專利名稱：用于治療傳染病和腫瘤的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及拮抗劑的應(yīng)用，具體的說，涉及用于治療持續(xù)感 染和月中瘤的PD-1 4吉4元物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
宿主免疫應(yīng)答的免疫抑制在持續(xù)感染和腫瘤免疫抑制過禾呈 中起著重要的作用。持續(xù)感染是一種傳染病，這種傳染病的病毒不明確，但是一直存在于受感染個體的特定細(xì)胞中。持續(xù)感染通 常包括潛伏階段和生產(chǎn)性感染階段，在生產(chǎn)性感染階段不會快速 的致死訴諸細(xì)力包或者對宿主細(xì)力包產(chǎn)生過度損害。這里有三種持久性病毒-宿主相互作用潛伏期、慢性感染和'f曼感染。潛伏性感 染的特點(diǎn)在于初次感染之后持續(xù)存在的感染性病毒，并且可能包 括慢性或者循環(huán)性疾病。慢感染的特點(diǎn)在于進(jìn)行性疾病之后漫長 的潛伏期。與潛伏的和'隄性感染不同，慢感染可能不會從^/L型的 病毒復(fù)制開始。在持續(xù)感染期間，病毒基因組或者一皮穩(wěn)、定的整合 到細(xì)胞DNA中，或者一皮維持在附加體上。某些病毒會產(chǎn)生持續(xù) 感染，所述病毒例如人類T細(xì)月包白血病病毒、i矣-巴二氏病毒、 細(xì)月包月巴大病毒、皰滲病毒、7jc痘-帶;)犬皰滲病毒、家畜嚢蟲病、 乳多空病毒、朊病毒、肝炎病毒、&泉病毒、孩1細(xì)小病毒和乳頭^]犬 瘤病毒。用于維持持續(xù)感染的4幾制包括病毒和細(xì)J包基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 以及宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的修飾。通過各式各樣的刺激可以使?jié)摲?性感染再激活。所述刺激包括細(xì)月包生理學(xué)方面得變4匕、另一種病 毒的過度感染和身體緊張或外傷。宿主免疫抑制反映常常與許多 持續(xù)性病毒感染的再活化有關(guān)。許多研究表明在診斷出癌癥的病人體內(nèi)缺乏免疫反應(yīng)。已經(jīng) 識別出許多與具體的癌癥相關(guān)的胖瘤抗原。4艮據(jù)多重的實體腫瘤 已經(jīng)定義了"i午多腫瘤4元原通過免疫性定義的MAGE 1、 2、 3; MART-l/黑素-A、 gplOO、癌胚抗原(CEA) 、 HER-2、粘蛋 白(即，MUC-1 )、前列腺-特異性抗原(PSA)、和前列腺酸性 磷酸酶(PAP)。此夕卜，病毒蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病毒(HBV)、 埃-巴二氏病毒蛋白(EBV)和人類乳頭瘤(HPV)病毒蛋白已經(jīng) #/〖正明分別在肝細(xì)月包性肝癌、'淋巴A泉瘤、和頸部癌的發(fā)展過禾呈中是十分重要的。然而，由于診斷出患有癌癥的病人的免疫抑制作 用，這些病人天生的免疫系統(tǒng)通常不能應(yīng)答腫瘤抗原。:故動免疫療法和主動免疫療法都已經(jīng)^皮建議用于腫瘤的治 療過程中。被動免疫性向所關(guān)心的主體提供了免疫反應(yīng)的 一種組 分，例如抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。自動免疫療法利用一種治療劑 來活化內(nèi)源性免疫反應(yīng)，所述治療劑例如細(xì)月包因子、抗體或4匕合 物，其中，所述免疫系統(tǒng)開始將腫瘤識別為外源物質(zhì)。被動免疫 療法和主動免疫療法二者的引入已經(jīng)在特定的癌癥類型的治療 方面取〗尋了成功?？偟膩韎兌，這里存在一種需要，來^是供安全并且有效的治療 疾病的治療方法，所述疾病例如，自身免疫性疾病、炎癥性紊亂、 變應(yīng)性、移植排異反應(yīng)、癌癥、免疫缺陷、及其他與免疫系統(tǒng)有 關(guān)的紊亂。發(fā)明內(nèi)容這里公開了在引入程序性死亡-1多肽(PD-1 )之后使抗原特 異性CD8+ T細(xì)胞變得在功能上對傳染性試劑或者腫瘤抗原有耐 受性(惰性)。因此，通過減少程序性死亡-1多肽(PD-1)的表 達(dá)或活性來^R高免疫反應(yīng)對傳染性試劑或腫瘤細(xì)胞的特異性。患 有傳染病的患者，例如患有持續(xù)感染的患者可以使用程序性死亡 -1多肽(PD-1 )拮抗劑來治療?；加心[瘤的患者也可以-使用程序 性死亡-1多肽(PD-1 )拮抗劑來治療。另外，該患者可以通過移 才直治療有歲文量的活^b的T細(xì)"包來治療，所述活化的T細(xì)力包能夠識 別與治療有效量的程序性死亡-1多肽(PD-1 )拮抗劑結(jié)合的所關(guān) 心的4元原。在幾個實施方案中，7>開了用于誘導(dǎo)對哺乳動物主體中所關(guān) 心的抗原的免疫反應(yīng)。所述方法包括:對主體纟合藥治療有效量的活 化的T細(xì)胞和治療有效量的程序性死亡-1 (PD-1 )拮抗劑，其中在T細(xì)J包中特異性識別所關(guān)心的抗原。所述主體可以是所關(guān)心的任意患者，包括患有病毒感染的患者，例如，患者持續(xù)性病毒感 染的患者，或者患有腫瘤的患者。在其他的實施方案中，/>開了一種方法，這種方法用于在哺乳動物受體中"i秀導(dǎo)對所關(guān)心的抗原的免疫反應(yīng)。所述方法包4舌將 一定lt量的供體細(xì)力包與預(yù)先選定的所關(guān)心的4元原相4妄觸，其中所 述供體細(xì)胞選自相同的哺乳動物種類并且包括含有抗原遞呈細(xì) 胞(APCs)的T細(xì)胞，所述預(yù)先選定的抗原通過抗原遞呈細(xì)胞 (APCs)呈遞到T細(xì)胞中，/人而在程序性死亡(PD)畫l拮抗劑 存在的條件下，產(chǎn)生一定數(shù)量的供體活化的T細(xì)胞。治療有效量 的供體活化的T細(xì)胞群體被移植入受體中。受體也是一種治療有 步爻量的考呈序性死亡(PD) -l拮抗劑。在某些實施方案中，7>開了用于治療感染上病原體的方法， 例如，治療一種持續(xù)感染的方法。本方法包4舌對主體纟合藥治療有 效量的程序性死亡(PD-1 )拮抗劑和一種來自病原體的治療有效 量的抗原的分子。實例性的病原體包括病毒和真菌病原體。在進(jìn) 一步;也實施方案中，7>開了用于治療患有腫瘤的主體的方法。本 方法包括對主體給藥治療有效量的程序性死亡(PD-1 )拮抗劑和 一種治療有效量的腫瘤抗原或編碼該腫瘤抗原的核酸。才艮據(jù)下面只于幾個實施方案的詳細(xì)"i兌明，并參考附圖，前述的 其他特點(diǎn)和優(yōu)勢會變得更加顯而易見。


圖1A是一種條形圖，顯示了禾呈序性死亡-1 (PD-1) mRNA 在DbGP33-41和/或DbGP276-286特異性T細(xì)胞中的水平，所述 DbGP33-41和/或DbGP276-286特異性T細(xì)月包來自未實驗的轉(zhuǎn)基 因老鼠，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)阿姆斯特朗免 疫(感染后大約30天)感染的老鼠或CD4-衰竭的LCMV-C1-13 感染的老鼠(感染后大約30天)，通過基因矩陣分4斤來調(diào)節(jié)。圖1B是一系列流式細(xì)胞計量術(shù)實驗圖，顯示了在LCMV阿姆 斯特朗免疫和CD4衰竭LCMV-C1-13感染的老鼠體內(nèi)感染大約60 天之后在CD8+四聚體T細(xì)胞上程序性死亡多肽PD-1表面表達(dá)。在 用LCMV-C1-13病毒進(jìn)行慢性感染(標(biāo)記為"慢性的")大約60天之 后，無反應(yīng)性的CD8+ T細(xì)胞在該細(xì)胞表面表達(dá)高水平的程序性死 亡多肽(PD-1 ) ， 4旦是在清除急性LCMV阿姆其斤特朗感染之后(標(biāo) 記為"免疫")，病毒-特異性CD8十T細(xì)胞不表達(dá)程序性死亡多肽 (PD-1 )。圖1C是一系列流式細(xì)^^計量術(shù)實-驗圖，顯示了來自長期感 染和未感染的老鼠體內(nèi)的脾細(xì)胞中PD-L1的存在。這一結(jié)果i正明 PD-L1在^皮病毒感染的脾細(xì)胞上表達(dá)量是最高的。圖2A是一系列散布圖，顯示了與未治療的參照相比，當(dāng)從 感染后第23-37天開始7十C1-13感染的老鼠進(jìn)4亍治療時， DbNP396-404特異性和DbGP33-41特異性CD8+ T細(xì)胞存在大約 2倍的增加。為了確定在功能方面的變化，作為對8種不同的 LCMV 4元原決定《i的響應(yīng)，測定IFN-y和TNF-a的產(chǎn)量。圖2B 是一種散布圖，顯示了當(dāng)測定所有已知的CD8+T細(xì)胞特異性時， LCMV特異性CD8+ T細(xì)胞的總數(shù)存在2.3倍的增力口。圖2C是 一系列:流式細(xì)月包計圖，顯示了響應(yīng)于8種不同的LCMV ^元原決定簇時IFN-y和TNF-a的產(chǎn)量。圖2D是一種散布圖，顯示了受 治療的小鼠體內(nèi)更多的病毒特異性CD8+ T細(xì)胞能夠生產(chǎn) TNF-a。圖2E是一系列直方圖，顯示了 PD-L1阻斷劑也會在脾、 肝、肺和血清中導(dǎo)致增加的病毒控制。圖3A顯示，相對于參照(標(biāo)記為"untx") ， 乂人感染后第46天 到60天，在CD4-衰竭C1-13感染的老鼠體內(nèi)，DbGP276-286特異 性CD8十T細(xì)胞(標(biāo)記為GP33和GP276)的凄t目增力口。所述老鼠 用抗-PD-Ll(標(biāo)i己為"PD-L1")處理。這一結(jié)果"i兌明，用抗-PD-Ll (標(biāo)"i己為"PD-L1")處理后的老鼠比未^皮處J里的老鼠多大約74咅 的DbGP276-286特異性脾CD8十T細(xì)月包和大約44咅的DbGP33-41特 異性脾〔08+ T細(xì)胞。圖3B是一系列流式細(xì)胞計實驗圖像，顯示 了與未4皮處理的參照(才示i己為"untx，，)相比，,人感染后第46天到 60天，在用抗-PD-Ll (標(biāo)記為"PD-L1")處理過的CD4-衰竭的 Cl-13感染后的老鼠的脾臟中，DbGP33-41和DbGP276-286特異 性CD8十T細(xì)胞出現(xiàn)的頻率增加。圖3C是一系列流式細(xì)胞計實-驗 圖像，顯示了通過5-溴脫氧尿核普結(jié)合和Ki67表達(dá)測定的抗 PD-Ll-處理后的小鼠體內(nèi)DbGP276-286特異性CD8十T細(xì)胞增加 的增殖。圖30顯示了具有高008+ T細(xì)胞擴(kuò)張水平的小鼠，通過 比較外周血液單核細(xì)胞(PBMC)中0&0 276特異性008+T細(xì)胞 和脾中的060 276-286特異性€08+ T細(xì)胞顯示了在外周血液單 核細(xì)月包(PBMC)中可評估的反應(yīng)。圖4A是一系列圖表顯示了與參照相比，在抗-PD-Ll-治療后 的老鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生IFN-y的DbGP276-286和DbGP33-41特異 性CD8+T細(xì)胞的增力口。在抗-PD-Ll-治療后的老鼠體內(nèi)還4全測出 較高出現(xiàn)頻度的DbNP396-404、 KbNP205-212、 DbNP 166-175和 DbGP92-101特異性CD8+ T細(xì)胞。圖4B表明了在抗-PD-Ll-治 療后的老鼠體內(nèi)，50%的DbGP276-286特異性CD8+ T細(xì)月包能夠16產(chǎn)生IFN-y，與此相比，在參照老鼠體內(nèi)只有20%的DbGP276-286 特異性CD8+T細(xì)月包能夠產(chǎn)生IFN-y。圖4C是一系列流式細(xì)月包計 實驗圖像，表明了相對于未處理過的慢性感染后的老鼠，抗 -PD-L1 -處理的'f曼性感染后的老鼠能夠產(chǎn)生4交高水平的TNF-a， 但是相對于用LCMV阿姆斯特朗病毒感染后的免疫老鼠，抗 -PD-L1 -處理的'f曼性感染后的老鼠只能產(chǎn)生的4交^f氐水平的TNF-a。 圖4D是〗吏用51Cr釋》文試-驗測定的結(jié)果，顯示了與未處理的感染 的老鼠相比，用抗-PD-Ll處理LCMV-C1-13感染的老鼠后，能夠 更新病毒特異性T細(xì)胞的體外溶解活性。圖4E是一系列圖標(biāo)， 表明在經(jīng)過抗-PD-Ll-處理的LCMV-C1-13感染老鼠的各個器官 中病毒滴定度的減少。與未經(jīng)處理的老鼠相比，在用抗-PD-Ll 治療兩星期后，在脾臟中，病毒滴定度減少了大約3倍，在肝臟 中，病毒滴定度減少了4倍，在肺中，病毒滴定度減少了2#~， 在血清中，病毒滴定度減少了2倍。
圖5A是一系列流式細(xì)胞計實驗圖像，顯示了使用IO種艾滋病 病毒四聚物進(jìn)4于的PD-1表面表達(dá)，所述艾滋病病毒四聚物對起支 配作用的抗原決定簇具有特異性，所述起支配作用的抗原決定簇 耙向慢性分化體C艾滋病病毒感染。所述百分比表示的是PD-1十 四聚體細(xì)胞百分比。圖5B是一系列圖表顯示了在未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療的個體中，與總CD8十T細(xì)胞群體相比，艾滋病病毒-特異 性CD8+ T細(xì)胞上PD-1的百分比和MFI #皮顯著的上調(diào)了 (p<0.0001 ),并且，相對于艾滋病病毒-血清反應(yīng)陰性的對照物， 艾滋病病毒-感染的總CD8十T細(xì)胞群種上的PD-1增力口 (p分另'J為 p=0.0033—p<0.0001 )。從65個艾滋病病毒-感染的個體和ll個艾 滋病病毒血清反應(yīng)陰性對照物處獲得120種艾滋病病毒四聚物著 色體，對這些著色體進(jìn)校分析。圖5C顯示了四聚體+細(xì)胞上？0-1 + 表達(dá)的中值百分比和MFI。圖5D描繪了進(jìn)行多重可沖企測反應(yīng)的個 體內(nèi)不同抗原決定簇特異性群體上PD-l +細(xì)胞百分比的變化。橫
17條信號表明各個個體內(nèi)PD-l+艾滋病病毒四聚體細(xì)胞的中值百分 比。
圖6A是一系列圖表，表明在通過四聚體染色劑測定之后，艾 滋病病毒-特異性。08+ T細(xì)胞的數(shù)目和血漿病毒負(fù)載量之間沒有 關(guān)系，而在四聚體細(xì)胞上PD-1的百分比和MFI都與血漿病毒負(fù)載 量成正比(p分另'J為p-0.0013和pO.0001 )。圖6B是一系歹寸圖表， 表示艾滋病病毒四聚體細(xì)胞和CD4計數(shù)之間沒有關(guān)系，而四聚體 細(xì)月包上PD-1的百分比和MFI都與CD4計凄t成反比(p分別為 p二0.0046和p-0.0150 )。圖6C表明在總CD8十T細(xì)月包群種上PD誦1 的百分比和MFI與血漿病毒負(fù)載量正向相關(guān)(p分另'J為p-0.0021 和p〈0.0001 )。圖6D描述了在總CD8十T細(xì)胞群種上PD-1的百分 比和MFI與CD4i十凄tA向才目關(guān)(p^另'J為p^0.0049^p:0.0006)。
圖7A是一 系列流式細(xì)胞計實驗圖像，顯示了從主體SK222獲 得的B承4201 TL9-特異性CD8+T細(xì)胞的代表性的表型染色，在所 述主體SK222中，98%6々B*4201 TL9-特異性CD8十T細(xì)月包是 PD-l + 。圖7B表示了人的表型數(shù)據(jù)概要，在這些人中，95%以上 的艾滋病病毒-特異性CD8十T細(xì)胞是PD-l+。對于每個指定的表型 標(biāo)記物，分析7到19個樣品。所述4黃條表明四聚體+PD-l+細(xì)胞的 中值百分比，所述細(xì)胞對指定的標(biāo)記物是陽性的。
圖8A是一系列流式細(xì)胞計實-驗圖像，表示了aB * 4201陽性 主體的代表性的增值實驗數(shù)據(jù)。在用肽刺激6天之后，在有抗 -PD-Ll阻斷抗體參與的情況下，B*4201 TL9-特異性CD8十T細(xì)胞 的百分比從5.7%增力口到12.4%。圖8B是一種線狀圖，描述了相JU舌 性的增殖試驗數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示在有抗-PD-L 1阻斷抗體參與的情 況下，艾滋病病毒-特異性。08+ T細(xì)胞的增值作用有顯著的增加 (n=28， p=0.0006，只十偶T枱N驗)。圖8C是一種條形圖，顯示了 各個病人身上？0-1/ 0丄1阻斷劑對艾滋病病毒-特異性008+ T細(xì)胞增殖作用的區(qū)別效應(yīng)。白色信號棒顯示了在肽單獨(dú)存在的情況
下四聚體+細(xì)胞的成倍增加，黑色信號棒顯示了在肽和抗-PD-Ll 阻斷抗體存在的情況下四聚體+細(xì)力包的成倍增加。對一個以上抗 原決定簇進(jìn)行CFSE試驗的個體分別用星號、正方形或三角形符 號表示。
圖9A-9D是一 系列圖和圖表顯示了在慢性感染的老鼠體內(nèi)， 與PD-L1阻斷劑結(jié)合的治療性疫苗對抗原-特異性CD8-T細(xì)胞出 現(xiàn)率和病毒滴定度的協(xié)同效應(yīng)。圖9A是實-驗方案的示意圖顯示了 在感染后第4周對LCMV克隆-13 (CL-13)-感染的老鼠^妻種野生 型牛痘病毒疫苗(VV/WT)或表達(dá)LCMV GP33-41單抗原決定簇 的牛痘病毒疫苗(VV/GP33 )。同時，每隔兩天用或者不用抗PD-L1 處理老鼠5次。圖9B是一系列流式細(xì)胞計實驗圖像，顯示了治療 后1星期GP33-特異性CD8-T細(xì)胞和GP276-特異性CD8-T細(xì)胞在 PBMC中的頻率。凄t目^表每個CD8-T細(xì)月包中四聚體-陽性細(xì)月包的 頻率。數(shù)據(jù)顯示的是三個實驗的數(shù)據(jù)。圖9C-9D顯示了治療之后 GP33-特異性CD8-T細(xì)胞和GP276-特異性CD8-T細(xì)胞在血液中的 出現(xiàn)頻率(圖9C)和病毒滴定度(圖9D)。在指定的時間點(diǎn)， 分別用四聚體染色劑和噬菌斑試驗來檢測血液中四聚體-卩曰性 CD8-T細(xì)胞凄t目和病毒滴定度的變化。同時顯示了用VV/WT或 VV/GP33 (直線)感染并用抗-PD-Ll處理(陰影區(qū))之后，個體 老鼠(上面的四組)和多種老鼠(下面一組)中四聚體-陽性CD8-T 細(xì)胞的數(shù)目和病毒滴定度。虛線表示了病毒4全測限制，從三組實 驗中取平均值作為實驗結(jié)果。
圖IOA-IOD是一種圖表和數(shù)字圖像，顯示了小鼠不同的組織 中增加的抗原特異性CD8-T細(xì)胞和提高的病毒控制，所述小鼠用 結(jié)合有PD-L1阻斷劑的治療性疫苗處理。圖10A是一 系列流式細(xì) 胞計實驗圖像顯示了治療4星期后GP 3 3 -特異性C D 8 - T細(xì)胞在不同的組織中的出現(xiàn)率。數(shù)字代表了每CD8-T細(xì)胞中GP33四聚體-陽性細(xì)胞的出現(xiàn)率。所述數(shù)據(jù)代表了兩個實驗的實驗數(shù)據(jù)。圖1OB顯示了治療4星期后GP33-特異性CD8-T細(xì)月包在不同的組織中的數(shù)目。圖10C是一系列條形圖顯示了治療后2周(黑色柱)和4周(空白柱)后在指定的組織中的病毒滴定度。虛線表示病毒4全測限制。每組的老鼠數(shù)11=6。從兩組實驗數(shù)據(jù)中取平均值作為結(jié)果。圖10D是治療兩周后，帶有LCMV抗原(紅色)的脾免疫著色劑數(shù)字圖像?！氛纱蟊稊?shù)，x20。
圖11A-11D顯示了用結(jié)合有PD-L1阻斷劑的治療性疫苗來提高耗盡的CD8-T細(xì)胞中的功能恢復(fù)能力。圖IIA是一系列流式細(xì)胞計實驗圖像，顯示了通過治療后4星期免疫老鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行的IFN-r生產(chǎn)和脫粒。在有aCD107a/b抗體參與的情況下，用指定的肽刺;敫脾細(xì)月包，然后與IFN-R共同染色。
圖11A-11D表示了通過治療性疫苗結(jié)合PD-L1阻斷劑造成的耗盡CD8-T細(xì)胞的提高的功能恢復(fù)。圖IIA是一系列流式細(xì)胞計試驗圖像，顯示了接種疫苗的老鼠在治療4星期后皮細(xì)胞中IFN-y的產(chǎn)生和脫4立。4吏用指定的多肽，在aCD107/ab抗體存在的情況下刺激脾細(xì)月包，然后為了 IFN-y進(jìn)^亍共染色。所示附圖4十對CD8-T細(xì)胞，并且代表了兩個相互獨(dú)立的試驗。圖IIB顯示了每個CD8-T細(xì)胞中IFN-y+CD107+細(xì)胞的百分比，這里的CD-8細(xì)胞對圖11A中所示的LCMV肽具有特異性，所述IFN-/CD107+細(xì)胞的百分比是從多個小鼠(對于每個反應(yīng)n=6)中概況所得的。所得結(jié)果為兩個實—驗所共有。圖IIC顯示了 CD8-T細(xì)胞中TNF-a的生產(chǎn)，其中，所述CD8-T細(xì)胞能夠在接種疫苗的老鼠體內(nèi)產(chǎn)生IFN-y。在用GP33-41或者GP276-286肽刺激脾細(xì)月包之后，產(chǎn)生IFN-y的CD8-T細(xì)胞是門控的，并且使用IFN-y( X軸)對TNF-a(Y軸)繪制曲線。在曲線上較高或者較低的數(shù)值分別表示
20TNF-a+細(xì)胞相對于IFN-y+細(xì)胞的頻率和IFN々+的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。凄t據(jù)^表了兩個相互獨(dú)立的試-驗。圖IID顯示了用于圖11C所示GP33-41或者GP276-286肽的每個IFN-y+細(xì)月包中TNF-a+細(xì)胞的百分比，該百分比是從多個小鼠(對于每個反應(yīng)n=6)中概況得到的。
圖12A-12B顯示了與PD-L1阻斷劑結(jié)合的治療性疫苗的作用能夠改變慢性感染的老鼠體內(nèi)抗原特異性CD8-T細(xì)胞表型。圖12A表示了 GP33四聚體特異性CD8-T細(xì)胞在PBMC中治療后指定的時間點(diǎn)的表型。針對GP33+CD8-T細(xì)胞繪制柱狀圖。圖中的百分?jǐn)?shù)表示了能夠高水平的表達(dá)CD27或者CD 127的群體的出現(xiàn)頻率。絲氨酸蛋白酶B在柱狀圖上的數(shù)值代表了表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。這些數(shù)據(jù)代表了三個不同的試驗。圖12B顯示了在治療四周之后不同組織中GP33四聚體特異性CD8-T細(xì)胞的表型改變。針對GP33+CD8-T細(xì)胞繪制柱狀圖。圖中的百分?jǐn)?shù)表示了能夠高水平的表達(dá)CD127或者PD-1的群體的出現(xiàn)頻率。絲氨酸蛋白酶B和Bcl-2在柱狀圖上的數(shù)值代表了表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。這些凝:據(jù)代表了兩個不同的試-驗。
圖13A-13E顯示了與PD-L1阻斷劑相結(jié)合的治療性疫苗在'恢復(fù)"無幫助性，，耗盡的CD8 T細(xì)胞功能恢復(fù)方面的協(xié)同效應(yīng)。圖13A是方案的示意圖。使小鼠的CD4 T細(xì)胞衰竭，然后用LCMV克隆-13感染。在感染七星期后， 一些老鼠用野生型的疫苗性病毒(VV/WT)或者LCMV GP33-41抗原決定簇表達(dá)性疫苗病毒(VV/GP33)接種疫苗。同時，使用aPD-Ll或其同型體每三天治療小鼠5次。在最初的抗體治療5周之后，殺死老鼠進(jìn)行分析。圖13B是一系列流式細(xì)月包計圖和一種柱狀圖，表示了治療四星期后GP33-特異性CD8-T細(xì)胞在指定的組織中的出現(xiàn)頻率。數(shù)值代表了每個CD-T細(xì)胞中GP33四聚體-陽性細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。另外
21還相ii舌了治療兩星期之后在不同組織的CD8-T細(xì)胞中GP33-特異 性細(xì)月包的出現(xiàn)頻率。圖13C是一系列流式細(xì)月包計圖，表示了試-驗 所得結(jié)果。其中在aCD107 a/b抗體存在的情況下用GP33肽刺激 脾細(xì)胞，并隨后為了 IFN-Y進(jìn)行共染色。針對CD8-T細(xì)胞繪圖。 概括多個小鼠的對GP33肽具有特異性的CD8-T細(xì)胞中 IFN-y+CD107+細(xì)胞的百分率。圖13D顯示了在用GP33肽刺激之 后每個Db-限制性GP33-41四聚體陽性細(xì)胞中IFN-y+細(xì)胞的百分 比，該百分比從多個老鼠中概括得出。圖13E表示了在治療兩星 期后在指定的組織中的病毒滴定度柱狀圖。所有的制圖都代表了 兩個試驗并且所概括的結(jié)果味兩個實現(xiàn)所共有(n=6只老鼠/組)。
圖14A-14B顯示了在轉(zhuǎn)移到天然攜帶的老鼠體內(nèi)之后， PD1/PD-L1信號途徑阻斷劑能夠增加抗原特異性T細(xì)胞的總數(shù)。 全脾細(xì)月包一皮用于轉(zhuǎn)移到經(jīng)過或者沒有經(jīng)過抗PD-L1治療的天然 攜帶的老鼠體內(nèi)。圖14A代表了流式細(xì)胞計圖形，其表示了兩個 獨(dú)立的試-險中，Db GP33-特異性CD8 T細(xì)胞在外周血液中擴(kuò)增 的動力學(xué)(11=6只老鼠/組)。
圖15A-15E顯示了在經(jīng)過可應(yīng)用的T細(xì)月包免疫治療之后， PD1/PD-L1信號途徑阻斷劑能夠4是高抗原特異性CD8 T細(xì)胞中 細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)移后第17天分離脾細(xì)月包并分析4吏用抗原 性肽刺激后的細(xì)胞因子表達(dá)作用。圖15A顯示了在用定義的CD8 抗原決定li或者無肽參照物刺激5小時之后通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 染色評價的IFNy的表達(dá)作用。圖15B和圖15D顯示了 TNFa或 者107ab和IFNy的二重表達(dá)作用(四角星 表CD8門百分比)。 圖15C和圖15E顯示了生產(chǎn)IFNy同時生產(chǎn)TNFa或者107ab的 細(xì)i包的百分比(r^3只動物/《且)。
圖16A-圖16B顯示了在LCMV克隆-13感染的小鼠體內(nèi)抗體 分泌細(xì)胞增力。的7K平。通過ELISPOT和CD138染色對患有慢性LCMV感染的小鼠進(jìn)行aPD-Ll治療，之后測定總抗體分泌細(xì)胞 的水平。圖16A顯示了脾抗體分泌細(xì)月包總量，這是/人三個獨(dú)立的 試驗中概括所得的。圖16B顯示了脾臟中抗體分泌細(xì)胞(ASC) 的增加可以通過標(biāo)記物CD138來測定。如一個代表性的圖中所 示，抗體分泌細(xì)月包是CD 13 8+和B220 4氐/中4直(、淋巴細(xì)月包上的門 閥)。
圖17顯示，用抗-PD-Ll治療慢性LCMV感染的老鼠不會導(dǎo) 致骨髓抗體分泌細(xì)胞水平的提高。在用ELISPOT計算在進(jìn)行(a) PD-L1治療14天之后，患有慢性LCMV感染的小鼠體內(nèi)脾臟和 骨髓中抗原分泌細(xì)l包的總凄t 。線條表示了試-驗組的幾何平均婆丈。
圖17顯示用抗-PD-Ll治療慢性LCMV感染的小鼠并不會提 高骨髓中抗體分泌細(xì)胞的水平。在用ELISPOT計算在進(jìn)行(a) PD-L1治療14天之后，患有慢性LCMV感染的小鼠體內(nèi)脾臟和 骨髓中抗原分泌細(xì)胞的總數(shù)。線條表示了試驗組的幾何平均數(shù)。
圖18顯示了共同鄉(xiāng)會藥aPD-Ll和aCTLA-4會導(dǎo)致脾細(xì)胞中 抗體分泌細(xì)力包的仂、同增加。對'隄性LCMV感染的小鼠纟會藥 aPD-Ll、 aCTLA-4、或者二者一起纟合藥14天，通過ELISPOT計 算脾細(xì)胞中抗體分泌細(xì)胞的總數(shù)。線條表示了治療組的幾何平均 數(shù)。
圖19A-19B顯示了^是高的B細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞增殖作用和 aPD-Ll治療的小鼠體內(nèi)生發(fā)中心活性。圖19A是CD4T細(xì)胞和 B細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖，顯示了 aPD-Ll治療之后提高的Ki-67 水平。如上面各欄所述，結(jié)果真對CD4或B細(xì)月包。圖19B顯示 了表達(dá)PNA的B增加的出現(xiàn)頻率和高水平的FAS,這一結(jié)果表 明aPD-Ll治療的小鼠體內(nèi)生發(fā)中心活性被提高。制圖是概括了 兩個分別的試-瞼結(jié)果的圖 <象。圖20A-20C表示了 CD8和CD4細(xì)胞子集中的PD-1表達(dá)。 圖20A是一系列流式細(xì)胞計實驗圖，顯示了血液中CD8+/CD3+ 淋巴細(xì)胞之間PD-1和各種表型的標(biāo)記物之間的共表達(dá)。圖20B 顯示了各種表達(dá)PD-1的CD8十/CD3+和(D) CD4十/CD3+細(xì)胞子 集的百分比。^主狀圖表示了 PD-1在含有陽性(空心圓)和陰性 (實心三角形)指定的標(biāo)記物中的平均百分比。圖20C代表了來 自 一個子集的表達(dá)PD-1的CD4+ T細(xì)胞的表型試驗數(shù)據(jù)。
圖21A-B顯示了 PD-1在對慢性感染有特異性的CD8 T細(xì)胞 中更好的表達(dá)。圖21A是一系列流式細(xì)月包計實-險圖^象，顯示了 Ebstein棒狀病毒(EBV )、巨細(xì)胞病毒(CMV )、流行性感冒 和牛痘病毒-特異性CD8 T細(xì)胞的代表性PD-1染色。并標(biāo)明了在 四聚體+細(xì)胞之間PD-1表達(dá)的熒光強(qiáng)度幾何平均數(shù)(GMFI)。 圖21B顯示了來自健康志愿者(n=35)中EBV、 CMV、流行性 感冒和牛痘病毒-特異性CD8 T細(xì)胞上PD-1的概括信息。
圖22A-C顯示了 ，抗-PD-Ll阻斷劑能夠增加對慢性感染有特 異性的CD8 T細(xì)胞體外增殖作用。圖22A是一系列流式細(xì)胞計實 驗圖像，顯示了用CFSE標(biāo)記淋巴細(xì)胞，然后在指定的情況下培 養(yǎng)6天。所述圖 <象顯示了來自EBV和CMV陽性主體典型的染色。 圖22B是一種棒狀圖，顯示了在用抗-PD-Ll阻斷抗體阻斷之后的 EBV、 CMV、流4亍性感冒和牛痘病毒抗原-特異性反應(yīng)。所述才奉 狀信號顯示了與單獨(dú)<吏用肽相比，在肽和抗-PD-L 1阻斷抗體參與 的情況下四聚體+細(xì)胞的成倍增加。圖22C顯示了抗PD-L 1抗體阻 斷劑之后四聚體+細(xì)胞成倍增加和PD-l表達(dá)(培養(yǎng)之前)之間的 關(guān)系。
圖23B-23C顯示了在患有慢性HCV傳染病的人體內(nèi)，丙型肝 炎病毒(HCV)特異性CD8十T細(xì)胞能夠表達(dá)PD-1。圖23A是5個 患有慢性HCV傳染病的病人代表性的制圖，顯示了 HCV特異性
24CD8+ T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)。黑體的數(shù)值表示了在HCV特異性 CD8+T細(xì)月包(Y軸)上PD-1表達(dá)的出現(xiàn)率(X軸)。圖中斜體的 數(shù)字表示了四聚體陽性細(xì)胞在總CD8十T細(xì)胞之中的出現(xiàn)率。在Y 軸上，1073和1406能夠識別四聚體HCV抗原決定簇特異性。通過 "Pt"，隨后通過病人數(shù)目識別病人。細(xì)胞聚集在CD8+淋巴細(xì)胞上。 繪圖以對數(shù)刻度來繪制。圖23B表示了 PD-1在來自健康供體(CD8 健康的)的CD8十T細(xì)胞上的表達(dá)、來自感染HCV病人(CD8 HCV ) 的CD8十T細(xì)月包上的表達(dá)和在CD8十HCV特異性T細(xì)月包(HCV tet+ ) 上表達(dá)的比較。圖23C顯示了，與PD-1在對HCV具有特異性的 CD8+T細(xì)胞(HCVtet+)上的表達(dá)相比，在來自HCV感染的供體 (HCV+)和健康供體(健康的)中對流行性感冒病毒具有特異 性的CD8十T細(xì)月包(Flu tet+ )上PD-1的表達(dá)。 -使用未配對的T枱、驗 法比較同一病人體內(nèi)總。08+ 丁細(xì)胞相對于11(^/特異性€08+ T細(xì) 胞上PD-1的表達(dá)。
圖24八-240顯示了肝中？0-1表達(dá)008+ T細(xì)月包的出現(xiàn)率大于 外周血液中的出現(xiàn)率。圖24A是來自5位患有慢性HCV傳染病的病 人的癥會圖，顯示了與來自肝臟中的總CD8+ T細(xì)月包中的表達(dá)相比， PD-1在來自外周血液的總CD8十T細(xì)胞中的表達(dá)。繪圖中黑體的 數(shù)字顯示了淋巴細(xì)胞門的總CD8+ T細(xì)胞中能夠表達(dá)PD-1的細(xì)胞 的出現(xiàn)率。制圖以對數(shù)比例繪制。圖24B顯示了PD-1在來自外周 血液中008+ T細(xì)月包上的表達(dá)與在來自HCVt曼性感染患者肝臟中 CD8+ T細(xì)月包上的表達(dá)的比壽交。 一使用配對T4企測法比專交PD-1在同一 病人體內(nèi)表達(dá)的差異。圖24C比較了與來自肝臟的CD8+效應(yīng)因子 記憶(TEM )細(xì)月包中PD-1表達(dá)相比，PD-1在來自外周血液的CD8+ 爻文應(yīng)因子i己憶(TEM)細(xì)月包中的表達(dá)。記憶子集可以通過CD62L 和CD45RA的差異表達(dá)來識別。在圖上部的黑體tt字表示了細(xì)胞 在每個象限的出現(xiàn)率。細(xì)胞被聚集在CD8+淋巴細(xì)胞上，所述TEM 子集被控制(裝箱)且PD-1的表達(dá)顯示在下面的直方圖中。虛線顯示了？0-1在原態(tài)。08+ T細(xì)胞(用作陰性群體)上的表達(dá)。直 方圖中的數(shù)字代表了表達(dá)PD-1細(xì)胞的出現(xiàn)率。在直方圖的下面， 概括了十位患有慢性HCV傳染病的病人體內(nèi)CD8+ TEM細(xì)胞上 PD-1表達(dá)出現(xiàn)率的比較。4吏用配對T才企驗法比4交在同一病人體內(nèi)， 在來自周圍血液中的CD8十TEM上與在來自肝臟中的CD8+ TEM 上PD-1表達(dá)的區(qū)別。圖24D是代表兩位患有慢性HCV傳染病病人 的繪圖，顯示了在來自周圍血液的總CD8十T細(xì)胞中與在來自肝臟 的總CD8十T細(xì)胞中，CD127表達(dá)的區(qū)別。黑體數(shù)字顯示了總CD8十 T細(xì)胞上CD127表達(dá)的出現(xiàn)率。細(xì)胞聚集在CD8+淋巴細(xì)胞上。繪 圖以對凄t比例繪制。CD127在來自外周血液中的總CD8屮T細(xì)胞上 的表達(dá)與在來自肝臟的總CD8十T細(xì)胞上的表達(dá)的比較概括顯示 在下面的FACS圖中。 -使用配對T枱r驗法用于統(tǒng)計分析。
圖25顯示了肝臟中的HCV特異性CD8十T細(xì)胞表達(dá)一種耗盡 的表型。表現(xiàn)了兩個患有慢性HCV傳染病的病人的外周血液和肝 臟中，11(^/特異性€08+ T細(xì)胞上PD-1和CD127表達(dá)的代表性制 圖。第一排圖代表了HCV四聚體陽性群體(方框)。方框上的數(shù) 字代表了四聚體陽性細(xì)胞在CD3+淋巴細(xì)胞中的出現(xiàn)率。HCV四 聚體的抗原決定簇特異性表示在Y軸上(1073 )。第二和第三排 圖顯示了來自兩^f立患有'l"曼性HCV傳染病的病人的外周血液和肝 臟中的HCV特異性CD8十T細(xì)胞上PD-1和CD127的表達(dá)。黑體凝: 字表示了HCV特異性CD8十T細(xì)胞上PD-1或CD127表達(dá)的頻率。 繪圖以對數(shù)刻度繪制，并聚集在CD3十CD8+淋巴細(xì)胞上。在FACS 繪圖下邊，顯示了在來自外周血液中的總CD8十T細(xì)胞和CD8十 HCV特異性T細(xì)月包上，相對于來自肝臟(HCVtet+肝)的HCV特 異性CD8十T細(xì)胞中PD-1表達(dá)(左側(cè))與CD127表達(dá)(右側(cè))的比 專交。在同 一病人內(nèi)部， -使用配只于T沖企測法比4交表達(dá)作用。
26圖26顯示了PD-1 / PD-L1途徑阻斷劑能夠增加抗原刺激的 HCV-特異性T細(xì)^^包的擴(kuò)增。在有IL-2和抗PD-L1抗體(上組)或 抗PD-1抗體(下組)參與的情況下，4吏用同源肽抗原刺激來自兩 種分離的人白細(xì)月包抗原(HLA)-八2病人的0 8￡標(biāo)記的？81^。 6 天。同樣顯示未經(jīng)刺激的參照物。在每個象限中顯示出增殖的 CFSE低-和CFSE高-HCV-特異性人類白細(xì)胞抗原(HLA ) -A2+ CD8+ T細(xì)月包的百分比。
圖27A-27D顯示了在猿免疫缺陷病毒(SIV)特異性CD8 T細(xì) 胞上，在SIV239感染之后，提高的PD-1的表達(dá)。圖27A顯示了來 自正常獼猴的總CD8 T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)。圖27B顯示了SIV239 感染的獼猴體內(nèi)，總CD8 T細(xì)胞上和SIV gag-特異性CD8 T細(xì)胞上 PD-1的表達(dá)。在SIV感染12星期后對PBMC進(jìn)行分析。圖27C提供 了正常獼猴和SIV-感染獼猴中總CD8 T細(xì)胞和SIV-特異性CD8 T 細(xì)胞上PD-1陽性細(xì)胞的概括信息。表示了感染12周之后SIV-感染 的獼猴的數(shù)據(jù)。圖27D (最后一組)提供了正常獼猴和SIV-感染 獼猴中總CD8 T細(xì)胞和SIV-特異性CD8 T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的平均 熒光強(qiáng)度(MFI)的概括信息。
圖28A-28B分別是圖和圖表，顯示了 PD-1體外阻斷劑能夠才是 高SIV-特異性CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增。來自Mamu A * Ol陽性獼猴的 PBMC感染SHIV89.6P,用P11C肽(0.1毫克/毫升)在存在或者不 存在抗PD-1阻斷抗體(10毫克/毫升)的情況下幾次該獼浙吳六天。 在刺激三天之后，加入IL-2 ( 50單位/毫升)。在刺激作用快結(jié) 束的時候?qū)?xì)胞表面進(jìn)行CD3、 CD8和Gag-CM9四聚體染色。使 用未刺激的細(xì)月包(nostim)作為陰性參照。才艮據(jù)散射作用將細(xì)月包 集合在淋巴細(xì)胞上，然后在CD3上分析CD8和四聚體的表達(dá)。圖 28A是一種代表性的FACS圖。圖上的數(shù)字代表了四聚體陽性細(xì)胞 相對于總CD8 T細(xì)胞的出現(xiàn)率。圖28B提供了來自6只獼猴的概括
27性數(shù)據(jù)。使用感染12周之后獲得的細(xì)胞進(jìn)行分析。計算四聚體陽 為增加倍數(shù)。
圖29顯示了LCMV感染之后，PD-L1、 PD-L2和PD-1在不同的 細(xì)月包型上的表達(dá)動力學(xué)。用2 10、fu的克隆-13 ( CL-13 )感染老 鼠。在感染后指定的時間點(diǎn)，PD-L1、 PD-L2、和PD-1在不同細(xì) 胞型上的表達(dá)作為一種直方圖被現(xiàn)實。PD-1在指定的細(xì)胞型上表 達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI):故顯示。
序列表
在所付序列表上列出的核酸和氨基酸順序4吏用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸 堿基標(biāo)準(zhǔn)縮寫字體來顯示，氨基酸使用37 C.F.R. 1.822.規(guī)定的三 個字母^碼來表示。核酸序列只顯示了其中一條核酸鏈，其互補(bǔ) 鏈作為所顯示鏈相對應(yīng)的核酸鏈應(yīng)該一皮理解為也被包括在本發(fā) 明中。在所附序列表中
SEQ ID NO : 1是人PD-1的示范性的氨基酸順序。
SEQ ID NO : 2是老鼠PD-1的示范性的氨基酸順序。
SEQ ID NO : 3是人PD-L1的示范性的氨基酸順序。
SEQ ID NO : 4是人PD-L2的示范性的氨基酸順序。
SEQ ID NO : 5-12是人骨架結(jié)構(gòu)區(qū)的示范性的氨基酸順序。
SEQ IDNOs : 13-35是人PD-l的示范性的氨基酸順序。
SEQ ID NOs : 36-43是主要的組織適合性肽的示范性的氨基
酸順序。
SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45是T細(xì)胞抗原決定蔟氨基酸 順序。SEQ ID NO : 46是人PD-L2變體的示范性的氨基酸順序。 SEQ ID NOs : 47-52是人PD-l的示范性的氨基酸順序。
具體實施例方式
本發(fā)明的7>開涉及PD-1拮抗劑在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)方面的應(yīng)用， 所述免疫反應(yīng)例如對腫瘤或?qū)Τ志眯圆《靖腥镜拿庖叻磻?yīng)。
術(shù)語
除非另有i兌明，這里Y吏用的4支術(shù)術(shù)語是4艮據(jù)其傳統(tǒng)用法來僅: 用的。在分子生物學(xué)領(lǐng)域普通術(shù)語的定義可以在在下列文獻(xiàn)中找 到由牛津大學(xué)出版社與1994年出版的Benjamin Lewin所著的"基 因V，，(國際標(biāo)準(zhǔn)圖書編號0-19-854287-9);由Blackwell科學(xué)股4分
科全書"(國際標(biāo)準(zhǔn)書號0-632-02182-9 );和由VCH出版股份有 限公司于1995年出X反的Robert A. Meyers (編輯)的"分子生物學(xué) 和生物工藝學(xué)綜合性實-驗參考"(國際標(biāo)準(zhǔn)書號l-56081-569-8 )。
為了幫助這里公開的各種各樣的實施方案的理解，本發(fā)明提 供了關(guān)于下列專用名詞的解釋
改變生產(chǎn)水平或表達(dá)水平無論是指增加還是減少，核酸序 列或氨基酸順序(例如多肽、siRNA、 miRNA、 mRNA、基因) 生產(chǎn)水平或表達(dá)水平的變化是與參照物的生產(chǎn)或者表達(dá)水平相 比砵交來確定的。
反義、正義和反基因DNA具有兩個逆平行鏈， 一個是5 ' —3'鏈，該鏈通常^皮叫做正鏈，另一個是3' —5'鏈，該鏈一皮認(rèn)為 是負(fù)鏈。由于RNA聚合酶以5 ' — 3 '的方向添力口核酸，因此負(fù)鏈的DNA在RNA轉(zhuǎn)錄期間作為模板。如此，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所具有的 序列與負(fù)《連序列互補(bǔ)，與正鏈序列一致(只有尿嘧啶(U)被胸 腺嘧咬(T )取代)。
反義分子是能夠與RNA或DNA正鏈特異性雜交或者互補(bǔ)的 分子。正義分子是能夠與DNA的負(fù)鏈特異性雜交或者互補(bǔ)的分 子。反基因分子是指向DNA靶點(diǎn)的反義分子或者正義分子。反義 RNA (asRNA)是一種RNA分子，該分子與正義(編碼的)核酸 分子互補(bǔ)。
擴(kuò)增當(dāng)被用于涉及核酸時，擴(kuò)增是指能夠增加樣品或者樣 本中核酸分子拷貝數(shù)目的方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是擴(kuò)增技術(shù)的一 個例子。在此反應(yīng)中，乂人主體中收集生物才羊品，在能夠允"i午樣品 中引物與核酸模板雜交的條件下使收集的生物樣品與 一 對低聚 核苦酸引物相接觸。在合適的條件下，引物延長，從模板上分開， 然后重新退火、延伸、和分離，乂人而擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)目。體外 擴(kuò)增的產(chǎn)物可以通過電泳、限制性核酸內(nèi)切酶裂解方式、低聚核 苷酸雜交或結(jié)4L、和/或4亥@臾測序，4吏用標(biāo)準(zhǔn)沖支術(shù)進(jìn)4亍定'1"生。體外 擴(kuò)增技術(shù)的其他例子包括鏈位移擴(kuò)增(參見美國專利第5,744,311 號)；無轉(zhuǎn)錄作用等溫擴(kuò)增(參見美國專利第6,033,881號)；修 補(bǔ)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(參見WO 90/01069 );連接酶連鎖反應(yīng)擴(kuò)增(參 見歐洲專利第EP-A-320 308號)；間隙填充連4妄酶連鎖反應(yīng)擴(kuò)增 (參見美國專利第5,427,930號)；偶耳關(guān)的連4妄酶4企測和聚合酶鏈: 反應(yīng)(參見美國專利第6,027，889號)；和NASBA RNA無轉(zhuǎn)錄擴(kuò) 增(參見美國專利第6,025，134號)。
抗體抗體是一種多肽配位體，包4舌至少一種輕鏈或者重鏈 免疫球蛋白可變區(qū)，所述可變區(qū)能夠特異性識別和結(jié)合一種抗原 決定簇(例如， 一種抗原，例如腫瘤或者病毒抗原，或者他的片 ,殳)。抗體包括完整的免疫J求蛋白及其本領(lǐng)域內(nèi)已知的變體和部分，例如Fab'片段、F (ab) '2片革殳、單鏈Fv蛋白("scFv")、和 二石克^4勿牙急定的Fv蛋白質(zhì)("dsFv")。單鏈Fv蛋白("scFv")是 一種融合蛋白，該融合蛋白中的免疫J求蛋白輕鏈可變區(qū)和免疫^求 蛋白重鏈可變區(qū)通過一種連4妄體結(jié)合，而在二碌"匕物穩(wěn)定的Fv蛋 白質(zhì)("dsFv")中，通過引入二硫鍵使鏈發(fā)生突變，從而穩(wěn)定鏈 的結(jié)合。本術(shù)語還包括抗體的基因工程形式，例如嵌合抗體(例 如，人源化鼠抗體)、雜共輒配對抗體(例如，雙特異性抗體)。 參見，Pierce Catalog and Handbook ( Pierce目錄和手冊), 1994-1995 (Pierc"匕學(xué)7/^司，Rockford, IL) ; Kuby， J.等人所 著的Immunology (免疫學(xué))，第三片反，W.H. Freeman & Co乂仝司， 紐約，1997。
一^殳的，免疫J求蛋白具有重鏈和輕鏈。每種重鏈和豐至鏈都包 含一種恒定區(qū)i或和一種可變區(qū)域(這里"區(qū)域"也可以叫啦爻"區(qū)")。 在結(jié)合時，重鏈和輕鏈可變區(qū)特異性的結(jié)合抗原。輕鏈和重鏈可 變區(qū)包括一種骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域，該骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域由三個高超變區(qū)所 中斷，所述高超變區(qū)也叫做"互補(bǔ)性-決定區(qū)域"或"CDRs"。骨架 結(jié)構(gòu)區(qū)域和CDRs的范圍已經(jīng)被定義了 (參見，Kabat等人的所著 的"具有免疫重要性的蛋白質(zhì)序列，，，美國健康和公共事業(yè)部， 1991，該文獻(xiàn)通過引i正在此全部并入本文)。Kabat凄t導(dǎo)居庫是在 線維持的。在同一個物種中，不同輕鏈或重鏈的骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域序 列是相對保守的。抗體的骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域是構(gòu)建輕鏈和重鏈的結(jié)合 的骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域，該骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠用來定位和校準(zhǔn)三維空間 上的CDRs。
所述CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的抗原決定蔟。每個鏈的CDR— 4殳被命名為CDR1、 CDR2、和CDR3， 乂人N末端開始順序編號， 也可以通過特定的CDR所在的鏈一4殳性的識別出來。因此，VH CDR3 ( CDR3的重鏈可變區(qū))位于發(fā)現(xiàn)它的抗體的重鏈可變區(qū)上，
31其中，VL CDR1 (CDR1的輕鏈可變區(qū))位于發(fā)現(xiàn)它的抗體的輕 鏈可變區(qū)上。
"VH"或者"VH"涉及免疫J求蛋白重鏈的可變區(qū)，其包括Fv、 單鏈Fv蛋白("scFv") 、 二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白質(zhì)("dsFv")或 Fab的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。"VL"或者"VL"涉及免疫5求蛋白輕 鏈的可變區(qū)，包括Fv、單鏈Fv蛋白("scFv") 、 二硫化物穩(wěn)定的 Fv蛋白質(zhì)("dsFv")或Fab的免疫J求蛋白輕鏈可變區(qū)。
"單克隆抗體"是通過B -淋巴細(xì)胞單個克隆或者是通過細(xì)月包 產(chǎn)生的抗體，在所述細(xì)月包中，單個抗體的輕《連和重《連基因已經(jīng)4皮 轉(zhuǎn)染了。單克隆抗體可以4艮據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)4亍制備，所 述方法例如使骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞相融合來制備雜交的抗 體形成的細(xì)力包。單克隆抗體包4舌人源化的單克隆抗體。
"人源化的免疫球蛋白"是指一種免疫球蛋白，這種免疫球蛋 白包括人免疫J求蛋白骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域和一種或一種以上非人源免 疫球蛋白(例如老鼠的免疫球蛋白、鼠的免疫球蛋白或合成的免 疫球蛋白)的CDR的。提供CDR的非人源免疫球蛋白被命名為"供 體，，，提供骨架結(jié)構(gòu)的人源免疫球蛋白纟皮命名為"受體"。在一 個實施方案中，所有的CDR都來源于人源化免疫球蛋白中的供體 免疫球蛋白，恒定區(qū)不是必須的，但如果存在的話，他們必須基 本上與人源免疫3求蛋白恒定區(qū)一致，那就是"i兌，至少有大約 85-90%的一至丈'1"生，例3口，至少大約95%或更多的一致'1"生。/人》匕， 人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了某些CDR，都與天然的 人源免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分基本上一致。人源化抗體是一種 抗體，這種抗體包4舌一種人源化的免疫5求蛋白輕鏈和一種人源^f匕
的免疫球蛋白重鏈。人源化抗體與作為供體抗體提供CDR的抗體 結(jié)合相同的抗原。人源化免疫J求蛋白或抗體的受體骨架結(jié)構(gòu)具有 有限個取代，所述取代由選自供體骨架結(jié)構(gòu)的氨基酸進(jìn)行。人源
32化單克隆抗體或其4也單克隆抗體還可以具有其4也的^f呆守氨基酸 取代作用，這些取代作用基本上不影響抗原結(jié)合或免疫^求蛋白的 其他功能。人源化的免疫球蛋白可以通過遺傳工程構(gòu)建(例如，
參見美國專利第5，585,089號)。
"中和抗體"是能夠干擾多肽，例如PD-1多肽任何一種生物學(xué) 活性的抗體。例如，中和抗體可以干擾PD-1多肽乂人而降低免疫反 應(yīng)，所述免疫反應(yīng)例如T細(xì)月包的細(xì)月包毒性。在幾個實施例中，中 和抗體可以減少PD-1多肽的能力,人而將免疫反應(yīng)降低大約50% 、 大約70%、大約90%或更多。可以使用任意標(biāo)準(zhǔn)試驗來測定免疫 應(yīng)答，包括這里所描述的實-驗，從而確定可能的中和抗體。
抗原是指一種能夠刺激動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體或者T細(xì)胞反應(yīng) 的化合物、組合物、或物質(zhì)，包4舌能夠注射入動物體內(nèi)或者^皮動 物體吸收的成分?？乖軌蚺c特定的體液產(chǎn)生的或者細(xì)力包免疫產(chǎn) 品發(fā)生反應(yīng)，所述產(chǎn)品包括由異源免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原。術(shù)i吾 "抗原"包括所有涉及到的抗原的抗原決定簇。"抗原決定簇 (Epitope )"或"^t原決定簇(antigenic determinant)，，涉及4元原上 的一種位點(diǎn)，在此位點(diǎn)上B細(xì)胞或者T細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)答。在一個實施 方案中，當(dāng)抗原決定簇與一種主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分 子相連接而存在時，T細(xì)胞對抗原決定簇作出反應(yīng)。抗原決定蔟 可以從鄰接的氨基酸或通過蛋白質(zhì)的三級折疊連接的非鄰接氨 基酸形成。由鄰接的氨基酸形成的抗原決定簇一^:在暴露于變性 溶劑之后能夠4皮保持，而由三級折疊形成的抗原決定簇在用變性 溶劑處理之后會失去治療作用。 一種抗原決定簇一般包4舌至少3 個氨基酸或者更多，至少5個氨基酸、大約9個氨基酸，或者大約 8-10個氨基酸，這些氨基酸以一種獨(dú)特的空間構(gòu)造存在。決定抗 原決定蔟空間構(gòu)造的方法包^"，例如，乂-射線晶體書于射法和2-維核磁共振。抗原可以是一種組織特異性抗原，或 一種疾病特異性抗原。
這些術(shù)"i吾并不是專有的，例如，組織特異性抗原還可以是一種疾 病特異性抗原。組織特異性抗原可以再有限凄t目的組織中可以表 達(dá)，例如，單個組織。具體的，組織特異性抗原的非限制性例子
是前列腺特異性抗原、子宮特異性抗原、和/或睪丸特異性抗原。 組織特異性抗原可以再一個以上組織中表達(dá)，例如，^f旦不^又限于， 一種抗原可以再超過一個生殖腺組織中表達(dá)，例如，在前列腺組 織和子宮組織中表達(dá)。疾病特異性抗原在疾病過程中偶然被表 達(dá)。疾病特異性抗原非才及限性的實施例是能夠與腫瘤形成相關(guān)的 抗原或者能夠預(yù)言肺瘤形成的抗原。疾病特異性抗原是可以通過 T細(xì)力包或B細(xì)力包識別的4元原。
抗原-呈遞細(xì)胞(APC):是指可以將結(jié)合有主要組織相容性 復(fù)合體(MHC) I類分子或II類分子的抗原呈遞到T細(xì)胞的細(xì)胞。 抗原-呈遞細(xì)胞(APC)包括，但是不局限于，單核細(xì)月包、巨噬細(xì) 胞、樹狀細(xì)胞、非胸&i依賴性細(xì)胞(B細(xì)胞)、T細(xì)胞和郎格罕氏 細(xì)胞。 一種T細(xì)胞可以將抗原呈遞到其他的T細(xì)胞(包4舌CD4+和/ 或CD8十T細(xì)月包)上，這種T細(xì)月包就是一種抗原呈遞T細(xì)月包 (T畫APC)。
結(jié)合或穩(wěn)定的結(jié)合(低聚核苷酸)如果足夠量的低聚核苷 酸形成;威基對或者與其耙分子核酸雜交，該j氐聚核苷酸就會結(jié)合 或者穩(wěn)定的結(jié)合到靶分子核酸上，從而允許才企測結(jié)合?？梢酝ㄟ^ 靶分子:低聚核苷酸復(fù)合物的物理或者功能性質(zhì)檢測結(jié)合。在靶分 子和^f氐聚核苦酸之間的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的4壬何方法 來才全測，這些方法包4舌功能性結(jié)合實-驗和物理結(jié)合實馬全。例如， 可以通過確定結(jié)合在生物合成過程中是否具有可探測到的效果 來乂人功能角度才企測結(jié)合，所述生物合成過程例如基因表達(dá)、DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等等。檢測DNA或RNA的互補(bǔ)鏈結(jié)合的物理方法在本領(lǐng)i或內(nèi)是已 知的，包4舌，例如脫氧核津唐核酸酶I (DNase I)或化學(xué)足跡實-驗 法、凝月交4立移和親合裂解試-驗、RNA分子印跡4支術(shù)(Northern blotting)、點(diǎn)印跡才支術(shù)和光吸收才企測方法。例如， 一個方法包4舌 在220納米到300納米條件下，在溫度緩慢增加時觀察包含低聚核 普酸(或其類似物)和革巴分子核酸的溶液光p及收的變化，由于該 方法簡單可靠，在本領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。如果低聚核苦酸或類似 物已經(jīng)與它的草巴分子結(jié)合了 ，在某一特定的溫度下，該:容液的p及 光度會有一個突增，這是由于低聚核苷酸(或類似物)與他的靶 分子分離或熔融而造成的。低聚物及其耙分子核酸之間的結(jié)合通 常通過溫度(Tm)來定性，在此溫度(Tm)下，50%的低聚物 /人其耙分子上熔化。4支高的(Tm)相對于較〗氐的(Tm)來講， 意p未著更強(qiáng)或者更穩(wěn)定的復(fù)合物。
癌癥或腫瘤是指一種惡性的贅生物，該贅生物已經(jīng)經(jīng)歷了 特有的退行性變化同時伴有分化能力損失、發(fā)育增長率損失、侵 入周圍組織、并能夠4爭移。生殖性癌癥是指其最初起源在生殖組 織中的癌癥，所述生殖組織例如子宮、睪丸、卵巢、前列腺、輸 卵管或陰莖。例如，前列&泉癌是一種惡性贅生物，發(fā)生在前列腺 組織并從前列腺組織中擴(kuò)散，并且，子宮癌是發(fā)生在子宮組織中 或者從子宮組織中擴(kuò)散開來的惡性贅生物，睪丸癌是發(fā)生在睪丸 中的惡性贅生物。切緣癌是指在對患有癌癥的患者進(jìn)行任何能夠 減少或消除甲狀腺癌的治療之后仍然殘留在患者體內(nèi)的癌癥。轉(zhuǎn) 移癌是指除了原始(最初)癌癥起源位點(diǎn)之外，/人該轉(zhuǎn)移性癌起 源位點(diǎn)轉(zhuǎn)移出的在患者體內(nèi)一個或者一個以上<立點(diǎn)的癌癥。
4匕學(xué)療法；4匕學(xué)治療劑如這里4吏用的，z化學(xué)療法或^:學(xué)治 療劑是指任何能夠有效治療以非正常細(xì)胞生長為特征的疾病的 化學(xué)試劑。這些疾病包括腫瘤、贅生物和癌癥，以及以增生性生長為特征的疾病，例如，牛皮癬。在一個實施方案中，化學(xué)治療 劑是在治療贅生物的過程中使用的試劑，所述被治療的贅生物例 如實體肺瘤。在一個實施方案中，化學(xué)治療劑是一種方文射性分子。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易的識別有效的化學(xué)治療劑(例
如，參見Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, ( Slapak 和Kufe所著的"癌癥治療原5里")Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine (內(nèi)科醫(yī)學(xué)的哈里森原理第86章)第14片反； Perry etal.， Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed.， 2000 Churchill Livingstone, Inc (丘吉爾利文斯頓有 限公司2000年出版的Perry等人編寫的"化學(xué)療法"第2版第17章， 阿貝洛夫臨床月中瘤學(xué))；Baltzer L， Berkery R ( eds ) : Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995 ( Mosby年鑒1995年，圣3各易其斤出X反的Baltzer L、 Berkery R編輯的"腫瘤學(xué)化學(xué)療法口袋指南"第2片反)；Fischer DS, Knobf MF , Durivage HJ ( eds ) : The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St, Louis, Mosby-Year Book, 1993 ) ( Mosby 年鑒1993年，圣路易斯出版的Fischer DS、 Knobf MF、 Durivage HJ 編輯的"癌癥化學(xué)療法手冊"第4版))。這里所7>開的免疫原多 肽可以用于與其4也的化學(xué)治療劑相結(jié)合4吏用。
參照水平是指一種分子的水平，例如多肽或者核酸的水平， 該水平是在某一情況下和/或在一種特異性遺傳背景下天然存在 的水平。在某些實施方案中，分子的參照水平可以在沒有經(jīng)過直 才妄或者間^接治療的細(xì)月包或才羊品中^皮測定。在某些實施方案中，參 照水平可以使細(xì)月包中沒有與試劑，例如PD-1拮抗劑接觸的水平。 在其他的實施例中，參照水平是指沒有^皮給藥PD-1拮抗劑的水 平。
36DNA (脫氧核糖核酸)脫氧核糖核酸(DNA)是一種長鏈 聚合物，該聚合物包括絕大多數(shù)活體生物的遺傳物質(zhì)(一些病毒 的基因包括在核糖核酸(RNA)中)。DNA聚合物中的重復(fù)單位 是四個不同的核苦酸，每個都包括四個石咸基之一，所述石咸基包括
A泉嘌呤、鳥嘌t令、力包嘧，定和胸^^嘧t定，這些;咸基與脫氧核4唐結(jié)合， 在此脫氧核并唐上附著有石粦酸基。三個一組的核苷酸(^皮稱為"密 碼子，，)能夠編碼多肽中的每個氨基酸，或者停止信號。術(shù)語"密 碼子"也可以,皮用來指mRNA中的三個核苷酸的相應(yīng)(互4卜)序列， 所述mRNA是由該DNA序列轉(zhuǎn)錄得到的。
除非另有規(guī)定，所有DNA分子表示的分子都包括該DNA分子 的反向互補(bǔ)序列。除非上下文中明確要求是單鏈分子，DNA分子 盡管只用單鏈表示，但是其意味著包含雙鏈DNA分子的兩條鏈。
編碼多核苷酸^皮i人為能夠編碼一種多肽，如果在其天然狀 態(tài)或者使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行處理之后，該多肽可以進(jìn)行轉(zhuǎn) 錄和/或翻譯，乂人而產(chǎn)生mRNA和/或多肽或其片,殳。反義《連是指 這種核酸的互補(bǔ)序列，其編碼的序列可以由此推斷。
表達(dá)是指一種過程，在此過程中，基因編碼的信息被轉(zhuǎn)入 構(gòu)建物結(jié)構(gòu)中，此過程存在于細(xì)胞中并在細(xì)月包中進(jìn)行才乘作。表達(dá) 的基因包括那些被轉(zhuǎn)錄為mRNA并隨后被翻譯成蛋白質(zhì)的基因， 還包括那些纟皮轉(zhuǎn)錄為RNA但不被翻i,為蛋白質(zhì)(例如siRNA、轉(zhuǎn) 移核糖核酸和核糖體RNA)的基因。因此，耙分子序列，例如基 因或基因啟動區(qū)的表達(dá)可以導(dǎo)致mRNA、蛋白質(zhì)或者二者的表 達(dá)，耙分子序列的表達(dá)可以被抑制或提高(減少或增加)。
表達(dá)控制序列是指一種核酸序列，能夠調(diào)節(jié)與其可操作的 連接的異源核酸序列的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)節(jié) 一 種核 酸序列的轉(zhuǎn)錄以及在合適的情況下控制和調(diào)節(jié)其翻譯過程時，表
37達(dá)控制序列可操作的與該核酸序列相連。因此，表達(dá)控制序列可 以包括適當(dāng)?shù)膯幼印⒃鰪?qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、位于蛋白質(zhì)編碼基
因前面的起始密碼子(即，ATG)、拼接信號、保持正確閱讀基 因框架從而保證mRNA被適當(dāng)?shù)姆g的元件、和終止密碼子。術(shù) 語"控制序列，，至少包括，其存在能夠影響表達(dá)的組分，還可以包 括其他組分，這些其他組分的存在是有利的，例如，前導(dǎo)序列和 融合配對序列。表達(dá)控制序列可以包4舌一種啟動子。
啟動子是足夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的最小序列。同時還包括一些啟 動子元素，這些啟動子元素足夠4吏依賴于啟動子的基因表達(dá)過程 的細(xì)胞型特異性、組織特異性變得可以通過外部信號或者試劑控 制或者歸納；這些元素可以位于基因的5'或3'區(qū)域。可構(gòu)建的和 可歸納的啟動子諸(^皮包4舌在本發(fā)明范圍內(nèi)(參見例如，Bitter et al.， Methods in Enzymology 153:516-544， 1987 ( Bitter等人在1987 年出版的"酶工程方法"第153期516-544頁公開的文獻(xiàn)))。例如， 當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)克隆時，可歸納的啟動子，例如細(xì)菌p藍(lán)菌體 lambda6勺pL、 plac、 ptrp、 ptac ( ptrp-lac雜交啟動子)等等，者卩可 以祐 使用。在一個實施方案中，當(dāng)在哺乳動物細(xì)月包系統(tǒng)中克隆時， 可以 <吏用來源于哺乳動物細(xì)月包基因組的啟動子(例如金屬碌b蛋白 啟動子)或來源于哺乳動物病毒基因纟且的啟動子(例如反向病毒 長末端重復(fù)序列；^i病毒深啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。通 過重組DNA或合成4支術(shù)產(chǎn)生的啟動子可以-皮用來提供核酸序列 的轉(zhuǎn)錄作用。
異源的是指來源于分離遺傳來源或種族的物質(zhì)。通常，特 異性結(jié)合所關(guān)心的蛋白質(zhì)的抗體不會特異性的結(jié)合異源蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)l包是指在其中載體可以進(jìn)4亍繁殖并表達(dá)其DNA的細(xì) 月包。該細(xì)力包可以是原核的或者是真核的。該細(xì)力包可以是哺乳動物 的，例如人類的。該術(shù)語還包括任意宿主細(xì)胞的子代。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于在復(fù)制期間會發(fā)生突變，所有的后代可能 不會與其母代細(xì)胞完全一致。然而，當(dāng)使用"宿主細(xì)胞"時也包括
其后^細(xì)胞。
免疫反應(yīng)是指細(xì)l包免疫系統(tǒng)對刺激物的一種反應(yīng)，所述免 疫系統(tǒng)例如B細(xì)月包、T細(xì)月包或者單核細(xì)J包。在一個實施方案中，所 述反應(yīng)對一種特定的抗原具有特異性("抗原特異性反應(yīng)")。在 一個實施方案中，免疫反應(yīng)是一種T細(xì)月包反應(yīng)，例如CD4+反應(yīng)或 CD8+反應(yīng)。在另一個實施方案中，所述反應(yīng)是B細(xì)胞反應(yīng)，并導(dǎo) 致特異性抗體的產(chǎn)生。
免疫細(xì)胞的"無反應(yīng)作用"包括免疫細(xì)胞對刺激作用的折射系 凄史，所述刺激作用例如通過活化受體或細(xì)力包因子的刺激作用。"無 反應(yīng)作用"可以由于暴露于免疫抑制劑或者暴露于高劑量的抗抗 原而發(fā)生。如這里使用的，術(shù)語"無反應(yīng)性"或者"耐受性"包括對 活化受體調(diào)節(jié)的刺激作用的折射系數(shù)。這種折射系數(shù)通常具有抗 原特異性，并在停止暴露于耐受化抗原之后還能維持這樣的折射 系數(shù)。例如，在T細(xì)胞中的無反應(yīng)性(與無反應(yīng)作用相反)的特 點(diǎn)在于缺少細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如IL-2)。當(dāng)T細(xì)胞暴露于抗原 中并受到第一信號( 一種T細(xì)胞受體或CD-3調(diào)節(jié)的信號)且在沒 有產(chǎn)生第二信號(一種共刺激信號)時，T細(xì)胞發(fā)生無反應(yīng)性。 在這種情況下，將所述細(xì)胞再暴露于同一個抗原(即使暴露發(fā)生 在共刺激分子存在的情況下)會導(dǎo)致不能產(chǎn)生細(xì)胞因子，并因此， 不能增值。然而，如果與細(xì)胞因子(例如，IL-2)—起培養(yǎng)的話， 無反應(yīng)性的T細(xì)胞可以與無關(guān)的抗原起反應(yīng)并因此可以增值。例 如，T細(xì)胞無反應(yīng)性還可以通過由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2缺失來觀 察，該過程通過酶耳關(guān)免疫吸附測定或通過含有指示劑的細(xì)胞4朱進(jìn) 行的增殖試驗來調(diào)節(jié)。做為選擇，還可以使用一種報道基因構(gòu)建 物。例如，無反應(yīng)性的T細(xì)月包不能啟動IL-2基因的轉(zhuǎn)錄作用，所述轉(zhuǎn)錄作用是在5 ' IL-2基因增強(qiáng)因子的控制下通過異源啟動子 誘導(dǎo)的IL-2基因的轉(zhuǎn)錄作用，或者是通過AP1序列的多聚體誘導(dǎo) 的IL-2基因轉(zhuǎn)錄作用，所述AP1序列多聚體可以再增強(qiáng)因子內(nèi)部 被發(fā)現(xiàn)(Kangetal. Science 257:1134, 1992)。無反應(yīng)性的抗原 特異性T細(xì)胞相對于其相應(yīng)的參照抗原特異性T細(xì)胞在細(xì)胞毒素 活寸生上減少了至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、乃至100%。
免疫原性肽是指一種肽，所述肽包括等位基因-特異性基序 或其他序列，從而所述肽能夠結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體(MHC ) 分子并且導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞("CTL")反應(yīng)或針對衍生出免疫 原性肽的抗原的B細(xì)胞反應(yīng)(例如，產(chǎn)生抗體)。
在一個實施方案中，使用序列基序或者其他方法來識別免疫 原性肽，所述方法例如本領(lǐng)域內(nèi)已知的神經(jīng)網(wǎng)全各或多項式判斷 法。 一般，使用運(yùn)算法則來確定肽的結(jié)合閾從而通過分?jǐn)?shù)來進(jìn)行 選擇，所述分?jǐn)?shù)能夠賦予他們高的結(jié)合可能性，同時具有某一結(jié) 合親合力并具有免疫原性。所述運(yùn)算法則或者基于特定氨基酸在 特定位置的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合的作用，或者基 于特定的氨基酸在特定的位置對抗體結(jié)合的作用，或者基于包含 基序的肽中特定取^作用的結(jié)合的作用。在免疫原性肽的含義 中，保存殘基是指肽中的某一特定位點(diǎn)上，以比通過隨才幾分布所 預(yù)計的情況具有顯著增高的頻率出現(xiàn)的殘基。在一個實施方案 中，保守殘基是一種殘基，在此殘基上主要組織相容性復(fù)合體
(MHC)結(jié)構(gòu)能夠與免疫原性肽提供一種接觸點(diǎn)。免疫原性肽還 可以通過測定其與特異性主要組織相容性復(fù)合體(MHC )蛋白質(zhì)
(例如，HLA-A02.01 )的結(jié)合來識別，或者在存在于主要組織 相容性復(fù)合體(MHC)蛋白質(zhì)中時，通過他們刺激CD4和/或CD8 的能力來識別。
40免疫原性組合物是指一種組合物，包括一種免疫原性的多 肽或編碼免疫原性多肽的核酸，所述免疫原性的多肽能夠?qū)е聦?抗細(xì)胞表達(dá)多肽可測量的細(xì)胞毒性T細(xì)胞("CTL")反應(yīng)，或者 能夠?qū)е聦顾龆嚯牡目蓽y量的B細(xì)胞反應(yīng)(例如，產(chǎn)生能夠 特異性結(jié)合所述多肽的抗體)。為了進(jìn)行體外應(yīng)用，免疫原性組 合物可以由隔離的核酸、包括核酸/或免疫原性肽的i某介物組成。 為了進(jìn)4亍體內(nèi)應(yīng)用，所述免疫原性組合物通常包4舌核酸、包括核 酸的媒介物、和/或在藥學(xué)上可接受的載體中的免疫原性多肽，和 /或其他的試劑。免疫原性組合物可以選4f性地包括一種添加劑、 一種PD-1拮抗劑、 一種共刺激分子、或一種編碼共刺激分子的核 酸。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的實驗，可以方便的檢測多肽或編碼該多 肽的核酸導(dǎo)致細(xì)I包毒性T細(xì)力包("CTL")反應(yīng)的能力。
抑制或治療一種疾病抑制一種疾病，例如抑制腫瘤生長或 抑制持續(xù)感染是指承卩制一種疾病的全面發(fā)展，或者減輕該疾病過 程的生理學(xué)影響。在幾個實施例中，抑制或治療一種疾病是指減 輕腫瘤或帶有病原體的傳染病的癥爿犬。例如，癌癥治療可以防止 已知患有癌癥的病人體內(nèi)腫瘤伴隨綜合征的發(fā)展，或者能夠減輕 腫瘤的癥狀或者病4正。在另一個實施方案中，傳染病的治療涉及 抑制傳染病的發(fā)展或者減輕所述傳染病的癥狀。"治療"是指 一種 治療性介入，該治療性介入能夠改善一種疾病或與此疾病有關(guān)的 病理學(xué)情況的癥4犬或病4正。治療性的4妄種法涉及^j"已經(jīng)感染上一 種病原體的主體給藥試劑。所述主體可以是無任何癥狀的，從而 所述治療可以防止所述癥狀的發(fā)生。治療性疫苗還可以減少 一種 或者一種以上存在的癥狀的嚴(yán)重性，或者減少病原體的感染量。
傳染性疾病是指任意由傳染性試劑。傳染性病原體的例子 包括，^旦不^又限于病毒、細(xì)菌、支原體和真菌。在一種特定的 實施例中，傳染性疾病是一種由至少一種傳染性病原體造成的疾
41病。在另一個實施例中，傳染性疾病是一種至少由兩種不同類型 的傳染性病原體造成的疾病。4專染性疾病可以4乍用于4壬〗可體系， 可以是急性的(短期發(fā)作)或者慢性/持續(xù)性(長期發(fā)作)的，發(fā) 作同時會引起或者不會引起發(fā)燒。傳染性疾病可以感染任意年齡 階4史并且可以才目互感染。
病毒引起的疾病通常在發(fā)生由已經(jīng)存在于受體中的病毒重 新活化產(chǎn)生的免疫抑制之后。持久性病毒感染具體的例子包括<旦
不局限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)肺炎、腸炎和^L網(wǎng)膜炎；埃-巴 二氏病毒(EBV)淋巴組織增生性疾??；水痘/皰滲(由水痘帶狀 皰滲病毒引起)；HSV-l和HSV-2粘膜炎；HSV-6腦炎、BK-病毒 出血性膀胱炎；病毒流行性感冒；呼吸道合胞病毒(RSV)引發(fā) 的肺炎；艾滋病(由艾滋病病毒引發(fā)的)；和曱型肝炎、乙型肝 炎或者丙型肝炎。
其^f也的傳染性病毒包4舌逆轉(zhuǎn)錄病毒；小核^泉核酸病毒(例 如，骨ft灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒，人考克塞基病 毒、鼻病毒、?？刹《?；Calciviridae (例如，引起腸胃炎的菌 林)；披蓋病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦脊髓炎病毒、風(fēng) 滲病毒)；黃病毒牙牛(Flaviridae)(例如，登革熱病毒、腦炎病 毒、黃熱病病毒)；冠^1犬病毒牙牛(Coronaviridae)(侈寸3口，冠^1犬 病毒)；彈狀病毒 一牛(Rhabdoviridae )(例如，水泡性口力莫炎病 毒、狂犬病病毒)；纖維病毒牙牛(Filoviridae)(例:^， ebola病 毒)；副沖占病毒矛牛(例3口，副^危感病毒、；危4亍'I"生月思&泉炎病毒、麻 滲病毒、呼吸道合月包病毒)；流;f亍性感冒病毒正勦液病毒^牛
(Orthomyxoviridae )(侈'j^口，；危4亍寸生感冒病毒)；布尼亞病毒 科(Bungaviridae)(例如，Hantaan病毒、bunga病毒、白蟲令病毒
(Phleboviruses )和Nairo病毒)；Arena病毒(出血熱病毒)； 呼腸 瓜病毒科(例如，呼吸道腸道病毒、環(huán)狀病毒(Orbiviruses )和專侖狀病毒)；雙RNA病毒牙牛(Birnaviridae );嗜肝DNA病毒牙牛 (hepadnaviridae )(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科(parvoviridae ) (纟田小病毒)；乳多空病毒-牛(Papovaviridae )(乳頭習(xí)犬瘤病毒、 多形瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(絕大多數(shù)是腺病毒)； 皰滲病毒禾牛(Herpesviridae )(單純皰滲病毒(HSV ) l和單純皰 滲病毒(HSV) -2、水痘帶狀皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、 皰療病毒)；痘病毒科(Poxviridae )(天花病毒、牛痘病毒、 痘病毒)；和蟲工彩病毒禾牛(Iridoviridae )(例如非洲豬瘟病毒)； 和未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的病原體，delta肝炎的試劑 (被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷型附屬物)、非曱型感染的試劑、 非乙型肝炎的試劑(1類=內(nèi)部傳輸；2類=不經(jīng)腸道傳輸(即，丙 型肝炎)；i若沃克類病毒和與之有關(guān)的病毒、和星形病毒 (astrovimses ))。
真菌傳染病的例子包括]旦是不局限于曲霉??；口腔白色念 珠菌病(由白色念珠菌所引起)；隱球菌病(由隱球酵母屬所引 起)；和莢膜組織胞漿菌病。因此，傳染性真菌的例子包括，但 是不局限于，新型隱^求菌、莢膜組織胞漿菌、厭酷球孢子菌、皮 炎芽生菌、沙眼衣原體、白色念珠菌。傳染性細(xì)菌的例子包括 幽門螺旋桿菌、伯氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、通用型嗜 月,軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、分支^干菌屬(侈寸^口，月申纟吉 核分枝桿菌、小鼠抗鳥結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、M. kansaii、 M. gordonae)、金黃色葡萄J求菌、、淋病奈瑟氏J求菌、月畝月莫炎奈瑟 氏球菌、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌、釀膿鏈球菌(A組鏈球菌)、 無乳鏈球菌(B組鏈球菌)、鏈球菌(易變組)、糞鏈球菌、牛 鏈球菌、鏈球菌(厭氧菌屬)、肺炎鏈球菌、致病性彎曲桿菌屬、 腸道球菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽胞桿菌、白喉棒狀桿菌、棒狀 桿菌屬、紅斑丹毒絲菌、腸^f炎狀芽孢桿菌、 >坡傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣腸 才干菌、月申炎克雷白4干菌、多殺巴其斤德、氏菌(Pasturella multocida )、
43崎開j菌體、具才亥沖炎才干菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠習(xí)犬鏈 桿菌、蒼白密螺^走體、細(xì)弱密螺^走體、鉤端螺^走體屬、和衣氏(以 色列)放線菌(A. israelii)。其他的傳染性有機(jī)體(例如真核原 生生物)包4舌惡性瘧原蟲和弓形蟲抗體。
"持續(xù)感染"是指一種傳染病，在此傳染病中傳染試劑(例如 一種病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲、或真菌)是不確定的或者沒 有從受感染的宿主中排除，即使后來引發(fā)了免疫反應(yīng)。持續(xù)感染 可以是慢性感染、潛伏性感染或慢感染。潛伏性感染的特點(diǎn)在于 在復(fù)發(fā)性疾病的亞階之間缺乏可i正明的傳染性病毒。f曼性感染的 特點(diǎn)在于初次感染之后傳染性病毒的持續(xù)性存在，并且慢性感染 還可以包括慢性的或者復(fù)發(fā)性疾病。慢感染的特點(diǎn)在于進(jìn)行性疾 病之后延長的潛伏期。與潛伏性感染和慢性感染不同，慢感染可 能不會以急性的病毒復(fù)制階段作為開始。與急性傳染相對短暫 (持久幾天到幾星期)并能夠通過免疫系統(tǒng)乂人身體中分解不同， 持續(xù)感染可以持續(xù)，例如，幾個月、幾年、乃至一生。這些傳染 病還可以在4艮長的一段時間內(nèi)經(jīng)常復(fù)發(fā)乃至對宿主細(xì)胞產(chǎn)生過 度破壞，所述4艮長的時間包括潛伏階段和有效感染階段，但不會 殺死細(xì)胞。持續(xù)感染經(jīng)常包括潛伏期和有效感染兩個階^殳，4旦不 會快速的殺死宿主細(xì)胞或者對宿主細(xì)胞產(chǎn)生過度損害。在持續(xù)病 毒感染期間，病毒基因組既可以穩(wěn)定的統(tǒng)一到細(xì)胞DNA中或者附 加性的^皮維持。某些病毒會產(chǎn)生持續(xù)感染，所述病毒例如人T 細(xì)月包白血病毒、》矣-巴二氏病毒、巨細(xì)月包病毒、皰滲病毒、7jC痘國 帶習(xí)犬皰滲病毒、家畜嚢蟲病、乳多空病毒、朊病毒、肝炎病毒、 腺病毒、細(xì)小病毒和乳頭狀瘤病毒。
4吏用標(biāo)準(zhǔn)才支術(shù)在宿主體內(nèi)(例如受感染個體的大肺泡上皮細(xì) 胞內(nèi)部)可以發(fā)現(xiàn)引起感染的傳染性試劑，即使已經(jīng)進(jìn)行了免疫 反應(yīng)之后。接照任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以i貪斷哺乳動物患有持續(xù)感染，所述方法在例3口，美國專利第6,368,832號、美國 專利第6,579,854號和美國專利第6,808,710號和美國專利申請7> 開號20040137577、美國專矛J中5青/>開號20030232323、美國專矛J 申請公開號20030166531、美國專利申請公開號20030064380、美 國專矛J中^青/>開號20030044768 、 美國專矛J中"i青乂>開號 20030039653、美國專矛J中^青乂>開號20020164600、美國專矛J中^青
發(fā)明者A·沙佩, G·弗里曼, R·阿梅德, R·阿瑪拉 申請人:埃默里大學(xué);達(dá)納-法伯癌癥研究院有限公司;哈佛學(xué)院董事會