聚氧乙烯10十六烷基醚)、Brij58(聚氧乙烯20十六烷基醚)、Brij72(聚氧乙烯2硬脂酰基醚)、Brij76(聚氧乙烯10硬脂?；?、Brij78(聚氧乙烯20硬脂?；?、Brij78P、Brij92(聚氧乙烯2油烯基醚)；Brij92V(聚氧乙烯2油烯基醚)、Brij96V、Brij97(聚氧乙烯10油烯基醚)、Brij98(聚氧乙烯(20)油烯基醚)、Brij58P、和Brij700(聚氧乙烯(100)硬脂?；?；CremophorEL(即聚氧乙烯甘油三蓖麻醇酸酯35；polyoxyl 35蓖麻油)；十甘醇單十二烷基醚；十甘醇單十六烷基醚；十甘醇單十三烷基醚；N-癸?；?N-甲基葡糖胺；正癸基α-D-吡喃葡糖苷；癸基β-D-吡喃麥芽糖苷；毛地黃皂苷；正-十二烷酰基-N-甲基葡糖胺；正-十二烷基α-D-麥芽糖苷；正-十二烷基β-D-麥芽糖苷；七甘醇單癸基醚；七甘醇單十二烷基醚；七甘醇單肉豆蔻基醚；正-十六烷基β-D-麥芽糖苷；六甘醇單十二烷基醚；六甘醇單十六烷基醚；六甘醇單十八烷基醚；六甘醇單肉豆蔻基醚；IgepalCA-630(即，壬基苯基聚乙二醇，(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇，辛基苯氧基-聚乙二醇)；甲基-6-O-(N-庚基氨甲酰基)-α-D-吡喃葡糖苷；九甘醇單十二烷基醚；N-壬?；?N-甲基葡糖胺；八甘醇單癸基醚；八甘醇單十二烷基醚；八甘醇單十六烷基醚；八甘醇單十八烷基醚；八甘醇單肉豆蔻基醚；辛基-β-D-吡喃葡糖苷；五甘醇單癸基醚；五甘醇單十二烷基醚；五甘醇單十六烷基醚；五甘醇單己基醚；五甘醇單十八烷基醚；五甘醇單辛基醚；聚乙二醇二縮水甘油基醚；聚乙二醇醚W-1；聚氧乙烯10三癸基醚；聚氧乙烯100硬脂酸酯；聚氧乙烯20異十六烷基醚；聚氧乙烯20油烯基醚；聚氧乙烯40硬脂酸酯；聚氧乙烯50硬脂酸酯；聚氧乙烯8硬脂酸酯；聚氧乙烯二(咪唑基羰基)；聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯；來源于皂樹樹皮的皂角苷；脂肪酸脫水山梨醇酯，如Span20(失水山梨糖醇單月桂酸酯)、Span40(失水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、Span60(失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、Span65(失水山梨糖醇三硬脂酸酯)、Span80(失水山梨糖醇單油酸酯)和Span85(失水山梨糖醇三油酸酯)；聚乙二醇的多種烷基醚，如Tergitol型15-S-12、Tergitol型15-S-30、Tergitol型15-S-5、Tergitol型15-S-7、Tergitol型15-S-9、Tergitol型NP-10(壬基酚乙氧基化物)、Tergitol型NP-4、Tergitol型NP-40、Tergitol型NP-7、Tergitol型NP-9(壬基酚聚乙二醇醚)、TergitolMIN FOAM 1x、TergitolMIN FOAM 2x、Tergitol型TMN-10(聚乙二醇三甲基壬基醚)、Tergitol型TMN-6(聚乙二醇三甲基壬基醚)、Triton770、TritonCF-10(芐基-聚乙二醇叔-辛基苯基醚)、TritonCF-21、TritonCF-32、TritonDF-12、TritonDF-16、TritonGR-5M、TritonN-42、TritonN-57、TritonN-60、TritonN-101(即，聚乙二醇壬基苯基醚；聚氧乙烯支鏈壬基苯基醚)、TritonQS-15、TritonQS-44、TritonRW-75(即，聚乙二醇260單(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八醇)、TritonSP-135、TritonSP-190、TritonW-30、TritonX-15、TritonX-45(即，聚乙二醇4-叔辛基苯基醚；4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、TritonX-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；聚乙二醇叔辛基苯基醚)；4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、TritonX-102、TritonX-114(聚乙二醇叔辛基苯基醚；(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、TritonX-165、TritonX-305、TritonX-405(即，聚氧乙烯(40)異辛基環(huán)己基醚；聚乙二醇叔辛基苯基醚)、TritonX-705-70、TritonX-151、TritonX-200、TritonX-207、TritonX-301、TritonXL-80N和TritonXQS-20；肉豆蔻基-β-D-麥芽糖苷；四甘醇單癸基醚；四甘醇單十二烷基醚；四甘醇單肉豆蔻基醚；三甘醇單癸基醚；三甘醇單十二烷基醚；三甘醇單十六烷基醚；三甘醇單辛基醚；三甘醇單肉豆蔻基醚；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，如TWEEN20(聚乙二醇失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN20(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN21(聚氧乙烯(4)失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN40(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、TWEEN60(聚乙二醇失水山梨糖醇單硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN61(聚氧乙烯(4)失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN65(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三硬脂酸酯)、TWEEN80(聚乙二醇失水山梨糖醇單油酸酯；聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單油酸酯)、TWEEN81(聚氧乙烯(5)失水山梨糖醇單油酸酯)、和TWEEN85(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三油酸酯)；四丁酚醛；正-十一烷基β-D-吡喃葡糖苷、CHAPS(即，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽)；CHAPSO(即，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽)；N-十二烷基麥芽糖苷；α-十二烷基-麥芽糖苷；β-十二烷基-麥芽糖苷；3-(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽(即，SB3-10)；3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽(即，SB3-12)；3-(N，N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙烷磺酸鹽(即，SB3-14)；3-(N，N-二甲基十八烷基銨基)丙烷磺酸鹽(即，SB3-18)；3-(N，N-二甲基辛基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽(即，SB3-8)；3-(N，N-二甲基棕櫚基銨基)丙烷磺酸鹽(即，SB3-16)；MEGA-8；MEGA-9；MEGA-10；甲基庚基氨甲?；拎咸擒?；N-壬醇N-甲基葡糖胺；辛基-吡喃葡糖苷；辛基-硫代吡喃葡糖苷；辛基-β-硫代吡喃葡糖苷；3-(4-庚基)苯基3-羥基丙基)二甲基銨基丙烷磺酸鹽(即，C7BzO)；3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻酰氨基丙基)銨基]丙烷磺酸鹽(即，ASB-14)；和脫氧膽酸(deoxycholatic acid)，和它們的多種組合。
在一個實施方案中，裂解試劑將是選自CHAPS(3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽、辛基-β-硫代吡喃葡糖苷、辛基-吡喃葡糖苷、C7BzO(3-(4-庚基)苯基3-羥基丙基)二甲基銨基丙烷磺酸鹽)、ABS-14(3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻酰基氨基丙基)銨基]丙烷磺酸鹽)、TritonX-100、α-十二烷基-麥芽糖苷、β-十二烷基-麥芽糖苷、十甘醇單十六烷基醚、十甘醇單三癸基醚、脫氧膽酸、十二烷基硫酸鈉、IgepalCA-630、溴化十六碳烷基三甲銨、SB3-10(3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽)、SB3-12(3-(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽)、SB3-14(為3-(N，N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙烷磺酸鹽)、和正-十二烷基α-D-麥芽糖苷的一種或多種試劑。
在另一實施方案中，裂解試劑將是選自3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽、辛基-β-硫代吡喃葡糖苷、辛基-吡喃葡糖苷、3-(4-庚基)苯基3-羥基丙基)二甲基銨基丙烷磺酸鹽、3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻?；被?銨基]丙烷磺酸鹽、3-(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽、3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙烷磺酸鹽和正-十二烷基α-D-麥芽糖苷的一種或多種試劑。
在另一實施方案中，裂解試劑含有分解酶。本文中可以使用多種酶。代表性酶包括β葡糖醛酸糖苷酶、葡聚糖酶、蝸牛酶、溶菌酶、溶細(xì)胞酶、甘露聚糖酶、變?nèi)芫亍⑾饷?、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、溶葡萄球菌素、果膠酶(pectolyase)、鏈球菌溶血素O，和它們的多種組合。見，例如，Wolska-Mitaszko，等人，Analytical Biochem.，116241-47(1981)；Wiseman，Process Biochem.，63-65(1969)；和Andrews & Asenjo，Trends in Biotech.，5273-77(1987)。
所裂解的細(xì)胞類型可以影響酶的選擇。見，Coakley，等人，Adv.Microb.Physio，16279-341(1977)。例如，對于蛋白質(zhì)或者肽，當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，幾丁質(zhì)酶、β葡糖醛酸糖苷酶、甘露聚糖酶和果膠酶都可以使用。酵母細(xì)胞難以破裂，因為其細(xì)胞壁可以形成被膜或者抗性孢子。通過使用裂解性酶，如溶細(xì)胞酶、幾丁質(zhì)酶、消解酶和gluculase誘導(dǎo)部分原生質(zhì)球形成；原生質(zhì)球隨后裂解而釋放DNA，可以從酵母提取DNA。溶細(xì)胞酶優(yōu)選消化酵母的細(xì)胞壁并從真菌產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)球。溶細(xì)胞酶水解聚(β-1，3-葡萄糖)，如酵母細(xì)胞壁葡聚糖。
當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞時，溶菌酶和變?nèi)芫厥怯杏玫摹Ｈ芫杆怆木厶堑亩嗵侵麈溨蠳-乙?；咸烟前泛蚇-乙?；谒嶂g的β1-4糖苷鍵。它通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁中存在的肽聚糖而有效裂解細(xì)菌。
在另一實施方案中，裂解試劑含有離液劑。在某些情況中，僅離液劑就足夠裂解宿主細(xì)胞。具體地，當(dāng)細(xì)胞組分是RNA時使用離液劑?？梢杂糜诒疚牡碾x液劑的實例包括尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍、硫代硫酸胍和硫脲。離液劑還可以與去污劑、緩沖劑、消泡劑和本文描述的其他添加劑聯(lián)合使用。
除了主要負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞的去污劑、分解酶或者離液劑之外，裂解試劑還可以含有用于控制pH的一種或多種緩沖劑、防止過量起泡或者發(fā)泡的消泡劑、膨脹劑、酶抑制劑，和幫助純化細(xì)胞組分的其他底物結(jié)合酶。代表性緩沖劑包括TRIS、TRIS-HCl、HEPES和磷酸鹽。代表性消泡劑包括Antifoam 204；Antifoam A Concentrate；Antifoam A Emulsion；Antifoam B Emulsion；和Antifoam C Emulsion。代表性膨脹劑包括氯化鈉、氯化鉀和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。底物結(jié)合酶和酶抑制劑包括核酸酶，如Benzonase內(nèi)切核酸酶；脫氧核糖核酸酶(例如，脫氧核糖核酸酶I)；RNA酶(例如，RNA酶A)；蛋白酶，如蛋白酶K；核酸酶抑制劑；蛋白酶抑制劑，如膦酰二肽、胃酶抑制劑A、苯丁抑制素、E-64、牛胰蛋白酶抑制劑、抑蛋白酶醛肽、1，10-菲咯啉、抗蛋白酶、鹽酸苯甲醚、胰凝乳蛋白酶抑制劑、EDTA、e-氨基己酸、胰蛋白酶抑制劑，和鹽酸4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟；和磷酸酶抑制劑，如斑蝥素、溴代四咪唑、微囊藻素LR、原釩酸鈉、鉬酸鈉、酒石酸鈉和咪唑；等等。象分解酶一樣，底物結(jié)合酶和酶抑制劑的選擇也隨幾種因素而變，所述因素包括待提取的材料的類型(例如，肽、蛋白質(zhì)、核酸等等)，以及待裂解的細(xì)胞的類型(例如，植物、酵母、細(xì)菌、真菌、哺乳動物、昆蟲，等等)。例如，核酸酶水解或降解核酸。當(dāng)細(xì)胞組分是蛋白質(zhì)或肽時，而細(xì)胞組分不是核酸時，將希望裂解試劑含有核酸酶。同樣，蛋白酶分解或降解蛋白質(zhì)。從而當(dāng)細(xì)胞組分是核酸，但是細(xì)胞組分不是蛋白質(zhì)時，將希望裂解試劑含有蛋白酶。當(dāng)選擇其他酶或者抑制劑時可以應(yīng)用類似的推理。從而，通常，當(dāng)細(xì)胞組分是核酸時，通常可以使用諸如蛋白酶、核酸酶抑制劑和溶菌酶的酶或者抑制劑。當(dāng)細(xì)胞組分是蛋白質(zhì)或者肽時，可以使用其他酶或抑制劑，如Benzonase內(nèi)切核酸酶、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、脫氧核糖核酸酶、RNA酶或者其他核酸酶。對于核酸，RNA酶A可以用于提取細(xì)菌和哺乳動物DNA。脫氧核糖核酸酶I可以用于提取細(xì)菌RNA、酵母RNA、動物細(xì)胞和組織的RNA，和生物液體的RNA。蛋白酶，如蛋白酶K，可以用于從所有細(xì)胞類型提取DNA。
當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌或者動物細(xì)胞，或者細(xì)胞組分是蛋白質(zhì)或者DNA時，裂解試劑將通常含有去污劑。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞時，裂解試劑將通常含有去污劑，或者能夠裂解酵母細(xì)胞的酶，如溶細(xì)胞酶、酶解酶或者其他分解酶，如前面列出的那些分解酶。
作為另一實例，當(dāng)細(xì)胞組分是蛋白質(zhì)或肽時，裂解試劑優(yōu)選含有一種或多種去污劑、溶菌酶、核酸酶、Benzonase內(nèi)切核酸酶、緩沖劑、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑或者離液試劑，或者它們的多種組合。在另一實施方案中，當(dāng)細(xì)胞組分是DNA時，裂解試劑優(yōu)選含有一種或多種去污劑、溶菌酶、核酸酶抑制劑、RNA酶、緩沖劑或者蛋白酶，或者它們的多種組合。
在另一實施方案中，當(dāng)細(xì)胞組分是RNA時，裂解試劑優(yōu)選含有一種或多種去污劑、離液試劑、或者緩沖劑，或者它們的多種組合。該應(yīng)用中通常不使用酶，因為離液劑將使它們失活。
在一個實施方案中，裂解試劑含有3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽、溶菌酶、Tris-HCl，和脫氧核糖核酸酶I。
在另一實施方案中，裂解試劑含有辛基-硫代吡喃葡糖苷、蛋白酶抑制劑、溶菌酶、Benzonase內(nèi)切核酸酶。
從而，裂解試劑可以含有去污劑、酶、抑制劑、離液劑、緩沖劑、消泡劑、膨脹劑和/或幫助提取和分離細(xì)胞組分的其他添加劑的多種不同的組合。這些裂解試劑和/或組分可以是天然的、重組的或者任意修飾的或活性形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于細(xì)胞組分和宿主細(xì)胞的類型容易確定優(yōu)選的裂解試劑所含的成分。
裂解試劑的量和其每種組分的相對比例將根據(jù)宿主細(xì)胞的類型、所選的裂解試劑的類別和希望在確定的時間段內(nèi)的細(xì)胞滲透程度而變。從而，在一個實施方案中，任何一種去污劑的濃度為約0.01％到約5％(w/v)，更優(yōu)選約0.1％到約2％。在另一實施方案中，每種分解酶的濃度為約0.01mg/ml到約0.2mg/ml。在再一個實施方案中，緩沖劑的濃度使得在發(fā)生提取或者提取和分離的時間期間內(nèi)細(xì)胞溶液的pH保持在約pH3到約pH12。在另一實施方案中，蛋白酶抑制劑的濃度為約10nM到約10mM。在另一實施方案中，磷酸酶抑制劑的濃度為約0.01nM到約10mM。
不管是否裂解試劑作為被吸附的、自由流動的、溶解的或者淤漿狀的組分存在于溶劑中，當(dāng)向容器加入含有宿主細(xì)胞的溶液和懸浮液時，裂解試劑將被含有宿主細(xì)胞的懸浮液溶解和稀釋，并且宿主細(xì)胞被裂解。如果裂解試劑含有裂解所需的所有試劑，那么不需要進(jìn)行多次移液步驟以確保存在所有需要的裂解試劑。此外，如上面指出的，裂解試劑不必為了有效而完全溶解宿主細(xì)胞。而是，宿主細(xì)胞僅需要被裂解到將部分和所有靶產(chǎn)物釋放到溶液的程度。此外，裂解試劑不必為了有效而裂解任何具體細(xì)胞懸浮液中的所有宿主細(xì)胞，只要裂解一些宿主細(xì)胞即可。
5.試劑盒有利地，本發(fā)明的容器可以與使用說明書，和用于從宿主細(xì)胞提取和/或分離細(xì)胞組分的試劑，和/或分析或檢測被捕獲的細(xì)胞組分的試劑，和/或處理緩沖液或者對照聯(lián)合，其中所有這些都包裝在一起并且作為試劑盒分配。在一個實施方案中，試劑盒將含有一個容器，或者備選地，包含多個容器的多孔板；通常，將封閉試劑盒?？傊?，包括裂解試劑，和任選地，還可以包括捕獲配體。
如本文所述，裂解試劑和/或捕獲配體可以以多種不同的方式在本發(fā)明的容器中提供。例如，裂解試劑可以涂布在容器的一部分、容器的底部、容器的側(cè)壁結(jié)構(gòu)或者容器的底部和側(cè)壁結(jié)構(gòu)上，或者可以以自由流動的粉末形式存在。同樣，受支持的捕獲配體可以位于容器的一部分、容器的底部、容器的側(cè)壁結(jié)構(gòu)或者容器的底部和側(cè)壁結(jié)構(gòu)上。在一個實施方案中，容器還包含額外的支持體，如珠子或者網(wǎng)孔，支持體上可以涂布裂解試劑和/或放置受支持的捕獲配體。備選地，容器可以是高容量平臺，其含有三維聚合物基質(zhì)、捕獲配體或者可活化基團，和裂解試劑。
在一個實施方案中，容器將含有提取或者提取和分離細(xì)胞組分(例如，多肽、蛋白質(zhì)、RNA或者DNA產(chǎn)物)所需的所有試劑。試劑盒可以還包含用于從受支持的捕獲配體或者三維基質(zhì)釋放或稀釋被捕獲的產(chǎn)物的其他試劑和設(shè)備，以及多種處理緩沖劑。
6.方法通常，本發(fā)明的方法涉及從宿主細(xì)胞提取或提取和分離細(xì)胞組分，如肽、蛋白質(zhì)、核酸、或者其他細(xì)胞組分。從而，一方面，本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的方法，該方法包括(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V，和至少一部分內(nèi)表面上的裂解試劑涂層，所述內(nèi)表面包括側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，經(jīng)涂布的內(nèi)表面的面積與體積V的比小于約4mm2/μl，和(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成細(xì)胞殘渣。裂解試劑導(dǎo)致宿主細(xì)胞釋放其內(nèi)含物。裂解可以是完全的，即所有細(xì)胞組分(例如，肽、蛋白質(zhì)或核酸)從宿主細(xì)胞釋放，或者是部分的，即，從宿主細(xì)胞釋放部分細(xì)胞組分。
另一方面，本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的方法。一方面，該方法包括(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V、裂解試劑和受支持的捕獲配體，所述內(nèi)表面包括側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，側(cè)壁結(jié)構(gòu)在底部和口之間，口作為向容器導(dǎo)入液體的入口和從容器除去液體的出口，(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成固態(tài)細(xì)胞殘渣；和(c)在固態(tài)細(xì)胞殘渣的存在下用捕獲配體捕獲細(xì)胞組分。在一個實施方案中，通過容器的內(nèi)表面支持捕獲配體。在另一實施方案中，捕獲配體附著到容器的內(nèi)表面上涂布的聚合物基質(zhì)。
另一方面，所述方法包括(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V、裂解試劑和受支持的捕獲配體，所述內(nèi)表面包括側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，側(cè)壁結(jié)構(gòu)在底部和口之間，口作為向容器導(dǎo)入液體的入口，(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成固態(tài)細(xì)胞殘渣；和(c)在固態(tài)細(xì)胞殘渣的存在下用捕獲配體捕獲細(xì)胞組分，(d)從捕獲配體釋放細(xì)胞組分，和(e)回收釋放的細(xì)胞組分。在一個實施方案中，通過容器的內(nèi)表面支持捕獲配體。在另一實施方案中，捕獲配體附著到容器的內(nèi)表面上涂布的聚合物基質(zhì)。
裂解可以是完全的，即所有細(xì)胞組分從宿主細(xì)胞釋放，或者是部分的，即，從宿主細(xì)胞釋放部分細(xì)胞組分。在一個實施方案中，洗除細(xì)胞殘渣和其他未結(jié)合的細(xì)胞成分，留下結(jié)合到捕獲配體的細(xì)胞組分。然后在被捕獲的產(chǎn)物仍然結(jié)合捕獲配體時可以檢測所述捕獲的產(chǎn)物。此類檢測方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括ELISA、蛋白質(zhì)檢測和酶分析，等等。在另一實施方案中，通過使用諸如鹽的試劑，或者通過其他試劑與捕獲配體的競爭性結(jié)合從捕獲配體釋放或者洗脫被捕獲的細(xì)胞組分可以回收被捕獲的組分。
現(xiàn)在參考圖7，將在含有裂解試劑和捕獲配體的容器的背景下描述本發(fā)明的方法。通常稱作10的該容器為柱或者管，其通常具有柱狀軸12，其限定了內(nèi)腔，和口13(其可以被上面的帽14覆蓋)、出口15(其可以被下面的帽16覆蓋)。在一般的柱狀軸12限定的腔內(nèi)是樹脂床18，其結(jié)合有捕獲配體，和覆蓋樹脂床18的一塊裂解試劑20。為了支持腔內(nèi)的樹脂床，容器10可以還含有多孔聚乙烯釉料(約20μm孔大小)。在操作中，除去上面的帽14并將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物通過口13倒入柱中。通過液體懸浮物溶解裂解試劑20，從而使得釋放宿主細(xì)胞的所有或部分細(xì)胞組分并通過結(jié)合樹脂床18的捕獲配體捕獲細(xì)胞組分。捕獲細(xì)胞組分后，通過出口15從容器排出細(xì)胞殘渣和液體懸浮物的其他組分；有利地，釉料或者其他支持方法防止樹脂18排出腔但是允許細(xì)胞殘渣和液體懸浮物的其他組分排出。在優(yōu)選實施方案中，柱子具有9.1cm內(nèi)部柱長(或者當(dāng)在底部和口加帽時長12.3cm)；在底部開口約1cm的直徑、在口開口約1.7cm的直徑；和約7.5ml的總體積。在一個實施方案中，捕獲配體是共價附著瓊脂糖樹脂床的鎳螯合物并且裂解試劑含有CHAPS(即，3-[3-膽酰氨基丙基]二甲基銨基)-1-丙烷磺酸鹽)的自由流動的粉末、溶菌酶、Tris-HCl和脫氧核糖核酸酶I。
在另一實施方案中，上述方法可以在多孔板(如96多孔板)的一個或多個孔中進(jìn)行，所述多孔板可以含有裂解試劑和聚合物基質(zhì)涂層。例如，在一個實施方案中，用前述衍生自葡聚糖聚合物的聚合物基質(zhì)涂布孔，所述聚合物基質(zhì)連接捕獲配體。在優(yōu)選實施方案中，聚合物基質(zhì)衍生自葡聚糖聚合物的混合物，并且捕獲配體是鎳螯合劑。在一個實施方案中，裂解試劑含有辛基-硫代吡喃葡萄糖苷(OTG)、蛋白酶抑制劑、溶菌酶、和Benzonase內(nèi)切核酸酶。更具體地，裂解試劑可以含有2％OTG、1％蛋白酶抑制劑、2％溶菌酶、和0.02％Benzonase內(nèi)切核酸酶。在一個實施方案中，裂解試劑涂布在聚合物基質(zhì)的至少一部分表面和/或孔的側(cè)壁上。備選地，或者額外地，裂解試劑可以以孔內(nèi)凍干基質(zhì)或者其他物質(zhì)(例如，自由流動的粉末)的形式存在。當(dāng)向孔中加入含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物時，裂解試劑被溶解，并且宿主細(xì)胞被裂解，如前述。然后捕獲配體結(jié)合靶細(xì)胞組分。使用本領(lǐng)域公知和前面描述的技術(shù)可以任選釋放和回收被捕獲的靶細(xì)胞組分。
另一方面，本發(fā)明涉及制備用于從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的多孔板的方法。該方法包括將多孔板的多個孔的內(nèi)表面與含有裂解試劑的液體接觸，并干燥液體以在孔的內(nèi)表面上形成裂解試劑的吸附層。本文描述的任意裂解試劑可以以該方式使用。如前面描述的，裂解試劑的量可以改變，但是應(yīng)該是足夠的，從而所吸附的裂解試劑的量將提供所希望水平的提取。通過風(fēng)干，使用培養(yǎng)箱，或者本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)可以實現(xiàn)干燥。
可以以類似方式制備用于從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的容器。例如，在一個實施方案中，含有受支持的捕獲配體的孔的內(nèi)表面可以與含有裂解試劑的液體接觸，并且干燥液體以在孔的內(nèi)表面上形成裂解試劑的吸附層。在另一實施方案中，含有所結(jié)合的聚合物基質(zhì)的孔(例如，上述多孔板的一個或多個孔)的內(nèi)表面可以與含有裂解試劑的液體接觸，并且干燥液體以在孔的聚合物基質(zhì)和/或側(cè)壁的表面上形成裂解試劑的吸附層。在另一實施方案中，柱(如含有附著捕獲配體樹脂的柱，如上述)的內(nèi)表面可以與含有裂解試劑的液體接觸，并且干燥液體以在柱的樹脂和/或側(cè)壁的表面上形成裂解試劑的吸附層。
本申請引用的所有出版物、專利、專利申請和其他參考文獻(xiàn)在此處完整并入本文作為參考，就像每種單獨的出版物、專利、專利申請和其他參考文獻(xiàn)特別并單獨指出并入本文作為參考一樣。
7.定義術(shù)語“捕獲配體”指可以或者被固定或支持在容器或支持物上并且用于將細(xì)胞組分與細(xì)胞殘渣分離的任何部分、分子、受體或者層?？梢杂糜诒景l(fā)明的捕獲配體的一些非限制性實例包括生物素、鏈霉抗生物素蛋白、多種金屬螯合離子、抗體、多種帶電顆粒，如用于離子交換層析的那些顆粒、染料、多種親和層析支持體，和用于疏水層析的多種疏水基團。
術(shù)語“細(xì)胞殘渣”和“細(xì)胞的殘渣”在本文可以互換使用，用以描述由于細(xì)胞裂解從宿主細(xì)胞釋放的不同于靶產(chǎn)物的膜碎片、細(xì)胞器或者任意其他可溶或不可溶細(xì)胞組分。
術(shù)語“提取”指由于細(xì)胞裂解，從宿主細(xì)胞釋放其表達(dá)的至少一些靶產(chǎn)物。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”指表達(dá)或者含有靶產(chǎn)物的任意原核或真核細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括，例如，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；植物細(xì)胞；動物細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞；和昆蟲細(xì)胞。
術(shù)語“分離”或“純化”指從至少部分細(xì)胞殘渣除去或分離至少部分靶產(chǎn)物。
術(shù)語“裂解”指破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜從而釋放靶產(chǎn)物。裂解可以是完全或部分的(即，使得細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜足夠可滲透的以釋放一些但不是全部細(xì)胞組分)。
術(shù)語“靶產(chǎn)物”指任意細(xì)胞組分，如多肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、DNA、RNA、其他核苷酸序列、糖、脂質(zhì)、膽固醇、激酶或者其他細(xì)胞組分，所述任意細(xì)胞組分將從表達(dá)或包含所述組分的宿主細(xì)胞提取或者提取和分離(例如，“靶蛋白”、“靶DNA”、“靶RNA”、“靶細(xì)胞組分”等等)出來。靶產(chǎn)物可以在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生，或者可以是非天然發(fā)生的，例如，重組蛋白質(zhì)。
由于可以對上面的產(chǎn)物和方法進(jìn)行多種改變而不背離本發(fā)明的范圍，所以上面描述和下面給出的實施例中所含的所有內(nèi)容將解釋為闡明性的而不是限制性的。
實施例實施例1使用his-標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)通過HIS-SelectTM高容量板進(jìn)行去污劑裂解和純化在該實施例中，裂解含有包含重組his標(biāo)記的蛋白質(zhì)的細(xì)菌，并且在一步中純化靶蛋白。將重組蛋白質(zhì)以不同的量摻加(spike)到大腸桿菌(E.coli)中以確定細(xì)胞裂解時蛋白質(zhì)能否被捕獲。除非另外指出，從Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO得到所有材料。
干燥裂解支持體。用HIS-SelectTM高容量(HC)板(Sigma S5563)進(jìn)行靶蛋白的純化。將這些96孔多孔板用如上述的高密度、鎳螯合物聚合物基質(zhì)涂布。這些板用于純化his-標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)，并且可以每孔結(jié)合4μg以上蛋白質(zhì)。主要裂解組分是20mM Tris-Cl(pH 7.5)中的1％辛基-硫代葡萄糖吡喃糖苷(OTG)。將多種處理試劑和酶加入到緩沖的去污劑i)1％(v/v)蛋白酶抑制劑(Sigma P8849)、2％溶菌酶(Sigma，10mg/ml溶液L3790)，和0.02％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)；ii)1％蛋白酶抑制劑和2％溶菌酶；和iii)1％蛋白酶抑制劑和0.02％Benzonase內(nèi)切核酸酶。將溶液分散到96孔HIS-SelectTMHC板的不同孔中，每個孔含有緩沖去污劑加(i)、(ii)或(iii)的0.1ml溶液。在培養(yǎng)箱中47℃下對板上方吹干燥空氣使溶液在培養(yǎng)箱中板孔上干燥。干燥后，用去污劑加(i)、(ii)或(iii)涂布的每個孔的表面積為約134.7mm2。
細(xì)胞生長。向3個15-ml圓底管的每一個加入5ml無菌terrific肉湯(TB)培養(yǎng)基。向每個管加入氨芐青霉素至終濃度為0.1mg/ml。向每個管加入非表達(dá)性大腸桿菌的一個菌落。以250轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃過夜孵育培養(yǎng)物。
大腸桿菌樣品。用無菌TB培養(yǎng)基將含有序列His-Asn-His-Arg-His-Lys-His(SEQ.ID.NO.4)的組氨酸標(biāo)記的純化的重組28kDa蛋白質(zhì)稀釋到1mg/ml。通過將特定量的靶蛋白摻加到非表達(dá)性大腸桿菌培養(yǎng)物制備蛋白質(zhì)樣品。向含有經(jīng)干燥的裂解試劑的每孔加入100μl等分試樣。非表達(dá)性大腸桿菌培養(yǎng)基用作對照。溫和搖動下在室溫孵育樣品2小時。
SDS-PAGE分析。使用BioMek板洗滌器將板用Tris緩沖鹽水與0.05％Tween 20(TBST)，pH 8.0洗滌4次。所選的孔在室溫下用50μl含有50mM磷酸鈉，pH8，300mM氯化鈉，和250mM咪唑的溶液洗脫。樣品以1∶1與Laemmli樣品緩沖液混合，并通過1x Tris-甘氨酸-SDS緩沖液中的4-20％tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)對20μl樣品電泳。凝膠用EZBlue染色試劑(Sigma G1041)染色，然后用銀染(Sigma#Prot-sill)染色。結(jié)果在圖1中給出。
結(jié)果和討論。表1指出用于圖1的每個泳道的裂解試劑和樣品組分。在其中加入靶蛋白的每個孔中，蛋白質(zhì)受到捕獲并洗脫。更高量的蛋白質(zhì)導(dǎo)致更高量的被捕獲的靶蛋白。處理輔助劑對于結(jié)合的靶蛋白的量是有益的，除了去污劑還存在溶菌酶時尤其有益。
表1用于SDS-PAGE分析的裂解試劑和樣品組分
實施例2通過HIS-SelectTM高容量板使用重組大腸桿菌進(jìn)行去污劑裂解、捕獲和純化在該步驟中，使用多種去污劑聯(lián)合處理輔助劑裂解含有重組his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的細(xì)菌，并且在一步中純化靶蛋白。除非另外指出，所有材料都從Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO得到。
干燥裂解支持體。用去污劑和處理試劑和酶的多種組合檢查一系列裂解試劑。100μl 2％OTG、2％CHAPS、4％CHAPS、2％C7BzO或者2％ASB-14在96孔HIS-SelectTM高容量板(Sigma S5563)上干燥。還制備含有這些去污劑和其他處理試劑的溶液。每種去污劑與i)2％(v/v)蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P8849)；ii)2％蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P8849)和0.01％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)；iii)2％蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P8849)和0.04％溶菌酶；iv)2％蛋白酶抑制劑混合物(SigmaP8849)，0.01％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)，和0.04％溶菌酶組合。還制備了額外的溶液，它們含有i)2％OTG或2％CHAPS和0.04％溶菌酶；ii)2％OTG或2％CHAPS和0.01％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)；和iii)2％OTG或2％CHAPS和0.04％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)和0.04％溶菌酶。將這些溶液的每一種分配到HIS-SelectTM高容量板(Sigma S5563)的2-3個孔中，每孔含有100μl溶液。在烘箱中47℃下對板上方吹干燥空氣過夜干燥裂解試劑。
細(xì)胞生長。在15ml圓底管中加入5ml無菌TB培養(yǎng)基。向管中加入氨芐青霉素至終濃度為0.1mg/ml。向管加入表達(dá)his-標(biāo)記的靶蛋白的大腸桿菌BL21G的一個菌落。以250轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃過夜孵育培養(yǎng)物。來自起始培養(yǎng)物的1ml細(xì)胞用于接種500ml高壓滅菌的terrific肉湯(TB)。向管中加入氨芐青霉素至終濃度為0.1mg/ml。以250轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃孵育培養(yǎng)物3.5小時。3.5小時后，600nm處的OD為0.5。向培養(yǎng)物加入終濃度1mM的異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以誘導(dǎo)靶蛋白表達(dá)。以250轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃再孵育培養(yǎng)物1.5小時。
大腸桿菌樣品。向含有干燥裂解試劑的半數(shù)孔中以200μl等分試樣加入表達(dá)his標(biāo)記的蛋白質(zhì)的大腸桿菌(如用于實施例1中)?？湛子米鲗φ?。溫和搖動下在室溫孵育樣品1小時。
Bicinchoninic Acid(BCA)蛋白質(zhì)測定。使用BioMek板洗滌器用TBST，pH 8.0洗滌孔四次。1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。向每孔加入200μl BCA工作試劑。將板在37℃孵育30分鐘并在562nm下在平板讀出器上讀數(shù)。結(jié)果在表2中給出。
結(jié)果和討論。BCA蛋白質(zhì)測定表明在HIS-SelectTM高容量板上成功捕獲了靶蛋白。多種去污劑制劑能夠裂解細(xì)胞，允許捕獲蛋白質(zhì)。非離子去污劑OTG，以及兩性離子去污劑CHAPS、C7BzO和ASB-14工作良好。加入處理輔助劑，特別是溶菌酶，有助于增加結(jié)合到板的蛋白質(zhì)的量。
表2通過BCA測定法測定的蛋白質(zhì)量(μg/孔)
表2顯示了對于BCA蛋白質(zhì)測定，對于測試的每種裂解試劑，每孔的蛋白質(zhì)平均量(μg)。第1列指出所用的去污劑。第2列概述了當(dāng)僅使用去污劑時的結(jié)果。第3-9列概述除了去污劑，還使用溶菌酶(“Lys”)、Benzonase內(nèi)切核酸酶(“Benz”)、蛋白酶抑制劑混合物(“Pr.inh.”)或者它們的多種組合時的結(jié)果。
實施例3用大腸桿菌與重組的his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)和2％OTG與HIS-SelectTM高容量板進(jìn)行裂解、捕獲和純化在該實施例中，用2％OTG裂解包含含有重組his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的細(xì)菌，并在一步中純化靶蛋白。
除非另外指出，所有材料都從Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO得到。
干燥裂解支持體。用HIS-SelectTM高容量板(Sigma 85563)純化靶蛋白。這些96孔多孔板用于純化his標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)并且可以每孔結(jié)合4μg以上蛋白質(zhì)。制備裂解溶液，其含有20mM Tris-Cl pH 7.5中的2％辛基-硫代吡喃葡萄糖苷(OTG)、1％(v/v)蛋白酶抑制劑(Sigma P8849)、2％溶菌酶(Sigma，10mg/ml溶液L3790)，和0.02％Benzonase內(nèi)切核酸酶(SigmaE1014)。將50μl或100μl該溶液分配到96孔HIS-SelectTM高容量板的孔中。在培養(yǎng)箱中47℃下對板上方吹干燥空氣過夜干燥板孔上的溶液。
細(xì)胞生長。在15ml圓底管中，加入5ml無菌TB培養(yǎng)基。向管中加入表達(dá)his-標(biāo)記的靶蛋白的非氨芐青霉素抗性大腸桿菌的一個菌落。250轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃過夜孵育培養(yǎng)物。
大腸桿菌樣品。用無菌TB培養(yǎng)基將含有組氨酸標(biāo)記(如實施例1中描述)的純化的重組28kD蛋白質(zhì)稀釋到1mg/ml。通過向非表達(dá)性大腸桿菌培養(yǎng)基摻加特定量的靶蛋白制備蛋白質(zhì)樣品。對照樣品含有僅純化的靶蛋白或者非表達(dá)性大腸桿菌培養(yǎng)物。向含有干燥的裂解試劑的每個孔中加入100μl等分試樣。溫和搖動下在室溫孵育樣品2小時。
SDS-PAGE分析。孵育后，使用BioMek板洗滌器將板用TBST pH 8.0洗滌4次。一些孔在室溫下用50μl含有50mM磷酸鈉，pH8，300mM氯化鈉，和250mM咪唑的溶液洗脫。樣品以1∶1與Laemmli樣品緩沖液混合，并通過1x Tris-甘氨酸-SDS緩沖液中的4-20％tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)對20μl樣品電泳。凝膠用EZBlue染色試劑染色，然后用銀染染色。結(jié)果在圖2和3和表3中給出。
Bradford蛋白質(zhì)測定。1mg/ml BSA用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。向每孔加入250μl Bradford試劑。將板在室溫孵育15分鐘并在595nm下在平板讀出器上讀數(shù)。結(jié)果在表5中給出。
光散射。將細(xì)胞培養(yǎng)物的100μl等分試樣用無菌培養(yǎng)基以1∶10稀釋以在550nm測定OD后裂解。對于含有8μg靶蛋白摻加的細(xì)胞樣品，裂解后在550nm讀出一式兩份的等分試樣。結(jié)果在表4中給出。
結(jié)果和討論。SDS-PAGE樣品表明細(xì)胞被裂解，并且捕獲和成功地洗脫靶蛋白。所捕獲的靶蛋白的量隨著加入細(xì)胞的靶蛋白的量增加而增加。光散射數(shù)據(jù)表明對于裂解后樣品，在550nm處的吸收下降，表明細(xì)胞被裂解。對樣品進(jìn)行的Bradford蛋白質(zhì)測定數(shù)據(jù)表明存在結(jié)合板的靶蛋白。非表達(dá)性細(xì)胞的裂解顯示了背景蛋白質(zhì)水平，但是靶蛋白的增加量給出了高于該背景水平的蛋白質(zhì)數(shù)。
表3用于SDS-PAGE分析的樣品組分
表3指出了圖2和3的每個泳道的樣品組成。所有樣品都應(yīng)用于HIS-SelectTMHC板(Sigma S5563)，其含有50μl(圖2)或100μl(圖3)2％OTG、20mM Tris-Cl pH 7.5、2％10mg/ml溶菌酶、1％v/v蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，P8849)和0.02％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)的干燥溶液。
表4光散射結(jié)果
表5通過Bradford測定直接在孔中測定的每孔結(jié)合HIS-SelectTMHC板的蛋白質(zhì)量
實施例4使用高容量和高靈敏度HIS-SelectTM和ANTI-FLAGM2板進(jìn)行去污劑裂解、重組蛋白質(zhì)的捕獲和純化在該實施例中，用多種去污劑聯(lián)合處理輔助劑裂解表達(dá)具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)和/或his標(biāo)記的靶蛋白的細(xì)菌細(xì)胞，并一步純化靶蛋白。
除非另外指出，所有材料都從Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO得到。
干燥裂解支持體。去污劑、處理試劑和酶的多種組合用于檢查一系列裂解條件。制備含有下面成分的去污劑裂解溶液a)2％SB3-10，0.2％C7BzO，0.2％正十二烷基α-D-麥芽糖苷，0.2％TritonX-100b)2％CHAPS，1％ASB-14c)2％SB3-14，0.2％C7BzOd)2％CHAPS，1％正辛基葡糖苷e)2％SB3-12，0.2％C7BzOf)2％SB3-14，0.2％ASB-14g)1％正辛基葡糖苷，1％CHAPS，0.2％正十二烷基α-D-麥芽糖苷h)8％CHAPS去污劑CHAPS為3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽；SB3-10為3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽；SB3-12為3-(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽；SB3-14為3-(N，N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙烷磺酸鹽；C7BzO為3-(4-庚基)苯基3-羥基丙基)二甲基銨基丙烷磺酸鹽；ASB-14為3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻?；被?銨基]丙烷磺酸鹽。前7種去污劑溶液(a-g)還含有40mM Tris-HCl，pH 7.4，0.04％溶菌酶(Sigma L3790)，和0.01％Benzonase內(nèi)切核酸酶(Sigma E1014)。8％CHAPS溶液(h)還含有80mM Tris-HCl，pH 8.0，0.04％溶菌酶(Sigma L6876)，和0.01％脫氧核糖核酸酶I(Sigma D4527)。將這些去污劑溶液的每一種100μl分配到HIS-SelectTM高容量板(Sigma M5563)、HIS-SelectTM高靈敏板(SigmaS5688)、ANTI-FLAGM2高容量板和ANTI-FLAGM2高靈敏板(SigmaP2983)的6個孔(半排)中。在培養(yǎng)箱中通過環(huán)境空氣在板上方流動過夜干燥裂解試劑。
細(xì)胞生長。向三只15ml圓底管的每一只加入5ml無菌terrific肉湯(TB)。向每管加入終濃度為0.1mg/ml的氨芐青霉素。向第一管加入表達(dá)具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)標(biāo)記的靶蛋白的BL21大腸桿菌的甘油貯存液的20μl等分試樣。向第二管加入表達(dá)具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)/his標(biāo)記的靶蛋白的BL21大腸桿菌的甘油貯存液的20μl等分試樣。向第三管加入表達(dá)具有his標(biāo)記(如實施例1中描述)的靶蛋白的BL21大腸桿菌的甘油貯存液的20μl等分試樣。以275轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃下過夜孵育培養(yǎng)物。
過夜生長的起始培養(yǎng)物用于接種三個500ml高壓滅菌的terrific肉湯樣品。向每瓶加入終濃度0.1mg/ml的氨芐青霉素。以275轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃下孵育培養(yǎng)物4小時。向培養(yǎng)物加入終濃度1mM的異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以誘導(dǎo)靶蛋白表達(dá)。以275轉(zhuǎn)/分鐘搖動下在37℃再孵育培養(yǎng)物3小時。
大腸桿菌樣品。向用裂解試劑的200μl等分試樣涂布的每個板的兩列加入生長在500ml搖瓶中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)的大腸桿菌?？湛子米鲗φ?。溫和搖動下在室溫下孵育樣品2小時。
高靈敏板的酶免疫檢測測定。使用BioTek板洗滌器，將孔用TBS-T，pH 8.0洗滌4次，然后用去離子水洗滌4次。向每孔加入綴合辣根過氧化物酶(HRP)的對靶蛋白特異的抗體200μl。向四個不含有蛋白質(zhì)的其他孔中也加入這些綴合物，所述孔用作空白。在室溫下用抗體孵育板45分鐘，然后用TBS-T，pH 8.0洗滌4次。向每孔加入100μl TMB底物(SigmaT0440)并對板顯影，直到顏色明顯(約3-5分鐘)。此時，通過向每孔加入100μl 1M HCl終止反應(yīng)。在450nm得到吸收讀數(shù)，并扣除空白以確定校正的A450。
高容量板的TCA沉淀。使用BioTek板洗滌器，將孔用TBS-T，pH 8.0洗滌4次，然后用去離子水洗滌4次。向HIS-SelectTM高容量板的每孔等分加入50mM磷酸鈉，pH 8.0，300mM NaCl和250mM咪唑的100μl溶液。將100μl 0.1M甘氨酸(pH 3.0)等分到ANTI-FLAGM2的高容量板的每孔中。在37℃孵育板20分鐘以洗脫靶蛋白。從板除去洗脫的樣品并置于清潔管中。每個樣品用0.2％脫氧膽酸鈉溶液(Sigma D3691)稀釋到終體積500μl。將樣品快速渦旋并在室溫孵育10分鐘。向每個樣品加入50μl 100％三氯乙酸溶液(TCA)(Sigma T6323)，將它們短暫渦旋并置于冰上孵育15分鐘。在室溫以15,000×g離心樣品10分鐘，并倒出上清液。向每管加入500μl 25％丙酮溶液(Sigma A5351)。將樣品短暫渦旋并以15,000×g離心5分鐘。倒出上清液并在SpeedVac中30℃干燥蛋白質(zhì)沉淀20分鐘。
SDS-PAGE分析。每種蛋白質(zhì)重懸浮在10μl Laemmli樣品緩沖液(Sigma S3401)中，用1M NaOH滴定到堿性pH。整個樣品通過10-20％Tris-甘氨酸凝膠(BioRad目錄號345-0044)電泳。凝膠用EZ BlueTM(SigmaG1041)凝膠染色試劑染色1小時，用去離子水過夜脫色。
結(jié)果和討論。來自酶免疫檢測測定法的校正的A450讀數(shù)表明在HIS-SelectTM和ANTI-FLAGM2高靈敏板上成功地捕獲靶蛋白。多種去污劑制劑能夠裂解細(xì)胞，允許捕獲蛋白質(zhì)。圖4描繪了來自ANTI-FLAGM2高靈敏板測定的校正的吸收值，其表明具有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)標(biāo)記的那些蛋白質(zhì)被捕獲，而沒有DYKDDDDK(SEQ.ID.NO.1)標(biāo)記的那些蛋白質(zhì)未被捕獲。圖5包含來自HIS-SelectTM高靈敏板免疫檢測測定的校正的吸收值，并且表明板能夠選擇性捕獲his-標(biāo)記的靶蛋白，而不捕獲無his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。類似地，圖6中的SDS-PAGE結(jié)果表明靶蛋白被成功捕獲并從HIS-SelectTM高容量板洗脫。從ANTI-FLAGM2高容量板得到類似結(jié)果。表6指出了用于圖6的每個泳道的所用試劑和樣品的組成。
表6用于SDS-PAGE分析的裂解試劑和樣品組成
權(quán)利要求
1.用于從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的容器，所述容器具有口、內(nèi)表面、體積V和至少一部分內(nèi)表面上裂解試劑的涂層，所述內(nèi)表面包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，當(dāng)含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器時，涂層中裂解試劑的量足夠形成能夠裂解宿主細(xì)胞的裂解溶液，經(jīng)涂布的內(nèi)表面的面積SA與體積V的比值小于約4mm2/μl。
2.用于從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V、裂解試劑和受支持的捕獲配體，側(cè)壁結(jié)構(gòu)在底部和口之間，口作為向容器導(dǎo)入液體的入口和從容器除去液體的出口，所述內(nèi)表面包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，其中捕獲配體在容器中的一個位置受到支持，當(dāng)含有完整宿主細(xì)胞或者固體細(xì)胞組分的液體懸浮物通過容器口導(dǎo)入容器時，所述位置允許捕獲配體接觸完整宿主細(xì)胞或者從其來源的固體細(xì)胞組分。
3.用于從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的多孔板，所述多孔板的至少一個孔含有裂解試劑，其中裂解試劑(i)涂在孔的至少一部分內(nèi)表面上，或者(ii)為孔中所含的材料塊的形式。
4.權(quán)利要求3的多孔板，其中孔還包含細(xì)胞組分的捕獲配體。
5.權(quán)利要求1或2的容器或者權(quán)利要求3的多孔板，其中裂解試劑選自去污劑、分解酶、離液劑和它們的組合。
6.權(quán)利要求5的容器或多孔板，其中裂解試劑是去污劑并且該去污劑選自3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽、辛基-β-硫代吡喃葡糖苷、辛基-吡喃葡糖苷、3-(4-庚基)苯基3-羥基丙基)二甲基銨基丙烷磺酸鹽、3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻?；被?銨基]丙烷磺酸鹽、3-(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽、3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙烷磺酸鹽、正-十二烷基α-D-麥芽糖苷和它們的組合。
7.權(quán)利要求5的容器或多孔板，其中裂解試劑是分解酶并且分解酶選自β葡糖醛酸糖苷酶、葡聚糖酶、蝸牛酶、溶菌酶、溶細(xì)胞酶、甘露聚糖酶、變?nèi)芫?、消解酶、纖維素酶、溶葡萄球菌素、果膠酶、鏈球菌溶血素O，和它們的多種組合。
8.權(quán)利要求5的容器或多孔板，其中裂解試劑是離液劑并且所述離液劑選自尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍、硫代硫酸胍和硫脲，或它們的任意組合。
9.權(quán)利要求5的容器或多孔板，其中裂解試劑還包含緩沖劑、消泡劑、膨脹劑、底物結(jié)合酶，或者酶抑制劑，或者它們的任意組合。
10.權(quán)利要求2的容器或者權(quán)利要求4的多孔板，其中捕獲配體是金屬螯合物、谷胱甘肽、生物素、鏈霉抗生物素蛋白、抗體、帶電顆粒，或者不溶性疏水基團。
11.權(quán)利要求10的容器或多孔板，其中捕獲配體是對SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.3特異的抗體。
12.權(quán)利要求10的容器或多孔板，其中捕獲配體是金屬螯合物，其來源于相應(yīng)于下式的成分 其中Q是載體；S1是間隔區(qū)；L是-A-T-CH(X)-或-C(＝O)-；A是醚、硫醚、硒醚或者酰胺鍵；T是鍵或者經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基或者鏈烯基；X是-(CH2)kCH3、-(CH2)kCOOH、-(CH2)kSO3H、-(CH2)kPO3H2、-(CH2)kN(J)2、或-(CH2)kP(J)2、優(yōu)選-(CH2)kCOOH或-(CH2)kSO3H；k為0到2的整數(shù)；J為烴基或者取代烴基；Y為-COOH、-H、-SO3H、-PO3H2、-N(J)2、或-P(J)2、優(yōu)選-COOH；Z為-COOH、-H、-SO3H、-PO3H2、-N(J)2或-P(J)2、優(yōu)選-COOH；和i為0到4的整數(shù)，優(yōu)選1或2。
13.權(quán)利要求12的容器或多孔板，其中金屬螯合物來源于選自下面的組分 和 其中Q為載體。
14.從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的方法，該方法包含(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V，和至少一部分內(nèi)表面上的裂解試劑涂層，所述內(nèi)表面包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，經(jīng)涂布的內(nèi)表面的面積SA與體積V的比值小于約4mm2/μl，和(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成細(xì)胞殘渣。
15.從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的方法，該方法包含(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V、裂解試劑和受支持的捕獲配體，所述內(nèi)表面包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，側(cè)壁結(jié)構(gòu)在底部和口之間，口作為向容器導(dǎo)入液體的入口和從容器除去液體的出口，(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成固態(tài)細(xì)胞殘渣；和(c)在固態(tài)細(xì)胞殘渣的存在下用捕獲配體捕獲細(xì)胞組分。
16.制備用于從宿主細(xì)胞提取細(xì)胞組分的容器或多孔板的方法，所述方法包含將容器或者多孔板的多個孔的內(nèi)表面與含有裂解試劑的液體接觸并干燥液體以在容器或者孔的內(nèi)表面上形成裂解試劑的吸附層。
17.權(quán)利要求14、15或16的方法，其中裂解試劑選自去污劑、分解酶、離液劑和它們的組合。
18.權(quán)利要求17的方法，其中裂解試劑是去污劑并且去污劑選自3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽、辛基-β-硫代吡喃葡糖苷、辛基-吡喃葡糖苷、3-(4-庚基)苯基3-羥基丙基)二甲基銨基丙烷磺酸鹽、3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻?；被?銨基]丙烷磺酸鹽、3-(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽、3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸內(nèi)鹽、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙烷磺酸鹽、正-十二烷基α-D-麥芽糖苷和它們的組合。
19.權(quán)利要求17的方法，其中裂解試劑是分解酶并且所述分解酶選自β葡糖醛酸糖苷酶、葡聚糖酶、蝸牛酶、溶菌酶、溶細(xì)胞酶、甘露聚糖酶、變?nèi)芫?、消解酶、纖維素酶、溶葡萄球菌素、果膠酶、鏈球菌溶血素O，和它們的多種組合。
20.權(quán)利要求17的方法，其中裂解試劑是離液劑并且所述離液劑選自尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍、硫代硫酸胍和硫脲，或它們的任意組合。
21.權(quán)利要求17的方法，其中裂解試劑還包含緩沖劑、消泡劑、膨脹劑、底物結(jié)合酶，或者酶抑制劑，或者它們的任意組合。
22.權(quán)利要求15的方法，其中捕獲配體是金屬螯合物、谷胱甘肽、生物素、鏈霉抗生物素蛋白、抗體、帶電顆粒，或者不溶性疏水基團。
23.權(quán)利要求22的方法，其中捕獲配體是對SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.3特異的抗體。
24.權(quán)利要求22的方法，其中捕獲配體是金屬螯合物，其來源于相應(yīng)于下式的成分 其中Q是載體；S1是間隔區(qū)；L是-A-T-CH(X)-或-C(＝O)-；A是醚、硫醚、硒醚或者酰胺鍵；T是鍵或者經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基或者鏈烯基；X是-(CH2)kCH3、-(CH2)kCOOH、-(CH2)kSO3H、-(CH2)kPO3H2、-(CH2)kN(J)2、或-(CH2)kP(J)2、優(yōu)選-(CH2)kCOOH或-(CH2)kSO3H；k為0到2的整數(shù)；J為烴基或者取代烴基；Y為-COOH、-H、-SO3H、-PO3H2、-N(J)2、或-P(J)2、優(yōu)選-COOH；Z為-COOH、-H、-SO3H、-PO3H2、-N(J)2或-P(J)2、優(yōu)選-COOH；和i為0到4的整數(shù)，優(yōu)選1或2。
25.從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的方法，該方法包含(a)將含有宿主細(xì)胞的液體懸浮物導(dǎo)入容器，該容器具有口、內(nèi)表面、體積V、裂解試劑和受支持的捕獲配體，所述內(nèi)表面包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部，側(cè)壁結(jié)構(gòu)在底部和口之間，口作為向容器導(dǎo)入液體的入口，(b)裂解容器中的宿主細(xì)胞以釋放細(xì)胞組分和形成固態(tài)細(xì)胞殘渣；和(c)在固態(tài)細(xì)胞殘渣的存在下用捕獲配體捕獲細(xì)胞組分，(d)從捕獲配體釋放細(xì)胞組分，和(e)回收釋放的細(xì)胞組分。
26.用于從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1或2的容器或者權(quán)利要求3的多孔板和從宿主細(xì)胞提取和分離細(xì)胞組分的使用說明書。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其還包含用于測定或檢測被捕獲的細(xì)胞組分的試劑。
28.權(quán)利要求2的容器，其中該容器包含具有內(nèi)腔的柱，所述腔包含結(jié)合有捕獲配體的樹脂床和包含裂解試劑的凍干塊。
全文摘要
本發(fā)明提供了涉及從宿主細(xì)胞提取或提取和分離細(xì)胞組分的容器、方法和試劑盒。更具體地，本發(fā)明容器包含口、包含側(cè)壁結(jié)構(gòu)和底部的內(nèi)表面、體積、裂解試劑；和在一些情況中，受支持的捕獲配體。還提供了使用本文描述的容器從宿主細(xì)胞提取或提取和分離細(xì)胞組分的方法和試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK1813059SQ200480018193
公開日2006年8月2日 申請日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月2日
發(fā)明者W·K·卡普爾, R·J·梅海伊, E·A·詹金斯 申請人:西格瑪-奧爾德利希公司