專利名稱：一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”dna疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗，還涉及該疫苗在防制豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，簡(jiǎn)稱PRRS，下文簡(jiǎn)稱PRRS)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的病毒性傳染病，以母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱仔等繁殖障礙及各種年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病和高死亡率為特征。該病最早于1987年報(bào)道于美國(guó)南部，不久即傳播到了中西部，并在全美迅速蔓延。隨后加拿大、德國(guó)、荷蘭等一些國(guó)家也先后暴發(fā)了該病(Bilodeau R等，Porcine reproductive and respiratory syndrome in Quebec.Vet Rec，1991，129102-103；Dea S，Bilodeau R，Athanassious R et al.Swine reproductive and respiratory syndrome virus in Quebecisolation of an enveloped virus serologically-related to lelystad virus.Can Vet J.1992，33801-808)；亞洲地區(qū)報(bào)道此病的時(shí)間相對(duì)較晚，中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)1991年出現(xiàn)此病(張志成等，臺(tái)灣地區(qū)豬繁殖與呼吸道征候群I病毒鑒定，中華獸醫(yī)雜志，1993，19(4)268-276)；日本1994年暴發(fā)PRRS(Hiroyoshi Kuwaahara.An outbreak of PRRS in Japan.J Vet Med Sci，1994，56(50)901-909)；中國(guó)大陸1996年報(bào)道此病開(kāi)始流行，并分離到病毒(郭寶清等，從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離豬生殖與呼吸綜合征病毒的研究，中國(guó)畜禽傳染病，1996，87(2)1-5)。上述文獻(xiàn)顯示豬繁殖與呼吸綜合征給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅1991年歐洲PRRS的暴發(fā)就造成了100萬(wàn)頭豬的死亡。
同其它許多豬的病毒病的防制一樣，PRRS的防制也主要是免疫預(yù)防。目前用于預(yù)防PRRS的主要是弱毒苗和滅活苗。盡管弱毒疫苗能提供較好的免疫保護(hù)，但存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，并且返強(qiáng)的機(jī)率相當(dāng)高，這一點(diǎn)也在幾年前丹麥等國(guó)因廣泛使用弱毒苗而導(dǎo)致該病大暴發(fā)中得以證實(shí)。與弱毒苗相比，滅活疫苗雖然安全，但往往需要反復(fù)多次的免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗?？梢哉f(shuō)，目前對(duì)該病的防制一直不盡人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗來(lái)預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行。
“自殺性”DNA疫苗(Suicidal DNA vaccine)是近幾年提出的一種新的疫苗設(shè)計(jì)，是在常規(guī)DNA疫苗和“自主復(fù)制型”RNA疫苗(Self-replicating RNAvaccine)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，不僅具有“自主復(fù)制型”RNA疫苗的安全性與有效性，而且結(jié)合了常規(guī)DNA疫苗易制備、運(yùn)輸、保存等方面的優(yōu)點(diǎn)，堪稱近年來(lái)基因疫苗發(fā)展的重大突破。目前，這種新型疫苗的研究尚處于研究早期，但已有報(bào)道用這種方法構(gòu)建的流感病毒、人單純皰疹病毒的“自殺性”DNA疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠后可誘導(dǎo)高于常規(guī)DNA疫苗的體液免疫與細(xì)胞免疫，并且較常規(guī)DNA疫苗的免疫劑量低100~1000倍，展示了“自殺性”DNA疫苗巨大的開(kāi)發(fā)潛力與良好的應(yīng)用前景。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV，下文簡(jiǎn)稱PRRSV)ORF5基因編碼的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，而且目前確定的最主要的中和表位也位于其N(xiāo)端胞外區(qū)，因此是設(shè)計(jì)PRRS新型疫苗的首選目標(biāo)基因(Dea S，Gagnon CA，Mardassi H.Current knowledge on the structural proteins of porcinereproductive and respiratory syndrome(PRRS)viruscompari son of the North American andEuropean isolates.Arch Virol，2000a，145659-688)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是得到一種能夠防制豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA，該載體不僅適合制備豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗的應(yīng)用，而且有可能應(yīng)用于其他類(lèi)似疫苗上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗在防制豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗，是將豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因ORF5插入“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建而成，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌Escherichiacoli DH5 α/pSCA-ORF5，保藏在CCTCC，保藏號(hào)為M203073。
所述的“自殺性”DNA疫苗的表達(dá)載體pSCA，其特征是在西門(mén)利克森林病毒復(fù)制子質(zhì)粒型表達(dá)載體pSFV1的非結(jié)構(gòu)蛋白基因上游引入人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子序列，在其多克隆位點(diǎn)下游引入SV40poly(A)序列。
本發(fā)明還包括上述一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗在防制豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下列技術(shù)步驟所述一、pSFV1載體的改造1、引物的設(shè)計(jì)根據(jù)pCI-neo(Promega)的全序列(見(jiàn)Promega公司pCI-neo《真核表達(dá)載體操作手冊(cè)》)合成能擴(kuò)增SV40晚期poly(A)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列的引物P1和P2，上下游引物分別設(shè)計(jì)SpeI和XbaI位點(diǎn)，擴(kuò)增大小為250bp；同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增HCMV IE Enhancer/Promoter元件的引物P3和P4，上下游引物兩端均設(shè)計(jì)SphI位點(diǎn)，擴(kuò)增大小為823bp。引物序列為P15’-CAAACTAGTCAAACATGATAAGATAC-3’；P25’-GGCTCTAGATACCACATTTGTAGAGGT-3’P35’-ACATGCATGCTCAATATTGGCCATTAGC-3’P45’-ACATGCATGCCTGACTGCGTTAGCAATT-3’2、PCR擴(kuò)增以pCI-neo為模板，P1、P2為引物擴(kuò)增SV40 poly(A)序列。擴(kuò)增條件為95℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后于1.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。
以P3、P4為引物，pCI-neo為模板擴(kuò)增HCMV IE Enhancer/Promoter片段。擴(kuò)增條件為95℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后于1.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。
3、pSFV1載體的改造將擴(kuò)增的SV40 poly(A)片段純化后用SpeI和XbaI酶切，回收目的片段，插入經(jīng)SpeI酶切并去磷酸化的載體pSFV1中，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定，命名為pSFVA。然后將HCMV IE Enhancer/Promoter片段的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用SphI酶切，插入pSFVA的SphI位點(diǎn)，重組質(zhì)粒也經(jīng)酶切和PCR鑒定，命名為pSCA，該載體是用于豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建上，依照本發(fā)明的思路，申請(qǐng)人認(rèn)為該載體有可能應(yīng)用于類(lèi)似的疫苗的構(gòu)建上。
二、PRRSV ORF5基因“自殺性”DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對(duì)可擴(kuò)增ORF5完整編碼區(qū)的引物P52S和P52R(同P51R)，上下游引物兩端分別設(shè)計(jì)了BamHI和XbaI位點(diǎn)。引物序列如下P52S 5’-GAAGGATCCTCAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’P52R 5’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’以pMD-ORF5為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增大小為607bp。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min；進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。純化回收目的片段，克隆到載體pMD18-T中，選擇兩端均含BamHI位點(diǎn)的質(zhì)粒，命名為pMD-ORF5-1，測(cè)序分析，證實(shí)無(wú)堿基誤配。
BamHI酶切質(zhì)粒pMD-ORF5-1，回收目的片段，插入pSCA的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pSCA-ORF5。
三、質(zhì)粒pSCA-ORF5的大量制備(1)挑取含有質(zhì)粒pSCA-ORF5的菌落接種于75mL LB培養(yǎng)液，37℃ 300r/min培養(yǎng)過(guò)夜，6000r/min5min，收集細(xì)胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，高壓滅菌后置4℃保存?zhèn)溆?懸浮(吹散或渦旋)。
(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)，冰浴7-10min。
(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸鉀，冰醋酸調(diào)pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃ 10000r/min10-15min。
(4)取上清，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，-20℃ 30min或室溫5min。室溫，10000r/min 6-15min。
(5)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA)懸浮(洗壁20min左右)。
(6)加1.5ml即1倍體積冰預(yù)冷的5mol/L NH4Ac，混勻。4℃ 10000r/min 10min。
(7)將上清轉(zhuǎn)移至7mL的離心管，加1倍體積(3mL)的異丙醇混勻，-20℃作用30min。12000r/m 15min。
(8)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE懸浮(洗壁20 min左右)，并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管。
(9)加入適量的RNase，37℃ 1h，去RNA。
(10)加1倍體積的13％的PEG8000(含1.6mol/L NaCl)，混勻，-20℃ 30min(可以過(guò)夜)。離心，棄上清，用400μL TE重溶。
(11)加等體積酚∶仿∶異戊醇抽提2次，氯仿∶異戊醇抽提1次。
(12)加100μl 10mol/L NH4Ac，充分混勻后，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃12000r/min離心5-10min。
(13)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50μL TE或H2O重溶，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 四、用于對(duì)比試驗(yàn)的常規(guī)DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-ORF5的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對(duì)可擴(kuò)增ORF5完整編碼區(qū)的引物P51S和P51R，上下游引物兩端分別設(shè)計(jì)了XhoI和XbaI位點(diǎn)。引物序列如下P51S 5’-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’P51R 5’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’以pMD-ORF5為模板(方六榮等，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒YA株ORF5基因的克隆與序列分析，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(6)501-505)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增大小為619bp。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min；進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。純化回收目的片段，純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表達(dá)載體pCI-neo(Promega)的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得的重組質(zhì)粒pCI-ORF5經(jīng)XhoI、XbaI和XhoI+XbaI酶切與PCR鑒定證實(shí)構(gòu)建正確，測(cè)序證實(shí)無(wú)堿基誤配。
五、“自殺性”DNA疫苗與用于比較的常規(guī)DNA疫苗的生產(chǎn)工藝疫苗生產(chǎn)工藝的主要流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的大量提取、質(zhì)粒濃度的測(cè)定與稀釋。
1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將“自殺性”DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pSCA-ORF5(氨芐抗性)和常規(guī)DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-ORF5(氨芐抗性)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。具體操作是1)取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的1.5ml EP管中，加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min。2)將離心管放到預(yù)先加溫到42℃的循環(huán)水浴中熱沖擊90秒。3)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2min。4)每管加400μl LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇。為達(dá)到有效轉(zhuǎn)化，復(fù)蘇時(shí)轉(zhuǎn)速不宜超過(guò)225轉(zhuǎn)/分。5)取100μl轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平皿上，用一無(wú)菌彎頭玻棒將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均勻地涂布到瓊脂平板表面。6)將平皿置37℃培養(yǎng)，直至液體被吸收，然后倒置平皿培養(yǎng)，12~16h可出現(xiàn)菌落。
2、質(zhì)粒的大量提取同上述“三、質(zhì)粒pSCA-ORF5的大量制備”的方法(本處省略該詳細(xì)制備步驟)。
3、質(zhì)粒濃度的測(cè)定、稀釋利用分光光度計(jì)測(cè)定大提質(zhì)粒的濃度，用磷酸鹽緩沖液(PBS pH7.4)將其稀釋到1μg/μl或0.2μg/μl，即可用于動(dòng)物注射。
六、疫苗的免疫效力檢驗(yàn)1、對(duì)Balb/c小白鼠的免疫效力試驗(yàn)將“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5經(jīng)后腿肌肉注射6周齡的Balb/c小鼠，每組6只，每只小鼠100μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫兩次，間隔4周；同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo、pSCA作為核酸免疫的陰性對(duì)照。每次免疫后4周經(jīng)尾靜脈負(fù)壓采血，分離血清，檢測(cè)ELISA抗體。二免后4周眼球放血，分離血清，檢測(cè)ELISA抗體和中和抗體。結(jié)果“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5誘導(dǎo)的ELISA抗體和中和抗體均明顯高于常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5。
2、疫苗對(duì)斷奶仔豬的免疫效力試驗(yàn)將“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5、常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5經(jīng)頸部肌肉注射斷奶仔豬，每組4頭，每頭豬500μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫兩次，間隔4周；同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo、pSCA作為核酸免疫的陰性對(duì)照。每次免疫后4周經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，檢測(cè)ELISA抗體和中和抗體水平，同時(shí)采集抗凝血，分離淋巴細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)均明顯高于常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5。


本發(fā)明的生物材料樣品即菌株DH5α/pSCA-ORF5于2003年10月22日保藏，保藏編號(hào)是CCTCCNOM203073，分類(lèi)命名為大腸桿菌(Escherichia coli)，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)。
圖1顯示了PRRSV YA株ORF5基因常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5的構(gòu)建流程2顯示了“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA的構(gòu)建流程3顯示了PRRSV YA株ORF5基因“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5的構(gòu)建流程4顯示了“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5免疫Balb/c小鼠后的ELISA抗體水平圖5顯示了“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5免疫斷奶仔豬后的ELISA抗體水平圖6顯示了“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常規(guī)DNA疫苗pCI-ORF5免疫斷奶仔豬后誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明1、常規(guī)DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pCI-ORF5的構(gòu)建以pMD-ORF5為模板，P52S和P52R為引物擴(kuò)增ORF5基因，純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表達(dá)載體pCI-neo的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pCI-ORF5。其構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。
2、“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA的構(gòu)建以pCI-neo為模板，P1、P2為引物擴(kuò)增SV40 poly(A)序列，純化后用SpeI和XbaI酶切，回收大小約250bp的片段，將其插入載體pSFV1的SpeI位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pSFVA。然后再以pCI-neo為模板，P3、P4為引物擴(kuò)增HCMV IE Enhancer/Promoter片段，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用SphI酶切，回收大小約823bp的片段，將其插入pSFVA的SphI位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pSCA。其構(gòu)建流程見(jiàn)圖2。
3、“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5的構(gòu)建BamHI酶切質(zhì)粒pMD-ORF51，回收目的片段，插入pSCA的BamHI位點(diǎn)，獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pSCA-ORF5。其構(gòu)建流程見(jiàn)圖3。
4、“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5對(duì)Balb/c小白鼠免疫效力的測(cè)定(1)Balb/c小鼠的免疫程序Balb/c小鼠分為4組，每組6只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠100μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫兩次，間隔4周，同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo、pSCA作為核酸免疫的陰性對(duì)照。每次免疫后4周經(jīng)尾靜脈負(fù)壓采血，分離血清，檢測(cè)ELISA抗體。二免后4周眼球放血，分離血清，檢測(cè)ELISA抗體和中和抗體。
(2)ELISA抗體檢測(cè)利用建立的GP5-ELISA方法檢測(cè)血清針對(duì)PRRSV的ELISA抗體，結(jié)果如圖4。
(3)中和抗體檢測(cè)根據(jù)國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)抗血清的PRRSV中和抗體水平，試驗(yàn)結(jié)果如表1表1 Balb/c小鼠二免后第4周的中和抗體水平組別 首免后8周(二免后4周)免疫前(6只/組) ＜1∶4 ≥1∶4 ≥1∶8 ≥1∶16pCI-neoND 6/6 0/6 0/6 0/6pSCA ND 6/6 0/6 0/6 0/6pCI-ORF5 ND 2/6 4/6 1/6 0/6pSCA-ORF5 ND 0/6 6/6 3/6 1/6注ND表示未做5、“自殺性”DNA疫苗pSCA-ORF5對(duì)斷奶仔豬免疫效力的測(cè)定(1)豬的免疫程序斷奶仔豬隨機(jī)分成5組，每組4頭，采用頸部肌肉注射，每頭豬500μL(含100μg質(zhì)粒)，共免疫兩次，間隔4周，同時(shí)用空白質(zhì)粒載體pCI-neo、pSCA作為核酸免疫的陰性對(duì)照。每次免疫后4周經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，檢測(cè)中和抗體水平，同時(shí)采集抗凝血，分離淋巴細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。
(2)中和抗體檢測(cè)根據(jù)國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)抗血清的豬繁殖與呼吸綜合征病毒中和抗體水平，試驗(yàn)結(jié)果如表2表2 斷奶仔豬免疫后的第4周、第8周的中和抗體水平組別(4頭 首免后4周 首免后8周免疫前豬/組) ≥1∶4 ≥1∶8 ≥1∶4 ≥1∶8 ≥1∶16pCI-neo -0/4 0/4 0/4 0/4 0/4pSCA -0/4 0/4 0/4 0/4 0/4pCI-ORF5 -0/4 0/4 1/4 0/4 0/4pSCA-ORF5 -1/4 0/4 4/4 2/4 0/4注—表示中和抗體陰性(3)ELISA抗體檢測(cè)利用建立的GP5-ELISA方法檢測(cè)抗血清的PRRSV ELISA抗體，結(jié)果如圖5。
(4)細(xì)胞免疫水平檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性(CTL)的誘導(dǎo)及測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果如圖6。
權(quán)利要求
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗，其特征是將豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因ORF5插入“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建而成，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌Escherichia coli DH5α/pSCA-ORF5，保藏在CCTCC，保藏號(hào)為M203073。
2.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的“自殺性”DNA疫苗的表達(dá)載體pSCA，其特征是在西門(mén)利克森林病毒復(fù)制子質(zhì)粒型表達(dá)載體pSFV1的非結(jié)構(gòu)蛋白基因上游引入人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子序列，在其多克隆位點(diǎn)下游引入SV40 poly(A)序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗在防制豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬繁殖與呼吸綜合征的“自殺性”DNA疫苗以及該疫苗在防制豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。特征是，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因ORF5插入“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建而成；同時(shí)還構(gòu)建了一種新的適合于制備該“自殺性”DNA疫苗的表達(dá)載體pSCA，該載體是在西門(mén)利克森林病毒復(fù)制子質(zhì)粒型表達(dá)載體pSFVl的非結(jié)構(gòu)蛋白基因上游引入人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子序列，在其多克隆位點(diǎn)下游引入SV40 poly(A)序列。本發(fā)明的“自殺性”DNA疫苗結(jié)合了常規(guī)DNA疫苗與自主復(fù)制型RNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，具有制備工藝簡(jiǎn)單、運(yùn)輸保存方便、安全和免疫效果好等特點(diǎn)?？捎糜谪i繁殖與呼吸綜合征的防制。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1640497SQ200410000238
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月9日
發(fā)明者陳煥春, 方六榮, 肖少波, 金梅林, 吳斌, 劉正飛, 江云波, 牛傳雙 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)