專利名稱：Ic53基因及其相關(guān)產(chǎn)物診斷和治療結(jié)腸癌的用途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物用于診斷和治療結(jié)腸癌的用途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，以40歲～50歲年齡組發(fā)病率最高。據(jù)世界流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)腸癌在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地的發(fā)病率最高，居內(nèi)臟腫瘤前二位，在中國的發(fā)病率與死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常見惡性腫瘤。近年來各地資料顯示隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。中國的有關(guān)資料顯示，結(jié)腸癌發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第4位，而且有逐年增加的趨勢。上海市是中國結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率最高的城市。有數(shù)據(jù)顯示，近年來，結(jié)腸癌中直腸癌多于結(jié)腸癌的情況有所改變，結(jié)腸癌的發(fā)病比例開始增加。1997年，上海大腸癌的發(fā)病率男性高達(dá)37.2/10萬，女性也達(dá)到了35.5/10萬。
在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中通常伴隨許多基因的表達(dá)或活性異常，包括與細(xì)胞生長、分裂和增殖有關(guān)基因如生長因子、生長因子受體、蛋白激酶、細(xì)胞周期相關(guān)基因3等，與凋亡相關(guān)基因如腫瘤壞死因子(TNF)家族、Fas/fas的配體、Bcl-2/Bax、p53等，與浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因如整合素(intergrins)家族、E-Cadherin(鈣調(diào)蛋白)、VEGF及PDGF等。
參與癌癥發(fā)生過程的基因主要有兩大類原癌基因和抑癌基因。原癌基因是被激活或失活的基因，其產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞生長。原癌基因產(chǎn)物包括肽生長因子、生長因子受體、信號傳導(dǎo)因子、酪氨酸激酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。超過30種原癌基因已經(jīng)在人類基因組上定位。抑癌基因能正常調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。這些基因通常編碼核調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白與其他的調(diào)節(jié)蛋白作用以改變他們的活性。此外，與原癌基因和抑癌基因無關(guān)的基因也參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。這些基因通常被歸類于MMR基因。近來，發(fā)現(xiàn)它們存在于細(xì)菌或酵母中，研究者們已經(jīng)找到了兩個人類基因hMSH2和hMLH1，與酵母MMR基因有同源性。這些基因參與結(jié)腸、肺、膀胱、及卵巢腫瘤的發(fā)生。
IC53基因是一個從成人主動脈cDNA文庫中克隆到的一個新基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它與C53互為變位剪接體，故命名為IC53(Isoform of C53)。該基因長2538bp，定位于17q21.31，與C53相比多708bp(IC53的357-1064位)，推斷IC53蛋白包含419個氨基酸殘基，與小鼠C53有84％的同一性，該蛋白無跨膜區(qū)，不包含任何已知的功能域。Northern雜交發(fā)現(xiàn)該基因有兩個轉(zhuǎn)錄本，分別為3.2kb及2.0kb，在下列組織或細(xì)胞中廣泛表達(dá)腦、心臟、骨骼肌、結(jié)腸(不含粘膜)、胸腺、脾、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺、外周血白細(xì)胞、早幼粒白血病HL-60細(xì)胞系、宮頸癌細(xì)胞系S3株、慢性粒細(xì)胞白血病K-562細(xì)胞系、淋巴母細(xì)胞性白血病MOLT-4細(xì)胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji細(xì)胞系、結(jié)腸腺癌SW480細(xì)胞系、肺癌A549細(xì)胞系及黑色素瘤G-361細(xì)胞系。以IC53特異的核甘酸序列(433-1065)做探針分析，發(fā)現(xiàn)IC53為3.2kb，在肝臟，外周血白細(xì)胞，早幼粒白血病HL-60細(xì)胞系，淋巴母細(xì)胞性白血病MOLT-4細(xì)胞系及Burkitt′s淋巴瘤Raji細(xì)胞系中高表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供IC53基因及其產(chǎn)物(蛋白、肽、抗體及本基因相關(guān)的正、反義寡核甘酸、小干擾RNA(siRNA))在制備結(jié)腸癌診斷試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供IC53基因及其產(chǎn)物(蛋白、肽、抗體及本基因相關(guān)的正、反義寡核甘酸、小干擾RNA(siRNAs))在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒及其用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物在制備檢測結(jié)腸癌的試劑中的應(yīng)用，其相關(guān)產(chǎn)物包括蛋白、肽、抗體及本基因相關(guān)的正、反義寡核甘酸和小干擾RNA(siRNAs)。
所述的IC53基因相關(guān)產(chǎn)物是指IC53基因、IC53基因的剪接體、IC53基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA、IC53基因編碼的肽段和IC53基因的抗體中的一種或幾種。
IC53基因在制備檢測結(jié)腸癌的試劑中的應(yīng)用。IC53基因在結(jié)腸癌中超表達(dá)，促進(jìn)瘤體生長及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，是結(jié)腸癌的關(guān)鍵相關(guān)調(diào)控基因。根據(jù)Microarray的結(jié)果，IC53超表達(dá)可以上調(diào)一些與癌癥相關(guān)的基因表達(dá)，如PDGF-B，fra-1，integrin □2，integrin □4，提示IC53可能與癌癥相關(guān)。我們通過Clontech公司(California，USA)的多種癌組織芯片，免疫組化及原位雜交分析了IC53在癌組織與正常組織間的表達(dá)差異。并分析了IC53超表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移、粘附及裸鼠中瘤體生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC53在結(jié)腸癌中表達(dá)較正常組織高，IC53超表達(dá)能促進(jìn)HCT-116及HT-29細(xì)胞增殖并且在體內(nèi)能促進(jìn)瘤體(HCT-116接種裸鼠)生長，能促進(jìn)NIH 3T3、HCT-116及HT-29細(xì)胞遷移，能促進(jìn)HCT-116及HT-29細(xì)胞粘附。這表明IC53在結(jié)腸癌中高表達(dá)并對結(jié)腸癌的進(jìn)展起促進(jìn)作用。檢測IC53在結(jié)腸癌病人中的表達(dá)情況有助于判斷其預(yù)后，阻斷這一過程，抑止結(jié)腸癌的生長及遷移，從而開發(fā)出用于診斷和治療結(jié)腸癌的試劑及治療性產(chǎn)品。
所述的IC53基因是指IC53基因、IC53基因的剪接體、IC53基因的反義寡核苷酸、IC53基因編碼的肽段和IC53基因的抗體中的一種或幾種。
IC53基因在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
所述的藥物由有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑組成。
所述藥物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體為天然分離得到的。
所述藥物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體為化學(xué)合成得到的。
所述藥物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體為通過生物工程方法制備得到的。
一種檢測結(jié)腸癌的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含有以下試劑
1)0.1％胰蛋白酶；2)10％羊血清；3)一抗鼠抗人單克隆IC53抗體；4)生物素化二抗工作液；5)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液；6)DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺)，30mg溶于100ml磷酸鹽緩沖液(PBS)；7)細(xì)胞核分化液100ml 75％酒精中加濃鹽酸0.5ml，混勻。
本試劑盒采用免疫組織化學(xué)原理對IC53基因進(jìn)行檢測，是用標(biāo)記的特異性抗體對組織細(xì)胞內(nèi)抗原的分布進(jìn)行定位并在組織原位顯示其表達(dá)量的方法，其基本原理是利用抗原抗體特異反應(yīng)，結(jié)合酶聯(lián)放大系統(tǒng)進(jìn)行檢測。其基本過程主要包括抗原修復(fù)，非特異位點(diǎn)的封閉，抗原抗體反應(yīng)，酶聯(lián)顯色等。
本試劑盒還可以在免疫組化試驗(yàn)的同時進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，對前者的結(jié)果進(jìn)行輔助驗(yàn)證。為此，試劑盒中還可以包括以下試劑1)特異性擴(kuò)增引物上游引物5’-GTCTGAGGGGACTGACTCT-3’，5PM；下游引物5’-GAAGATCTCAAGCTCCATG-3’，5PM；2)初級親和素/辣根過氧化物酶工作液；3)生物素標(biāo)記的信號擴(kuò)增工作液；4)次級親和素/辣根過氧化物酶工作液。
這種檢測結(jié)腸癌的試劑盒用于檢測結(jié)腸癌進(jìn)程中IC53基因的表達(dá)情況，即通過免疫組化的方法對結(jié)腸癌患者的病理切片中表達(dá)的IC53基因進(jìn)行檢測，得到檢測結(jié)果。
這種檢測IC53基因的試劑盒用于開發(fā)針對IC53基因靶點(diǎn)的診斷和治療結(jié)腸癌的藥物。
這種檢測IC53基因的試劑盒用于研究針對IC53基因靶點(diǎn)的結(jié)腸癌的關(guān)鍵通路。
本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了IC53基因超表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，從而提供了一種診斷結(jié)腸癌的新思路，并為人們研究開發(fā)治療結(jié)腸癌的藥物提供了新的靶點(diǎn)；2)本發(fā)明通過免疫組化和原位雜交分析了IC53在癌癥組織與正常組織間的表達(dá)差異，并分析了IC53超表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移、粘附及裸鼠中瘤體生長的影響，發(fā)現(xiàn)IC53在結(jié)腸癌中高表達(dá)并對結(jié)腸癌的發(fā)展起促進(jìn)作用。根據(jù)這個發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種用于診斷結(jié)腸癌的檢測試劑盒，可利用免疫組化方法檢測IC53在結(jié)腸癌病變組織中的表達(dá)情況，操作簡單易行、結(jié)果安全可靠、并且易于臨床推廣。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開的內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1顯示IC53基因在癌癥中表達(dá)上調(diào)A為IC53特異探針與Cancer profilingarray雜交結(jié)果，B為對照基因(Ubiquitin)與Cancer profiling array雜交結(jié)果。
圖2顯示IC53基因在結(jié)腸癌中的高表達(dá)A為IC53特異探針雜交結(jié)果，B為對照基因(Ubiquitin)雜交結(jié)果，A及B中由上至下第1，3行為正常組織，第2，4行為結(jié)腸癌組織。
圖3顯示IC53單克隆抗體的效價(jià)。
圖4免疫組化表明IC53在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)A為正常結(jié)腸組織；B為結(jié)腸癌組織；C為結(jié)腸癌(右)及癌旁正常組織(左)；D為陰性對照。
圖5顯示IC53原位雜交結(jié)果在結(jié)腸癌及其癌旁正常組織中的表達(dá)存在差異。
圖6為Microarray雜交圖A為以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Myc-His(-)A的ECV304細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄探針雜交結(jié)果；B為以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53的ECV304細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄探針雜交結(jié)果。
圖7為Northern驗(yàn)證PDGF-B表達(dá)上調(diào)，上圖為總RNA膠圖，下圖為Northern雜交結(jié)果。
圖8顯示IC53超表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116及HT-29增殖。
圖9顯示IC53基因超表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116及HT-29遷移。
圖10顯示IC53超表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的黏附。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、IC53基因在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)——多種癌組織芯片分析一、材料與方法(一)多種癌組織芯片(Cancer Profiling Array，Catalog#7841-1)購自Clontech公司，包括乳腺癌，子宮癌，結(jié)腸癌，卵巢癌，宮頸癌，肺癌，腎癌，直腸癌，甲狀腺癌，前列腺癌，胰腺癌，小腸癌12種癌組織及對照正常組織。
(二)制備IC53基因特異探針的模板由于IC53較C53多708bp(IC53的357-1064位)，以下列引物擴(kuò)增IC53基因cDNA的433-1065位上游引物5’-GGAGGCACAGTCTGTGAGTGGGAA-3’，下游引物5’-TGAGAAGTGCCCAGGAAATTC-3)。
1、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))體系

2、PCR參數(shù)94℃ 4分鐘

72℃ 10分鐘3、PCR產(chǎn)物純化1)加入6倍體積的醋酸氨/乙醇(1∶5)，-70℃30分鐘；2)4,000RPM(轉(zhuǎn)/分)10分鐘，12,000RPM 10分鐘；
3)75％乙醇洗滌；4)待乙醇揮發(fā)完，加50ul TE溶解。
(三)標(biāo)記探針在一0.5ml離心管中加入下列試劑(室溫1-3小時)

PCR產(chǎn)物需在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘。
(四)探針純化將柱子先顛倒混勻，去掉底部片狀物放入離心管中，700g離心3分鐘，將標(biāo)記好的探針加到柱子中，換一個新的離心管，700g離心3分鐘。
(五)預(yù)雜交將膜用6XSSC浸5分鐘，貼于雜交管壁，除去氣泡，加入8ml預(yù)雜交液(15ml購于Clontech雜交液加150mg鮭精DNA變性5分鐘后，立即冰浴2分鐘，68℃1小時。
(六)雜交倒掉預(yù)雜交液，加入上一步剩下的雜交液7ml及探針(純化好的探針加入150ug鮭精DNA在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)，68℃ 6小時。
(七)洗膜先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在68℃洗膜四次，每次30分鐘。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在68℃洗30分鐘，共兩次，最后用200ml 2×SSC室溫洗5分鐘。
(八)壓片用濾紙吸去膜上的液體，用保鮮膜包好，貼于一張與X光片相同大小的濾紙上，壓片，-70℃曝光適當(dāng)時間，洗片。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果雜交結(jié)果顯示IC53在乳腺癌，子宮癌，卵巢癌，宮頸癌，肺癌，腎癌，直腸癌，甲狀腺癌，前列腺癌，胰腺癌，小腸癌及正常組織間表達(dá)無差異，在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)(如圖1)。在34例結(jié)腸癌組織有19例表達(dá)較正常組織高(如圖2)。
實(shí)施例2免疫組化驗(yàn)證IC53在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)一、IC53單抗的制備(一)免疫可溶性抗原(IC53合成肽N-EELPEQVAEDAIDWGDC-C與KLH耦連產(chǎn)物)與福氏佐劑(Freund’s Adjuvant，GIBCO)等體積混勻，腹腔注射于Balb/c小鼠，50ug/只，免疫4-8只Balb/c小鼠。第一次免疫，抗原與完全佐劑混合，加強(qiáng)免疫時與不完全佐劑混合。每次免疫時間間隔2-4周，兩次加強(qiáng)免疫后，抗原不與佐劑混合，尾靜脈注射，4天后取脾與SP2/0細(xì)胞融合。
(二)ELISA檢測抗體效價(jià)1、包被將抗原稀釋為10ug/ml，加入酶標(biāo)板中，100ul/well，37℃孵育一小時；2、封閉PBST洗板兩次，棄去上清拍干。加入封閉液，100ul/well，37℃孵育一小時；3、一抗孵育棄去封閉液，加入稀釋好的抗血清或培養(yǎng)上清，100ul/well，37℃孵育一小時；4、洗滌棄上清，PBST加滿每孔，兩秒后棄去，重復(fù)五遍，拍干；5、二抗孵育加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37℃孵育一小時；6、洗滌棄上清，PBST加滿每孔，兩秒后棄去，重復(fù)五遍，拍干；7、顯色底物緩沖液10ml+4mg OPD+30ul H2O2，混勻，100ul/well，RT，避光，10分鐘后加入50ul終止液；
8、比色測量酶標(biāo)儀測定，490nm比色。
(三)細(xì)胞融合1、取生長良好的SP2/0，吹打入50ml離心管，1,000rpm，10分鐘；2、小鼠眼球取血，處死后浸于70％酒精中，約1-2分鐘；3、無菌取脾，在平皿中加入10ml RPMI-1640，用鑷子將脾搗碎，吹打數(shù)次，懸液移入50ml離心管中，用10ml RPMI-1640沖洗平皿，吹打數(shù)次后一并放入50ml離心管中；4、SP2/0及脾細(xì)胞棄上清，加入20ml 1640重懸，1,000rpm，10分鐘；5、配制47％PEG，37℃預(yù)熱(5g PEG+5.4ml RPMI-1640)；6、細(xì)胞棄上清，加入20ml RPMI-1640重懸，分別取50ul于Eppendorft中計(jì)數(shù)，懸液1,000rpm，10分鐘；7、細(xì)胞棄上清，分別用10ml RPMI-1640重懸，按SP2/0脾細(xì)胞約1∶10-1∶2混合，1,000rpm，10分鐘；8、配制好的HAT/30％FBS/RPMI-1640于37℃預(yù)熱；9、2ml RPMI-1640，7ml HAT/30％FBS/RPMI-1640于37℃預(yù)熱；10、細(xì)胞棄上清，彈開沉淀，37℃靜置1分鐘；11、加入0.8-1ml 47％PEG，1分鐘內(nèi)加完；12、37℃或室溫放置1分鐘；13、加入2ml預(yù)熱好的RPMI-1640，3分鐘加完；14、加入7ml HAT/30％FBS/RPMI-1640，3分鐘加完；15、將細(xì)胞稀釋至80-100ml HAT/30％FBS/RPMI-1640中，加入96孔板中，每孔加100ul，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)；16、第二天每孔補(bǔ)加100ul HAT/30％FBS/RPMI-1640，5％CO2孵箱培養(yǎng)。
(四)雜交瘤上清的篩選同ELISA。
(五)擴(kuò)大培養(yǎng)及亞克隆化1、ELISA檢測呈陽性孔的細(xì)胞由96孔板轉(zhuǎn)至24孔板，待細(xì)胞數(shù)目增加后并最終轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并凍存，此為原始種。經(jīng)過數(shù)次單克隆化即可得到比較穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；2、細(xì)胞亞克隆化將細(xì)胞從培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中吹打下來，鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋為1,000個/ml，加至96孔板的第一行，從第一行至第十二行作倍比稀釋，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)約一周，即可觀察到細(xì)胞克隆。只有一個克隆的孔即為單克隆孔；3、篩選陽性單克隆細(xì)胞方法同雜交瘤上清的篩選；4、陽性單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)及進(jìn)一步亞克隆化，方法同前。
(六)腹水制備Balb/c經(jīng)產(chǎn)鼠提前一至二周腹腔注射Pristone(Sigma，T-7640)，將單克隆雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，棄上清，吹打下來，以無菌生理鹽水洗兩遍，記數(shù)，稀釋為105個/ml，腹腔注射于Balb/c經(jīng)產(chǎn)鼠，一周后開始每天觀察，將產(chǎn)生腹水的小鼠引流或處死，打開腹腔，吸取腹水。將得到的腹水3,000rpm離心10分鐘，留取上清，加入NaN3，40℃保存。
二、免疫組化(免疫組化試劑盒Histostain-plus Kit，美國Zymed公司)(一)材料組織切片包括結(jié)腸腺癌及其正常癌旁組織。
(二)方法1、石蠟切片(4μm)60℃干烤2小時；2、常規(guī)脫蠟至水(二甲苯I 15分鐘-二甲苯II 15分鐘-100％乙醇-95％-90％-80％-70％乙醇-水)；3、3％H2O2室溫孵育5分鐘；4、PBS沖洗3次；5、0.1％的胰蛋白酶37℃消化30分鐘；6、0.1％Tritonx-100 PBS洗1分鐘；7、4℃預(yù)冷的4％多聚甲醛固定8分鐘；8、PBS沖洗3次；9、3％H2O2室溫孵育5分鐘；10、PBS沖洗3次；
11、羊血清室溫封閉15分鐘，傾去，勿洗；12、滴加適當(dāng)比例稀釋(1∶100)的一抗，37℃孵育1小時；13、PBS沖洗3次；14、滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育10分鐘；15、PBS沖洗3次；16、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30分鐘；17、PBS沖洗3次；18、DAB鏡下觀察顯色；19、加自來水中止顯色反應(yīng)；20、蘇木素復(fù)染2分鐘；21、自來水沖洗；22、細(xì)胞核分化液25秒；23、流水沖洗2分鐘；24、梯度酒精(70％-80％-90％-95％-100％-100％)；25、二甲苯透明5分鐘；中性樹膠封片。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、單抗滴定，1-10依次表示抗IC53單抗腹水按1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，結(jié)果顯示，該單抗效價(jià)為1∶100，如圖3所示。
2、為了驗(yàn)證上面雜交結(jié)果，我們進(jìn)一步通過免疫組化比較了IC53在結(jié)腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果免疫組化顯示IC53在結(jié)腸癌組織表達(dá)較癌旁正常組織高，在50例結(jié)腸癌病人中，陽性率為72％，如圖4所示。
實(shí)施例3、原位雜交進(jìn)一步驗(yàn)證IC53在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)一、材料與方法(一)模板準(zhǔn)備以下列引物擴(kuò)增IC53特異片段
上游引物5’-GTCTGAGGGGACTGACTCT-3’，下游引物5’-GAAGATCTCAAGCTCCATG-3’。
1、PCR體系10xbuffer 5.0uldNTP(2.5mM) 4.0ul5’primer(5uM)1.0ul3’primer(5uM)1.0ulIC53 plasmid(50ng/ul) 1.0ulTaq(5U/ul)0.5ulddH2O37.5ulTotal 50.0ul2、PCR參數(shù)94℃ 5分鐘 72℃ 10分鐘4℃ ∞3、PCR產(chǎn)物的純化及定量參照QIAquick Gel Extraction Kit Protocol。
1)切取含DNA片段的瓊脂糖，搗碎后按重量比1∶3(瓊脂糖∶溶液B)加入溶液B；2)50℃水浴10分鐘至膠完全溶化；3)將溶液置于離心柱中，靜置1-2分鐘，8,000rpm或以上離心30-60秒；4)倒掉液體，加入500ul溶液C(用無水乙醇1∶1稀釋)于離心柱中8,000rpm或以上離心30-60秒；
5)重復(fù)洗一次；6)15,000rpm或以上離心30-60秒，甩干剩余液體；7)將離心柱置于新管中，加入適量(30-50ul)50℃預(yù)熱的溶液D，靜置2分鐘，15000rpm或以上離心60秒；8)測OD及跑膠定量。
(二)探針的定量檢測1、在硝酸纖維素膜(NC膜)上分別滴加已標(biāo)記好的IC53探針，生物素化lambda對照，預(yù)先標(biāo)記好的生物素化marker，各2ul；2、將NC膜放入烤箱中，80℃，1小時；3、254nm，紫外交聯(lián)120秒(DNA面向上)；4、將NC膜用PBS緩沖液潤濕，滴加抗生物素抗體；5、37℃孵育1小時；6、DAB顯色，雙蒸水終止反應(yīng)；(三)探針標(biāo)記1、將1ug上述PCR純化產(chǎn)物溶于無核酸酶水中，總體積為34ul；對照組為2ul(lug)非生物素化的lambda control DNA和32ul無核酸酶水；2、沸水中變性5分鐘；3、快速冰置5分鐘；4、4℃短暫離心；5、按次序向標(biāo)記管和對照管中分別加入以下試劑10ul 5x labeling mix(contains biotinylated random octamers)5ul dNTP mix(contains dNTPs and biotin-dATP)1ul Klenow Fragment6、在37℃孵育6小時；7、每管加5ul 0.2M EDTA(pH8.0)終止反應(yīng)；8、每管加5ul 4M LiCl和150ul無水乙醇，-70℃放置半小時；9、4℃，12,000rpm離心10分鐘，棄上清；
10、每管加1ml 70％乙醇洗一次，4℃，12,000rpm離心5分鐘，棄上清；11、室溫晾干，每管加20ul TE重懸，-20℃凍存。
二、原位雜交步驟(原位雜交試劑盒GenPoint，美國DAKO公司)(一)組織切片的準(zhǔn)備工作1、將石蠟切片(4-6um)60℃烘烤2小時，切片方向垂直；2、脫臘至水(二甲苯5分鐘-100％酒精2分鐘-95％酒精1分鐘-75％酒精1分鐘-去離子水1分鐘)；3、37℃孵育5分鐘，使切片完全干燥；4、在切片上滴加2-3滴新稀釋的1x蛋白酶K溶液，確保整個切片都被覆蓋住，37℃孵育10分鐘；5、在室溫條件下，將切片依次浸入下列溶液去離子水1分鐘-70％酒精1分鐘-95％酒精1分鐘-100％酒精1分鐘；6、37℃孵育5分鐘。
(二)原位雜交及檢測1、將標(biāo)記好的生物素化IC53探針與雜交液以1∶1稀釋，在切片上滴加一滴混合好的探針雜交液(陰性對照不加標(biāo)記探針，只加雜交液)；2、在每張切片上加一張蓋玻片，小心別含有氣泡；3、將加有蓋玻片的切片放入烤箱中，95℃孵育10分鐘，使DNA變性；4、將切片放入濕盒中，37℃孵育4小時，使標(biāo)記探針充分與靶核苷酸結(jié)合；5、將切片浸入蛋白封閉液，直至蓋玻片脫落，蓋玻片脫落后，37℃繼續(xù)孵育3分鐘；6、用預(yù)熱的蛋白封閉液洗玻片，37℃，5分鐘，2次；7、去除組織切片上的多余封閉液，并在切片上滴加1-2滴初級親和素/辣根過氧化物酶工作液，將切片放入濕盒中，37℃孵育40分鐘；8、去除切片上的多余試劑，將切片放入變性洗脫液中洗5分鐘；9、小心去除切片上的多余洗液，在切片上滴加1-2滴生物素標(biāo)記的信號擴(kuò)增工作液，將切片放入濕盒中，37℃孵育20分鐘；
10、去除切片上的多余試劑，變性洗脫液洗5分鐘；11、去除切片上的多余洗液，在切片上滴加1-2滴次級親和素/辣根過氧化物酶工作液，37℃孵育20分鐘；12、去除切片上的多余試劑，變性洗脫液洗5分鐘；13、去除切片上的多余洗液，在切片上滴加1-2滴DAB，室溫孵育，顯微鏡下顯色；14、去除切片上的多余試劑，用去離子水洗2-3遍；15、蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水(95％-100％-100％)，二甲苯透明，中性樹膠封片。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們進(jìn)一步通過原位雜交比較了IC53在結(jié)腸癌及其癌旁正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果原位雜交顯示IC53在結(jié)腸癌組織表達(dá)較癌旁正常組織高，如圖5所示。
實(shí)施例4、IC53超表達(dá)調(diào)控一些與癌癥相關(guān)的基因表達(dá)一、材料與方法(一)IC53真核表達(dá)載體構(gòu)建用下列引物(上游引物5’-CTAGTCTAGAGGATGTGTGTGCATCCTGGGGCA-3’，下游引物5’-CCCGGTACCTCACAGAGAGGTTCCCATCAG-3’)及Pfu經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一具有XbaI及KpnI酶切位點(diǎn)的片段，經(jīng)XbaI及KpnI(NEB)消化的片段及pCDNA3.1/Myc-His(-)A載體切膠回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化，堿裂解法小提質(zhì)粒(步驟見下)，測序鑒定。
(二)堿裂解法小提質(zhì)粒1、將搖好的1.5ml菌液(將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化DH5α菌株后，在LB培養(yǎng)基中于37度搖16小時)，4,000rpm×10分鐘，棄上清；2、加預(yù)冷的溶液I 100ul(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，10mmol/L EDTA(pH＝8.0))，振蕩混勻；3、加溶液II(0.2mol/L NaOH，1％ SDS)200ul，上下顛倒5次，冰置；4、加溶液III(60ml 5mol/L+乙酸鉀11.5ml冰乙酸+28.5ml水)150ul，上下顛倒數(shù)次，冰置5分鐘；5、12,000g×10分鐘，取上清，轉(zhuǎn)管；6、加一倍體積的酚∶氯仿(1∶1)，上下顛倒混勻；7、12,000g×10分鐘，取上清，轉(zhuǎn)管；8、加無水乙醇1ml，室溫置3分鐘；9、12,000g×5分鐘，棄上清；10、70％乙醇洗一次，12,000g×3分鐘，棄上清；11、空氣干燥，加含RNase 100ng/ml的TE緩沖液25ul；12、37℃消化。
(三)轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒提取(按QIAGEN Plasmid Purification Handbook 1999關(guān)于QIAfilterTMPlasmid Mid Kit的提取方法。)1、轉(zhuǎn)化重組正確的質(zhì)粒(測序鑒定)到大腸桿菌DH5α菌株(實(shí)驗(yàn)室自有)中；2、挑單克隆接種于3mlLB培養(yǎng)基中(氨芐100ug/ml)，37℃，300rpm，8小時；3、按1∶100將其接種于25ml LB培養(yǎng)基中(氨芐100ug/ml)，37℃，300rpm，12-16小時；4、收獲細(xì)菌，4℃，6,000g，15分鐘；5、用4ml已加RNaseA的Buffer P1重懸細(xì)菌，充分混勻；6、加入4ml Buffer P2，溫和混勻，室溫放置5分鐘(不能超過5分鐘，以防止染色體DNA斷裂)；7、準(zhǔn)備QIAfilter Cartridge，將螺帽擰在其下面的管口上，放于一無菌的50ml管中備用；8、加入4ml預(yù)冷的Buffer P3，溫和混勻以裂解細(xì)菌，不要置于冰上；9、將裂解混合物加入QIAfilter Cartridge中，室溫放置10分鐘，不要插入活塞；10、加4ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip100；11、去掉QIAfilter Cartridge下面的螺帽，溫和插入活塞，將裂解液濾入平衡好的QIAGEN-tip100中；
12、讓液體靠重力通過柱子；13、用Bffer QC按10ml/次，洗柱子兩次；14、用Bffer QF 5ml洗脫DNA(質(zhì)粒)；15、用3.5ml室溫放置的異丙醇沉淀質(zhì)粒，混勻，4℃，15,000g，30分鐘；16、用2ml室溫放置的70％乙醇洗滌沉淀，小心去上清，4℃，15,000g，10分鐘；17、室溫干燥沉淀(5-10分鐘)；18、用100ul無菌的TE溶解質(zhì)粒，測OD定量并跑膠鑒定。
(四)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞1、ECV304細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室自備)按106cells/ml(0.5ml cells/孔)接種于6孔板中培養(yǎng)20小時；2、用100ul無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋2ug pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或pcDNA3.1/Myc-His(-)A，為Solution A；3、用100ul無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋5ul Lipofectin，室溫20分鐘，為Solution B；4、將Solution A和B混勻，室溫30分鐘；5、加入800ul無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，混勻后加入用無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基洗過的細(xì)胞中，37℃，5％CO2培養(yǎng)4-6小時，換成2ml完全培養(yǎng)基；6、48小時后，加入200ug/ml G418篩選14-20天，獲得穩(wěn)定克隆。
(五)Microarray分析1、Total RNA提取(Trizol一步法)1)按1ml/cm2加入Trizol試劑，裂解細(xì)胞，室溫2-3分鐘；2)加入Trizol 1/5體積的氯仿，劇烈振蕩1分鐘，室溫2-3分鐘；3)4℃，12,000g離心20分鐘；4)小心吸取上清，加入等體積4℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，室溫10分鐘；5)4℃，12,000g離心20分鐘；6)沉淀用-20℃預(yù)冷的75％乙醇洗滌；
7)室溫干燥沉淀后，用DEPC水溶解，測OD定量，備用或保存于-70℃。
2、DNaseI(RNase free)處理1)在1.5ml小管中加入500ul Total RNA(500ug)100ul 10×DNaseI buffer50ul DNaseI(1u/ul)350ul RNase-free water2)37℃水浴30分鐘；3)加入100ul 10×終止液，混勻，分成兩管；4)每管加入500ul水飽和酚及300ul氯仿，劇烈振蕩1分鐘；5)15,000g，4℃離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至另一管，加550ul氯仿，劇烈振蕩1分鐘；6)15,000g，4℃離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至另一管，加入十分之一體積的2M醋酸鈉及二點(diǎn)五倍體積的95％乙醇，混勻，冰浴10分鐘；7)15,000g，4℃離心10分鐘，棄上清，加入500ul 80％乙醇；8)15,000g，4℃離心10分鐘，棄上清，室溫干燥沉淀10分鐘；9)加250ul RNase free water溶解，測OD，變性膠電泳鑒定。
3、PolyA+RNA分離及探針標(biāo)記1)準(zhǔn)備Streptavidin Magnectic Beads①重懸磁珠，每個探針分裝15ul磁珠到1.5ml管中；②用磁珠分離器吸引磁珠，棄上清；③用150ul結(jié)合緩沖液洗磁珠；④用磁珠分離器吸引磁珠，棄上清；⑤重復(fù)3次；⑥用15ul結(jié)合緩沖液重懸磁珠。
2)PolyA+RNA富集①預(yù)熱PCR儀到70℃。
②分裝30ug total RNA到0.5ml小管，并用無RNase水調(diào)整體積至45ul；③加入1ul Biotinglated Oligo(dT)，用槍頭吹打混勻；④70℃加熱2分鐘，室溫冷卻10分鐘；⑤加入45ul 2×結(jié)合緩沖液，用槍頭吹打混勻；⑥每個樣品加入15ul重懸好的磁珠；⑦劇烈振蕩25-30分鐘；⑧用磁珠分離器吸引磁珠，棄上清；⑨用50ul 1×洗液溫和重懸磁珠，用磁珠分離器吸引磁珠，棄上清，洗兩次；⑩用50ul 1×反應(yīng)緩沖液溫和重懸磁珠。用磁珠分離器吸引磁珠，棄上清；用6ul無RNase水重懸。
3)cDNA探針合成①配制反應(yīng)體系5×反應(yīng)緩沖液 4.0ul10×dNTP 2.0ul[α-32P]dATP(10uci/ul) 5.0ulDTT 0.5ul②預(yù)熱PCR儀至65℃；③在重懸的磁珠中加入1ul CDS引物，用槍頭混勻；④65℃加熱2分鐘；⑤降溫至50℃加熱2分鐘，在此過程中，每個反應(yīng)加入2ul M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；⑥在50℃預(yù)熱2分鐘后，加入13.5ul反應(yīng)混合物，混勻，50℃25分鐘；⑦加入2ul終止緩沖液終止反應(yīng)；4)探針純化①用緩沖液NT2稀釋探針至200ul；②將一個柱子放置于一個2ml收集管中，加入樣品，14,000rpm離心1分鐘；③棄收集管，將管子轉(zhuǎn)到另一個收集管中，加入400u1緩沖液NT3，洗3次；④轉(zhuǎn)移柱子到一個1.5ml管中，加入100ul緩沖液NE，室溫2分鐘，14,000rpm離心1分鐘；⑤取2ul加入到5ml閃爍液中，計(jì)數(shù)，期望值為1-10×106。
4、雜交1)預(yù)熱5ml雜交液，68℃30-60分鐘；2)加熱(95-100℃)0.5mg鮭精DNA 5分鐘，冰浴2分鐘；3)將處理后的鮭精DNA加入雜交液中，置于68℃；4)將膜置于雜交桶中，小心除去氣泡，加入含鮭精DNA的雜交液，68℃ 30分鐘；5)加入5ul cot-1 DNA到標(biāo)記好的探針中，煮沸2分鐘，冰浴2分鐘；6)將處理好的探針加入到雜交液中，68℃雜交12-16小時；7)準(zhǔn)備洗液I(2×SSC，1％SDS)及洗液II(0.1×SSC，0.5％SDS)，68℃預(yù)熱30分鐘；8)用200ml洗液I 68℃洗30分鐘，重復(fù)3-4次；9)用200ml洗液II 68℃洗30分鐘，200ml 2×SSC室溫洗5分鐘；10)用鑷子夾出膜，除去多余液體，包好壓片，72小時后洗片。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果IC53超表達(dá)引起的其它基因表達(dá)改變?yōu)榱诉M(jìn)一步研究IC53的功能，我們通過Microarray分析了IC53超表達(dá)引起的其它基因表達(dá)情況，該膜購自Clontech公司，包含588個基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC53超表達(dá)顯著6個與癌癥相關(guān)的基因表達(dá)(如表1)。改變倍數(shù)通過photoshop圖像分析，部分雜交圖片結(jié)果如圖6所示。
表1IC53超表達(dá)改變下列癌癥相關(guān)基因的表達(dá)(U上調(diào)，D下調(diào))


實(shí)施例5、Northern驗(yàn)證IC53超表達(dá)上調(diào)PDGF-B一、材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料隨機(jī)引物試劑盒(Prime-a-Gene Labeling System)購自Promega，雜交液(ExpressHyb Hybridization Solution)購自Clontech，，α-32P-dCTP購自北京亞輝公司，雜交爐(Hybridization Oven Red Roller II)為Phamacia Biotech產(chǎn)品。
(二)實(shí)驗(yàn)方法1、以下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備PDGF-B探針模板。按Trizol法提取TotalRNA上游引物5’-GTATTTGCTGTATTGCCCCCATG-3’；下游引物5’-TTCAGGGATCAGGCAGGCTATG-3’。
2、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))體系

PCR參數(shù) 94℃ 3分鐘 72℃ 7分鐘3、PCR產(chǎn)物純化加入6倍體積的醋酸氨/乙醇(1∶5)，-70℃30分鐘。4,000RPM(轉(zhuǎn)/分)10分鐘，12,000RPM 10分鐘。75％乙醇洗滌。待乙醇揮發(fā)完，加50ul TE溶解。
4、轉(zhuǎn)膜1)稱取0.6g瓊脂糖凝膠加入52.2ml DEPC處理過的水中，加熱溶解，待膠冷到65℃，加入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，倒入膠槽；2)取40-60ug(4.5ul)總RNA，加入2.0ul 10×MOPS，3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混勻，65℃變性15分鐘冰上冷卻2分鐘，假加入2.0ul上樣緩沖液，混勻；3)50伏預(yù)電泳5分鐘，上樣；4)待染料全部進(jìn)入膠后，電壓降為40伏，10分鐘混合一次電泳緩沖液；5)待溴酚蘭泳動到凝膠底部，停止電泳，照相；6)用DEPC處理過的水洗膠數(shù)次；7)用50mM的NaOH處理45分鐘；8)用20×SSC處理45分鐘；9)尼龍膜先用去離子水浸濕，再用20×SSC處理45分鐘；10)在膠托上鋪一層濾紙，用20×SSC浸濕，除去氣泡；11)將膠倒置于膠托上，在其上面放一中間挖空的塑料薄片；12)小心將膜置于膠上，除去氣泡；13)在膜上鋪兩張20×SSC浸濕的濾紙，除去氣泡；14)在濾紙上鋪上10cm高的吸水紙，壓一500克的重物；15)轉(zhuǎn)膜16小時，中間換吸水紙2-3次；16)小心取下膜，照相；
17)用6×SSC泡膜5分鐘；18)紫外交聯(lián)，80℃烤膜1小時，4℃保存?zhèn)溆茫?、Northern雜交1)標(biāo)記探針參照隨機(jī)引物試劑盒(Prime-a-Gene Labeling System)在0.5ml離心管中加入下列試劑(室溫1-3小時)

PCR產(chǎn)物需在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘；2)預(yù)雜交將膜用6×SSC浸5分鐘，貼于雜交管壁，除去氣泡，加入6ml購于Clontech的雜交液，68℃ 1小時；3)雜交倒掉雜交液，加入預(yù)熱的雜交液6ml，加入探針(探針需在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)，68℃ 3小時；4)洗膜先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在室溫洗膜四次，每次10分鐘，再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在50℃洗20分鐘，56℃洗20分鐘；5)壓片用濾紙吸去膜上的液體，用保鮮膜包好，貼于一張與X光片相同大小的濾紙上，壓片，-70℃曝光適當(dāng)時間；6)洗片(放射科)。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果Microarray結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC53超表達(dá)能上調(diào)PDGF-B的表達(dá)，為了驗(yàn)證Microarray的結(jié)果，我們進(jìn)行了Northern分析，結(jié)果與Microarray吻合，如圖7所示。
實(shí)施例6、IC53基因超表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116及HT-29增殖一、材料與方法(一)IC53真核表達(dá)載體構(gòu)建用下列引物(上游引物5’-CTAGTCTAGAGGATGTGTGTGCATCCTGGGGCA-3’，下游引物5’-CCCGGTACCTCACAGAGAGGTTCCCATCAG-3’)及Pfu經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一具有XbaI及KpnI酶切位點(diǎn)的片段，經(jīng)XbaI及KpnI(NEB)消化的片段及pCDNA3.1/Myc-His(-)A載體切膠回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化，堿裂解法小提質(zhì)粒(步驟見下)，測序鑒定。
1、堿裂解法小提質(zhì)粒1)將搖好的1.5ml菌液(將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化DH5α菌株后，在LB培養(yǎng)基中于37度搖16小時)，4,000rpm×10分鐘，棄上清；2)加預(yù)冷的溶液I 100ul(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，10mmol/L EDTA(pH＝8.0))，振蕩混勻；3)加溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)200ul，上下顛倒5次，冰置；4)加溶液III(60ml 5mol/L+乙酸鉀11.5ml冰乙酸+28.5ml水)150ul，上下顛倒數(shù)次，冰置5分鐘；5)12,000g×10分鐘，取上清，轉(zhuǎn)管；6)加一倍體積的酚∶氯仿(1∶1)，上下顛倒混勻；7)12,000g×10分鐘，取上清，轉(zhuǎn)管；8)加無水乙醇1ml，室溫置3分鐘；9)12,000g×5分鐘，棄上清；10)70％乙醇洗一次，12,000g×3分鐘，棄上清；11)空氣干燥，加含RNase 100ng/ml的TE緩沖液25ul；12)37℃消化。
2、轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒提取(按QIAGEN Plasmid Purification Handbook 1999關(guān)于QIAfilterTMPlasmid Mid Kit的提取方法。)1)轉(zhuǎn)化重組正確的質(zhì)粒(測序鑒定)到大腸桿菌DH5α菌株(實(shí)驗(yàn)室自有)中；
2)挑單克隆接種于3mlLB培養(yǎng)基中(氨芐100ug/ml)，37℃，300rpm，8小時；3)按1∶100將其接種于25ml LB培養(yǎng)基中(氨芐100ug/ml)，37℃，300rpm，12-16小時；4)收獲細(xì)菌，4℃，6,000g，15分鐘；5)用4ml已加RNaseA的Buffer P1重懸細(xì)菌，充分混勻；6)加入4ml Buffer P2，溫和混勻，室溫放置5分鐘(不能超過5分鐘，以防止染色體DNA斷裂)；7)準(zhǔn)備QIAfilter Cartridge，將螺帽擰在其下面的管口上，放于一無菌的50ml管中備用；8)加入4ml預(yù)冷的Buffer P3，溫和混勻以裂解細(xì)菌，不要置于冰上；9)將裂解混合物加入QIAfilter Cartridge中，室溫放置10分鐘，不要插入活塞；10)加4ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip100；11)去掉QIAfilter Cartridge下面的螺帽，溫和插入活塞，將裂解液濾入平衡好的QIAGEN-tip100中；12)讓液體靠重力通過柱子；13)用Bffer QC按10ml/次，洗柱子兩次；14)用Bffer QF 5ml洗脫DNA(質(zhì)粒)；15)用3.5ml室溫放置的異丙醇沉淀質(zhì)粒，混勻，4℃，15,000g，30分鐘；16)用2ml室溫放置的70％乙醇洗滌沉淀，小心去上清，4℃，15,000g，10分鐘；17)室溫干燥沉淀(5-10分鐘)；18)用100ul無菌的TE溶解質(zhì)粒，測OD定量并跑膠鑒定。
(二)IC53穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3，HCT-116及HT-29細(xì)胞1、NIH3T3，HCT-116及HT-29細(xì)胞按106cells/ml(0.5ml cells/孔)接種于6孔板中培養(yǎng)20小時，NIH3T3，HCT-116及HT-29細(xì)胞用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)，37℃，5％CO2；
2、用100ul無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋2ug pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或pcDNA3.1/Myc-His(-)A，為Solution A；3、用100ul無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋5ul Lipofectamine，室溫20分鐘，為Solution B；4、將Solution A和B混勻，室溫30分鐘；5、加入800ul無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，混勻后加入用無抗的RPMI 1640培養(yǎng)基洗過的細(xì)胞中，37℃，5％CO2培養(yǎng)4-6小時，換成2ml完全培養(yǎng)基；6、48小時后，加入400ug/ml G418篩選14-20天，獲得穩(wěn)定克隆。
(三)MTT分析細(xì)胞增殖接種1000個HCT-116及HT-29細(xì)胞(購買自北京金賽斯公司)(轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/Myc-His(-)A或pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53)到96孔板，接種前在含0.4％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中饑餓24小時，培養(yǎng)6天后(每兩天換液一次)，加入20ul MTT(5mg/ml，Sigma)，37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時，棄上清，向沉淀中加入100ul DMSO，充分溶解后，490nm測OD，重復(fù)三次。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果IC53超表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116及HT-29增殖HCT-116及HT-29兩種結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Myc-His(-)A或pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定克隆篩選采用含400ug/ml G418，10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前用含200ug/ml G418，0.4％FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓12小時。如圖8所示，經(jīng)MTT分析發(fā)現(xiàn)IC53超表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。
實(shí)施例7、IC53基因超表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116及HT-29遷移一、材料與方法(一)鼠尾膠原制備1、材料大鼠尾巴，1％醋酸，75％酒精2、方法1)取大鼠尾巴，洗凈，75％酒精浸泡5分鐘；2)手持尾巴，用止血鉗夾住鼠尾的尖端，折斷尾骨后拉出尾腱；
3)將尾腱剪斷置于平皿中，稱重至1g；4)加入適量1％醋酸溶液，將尾腱置于平皿內(nèi)剪碎，并轉(zhuǎn)移至總體積為500ml的1％醋酸溶液中；5)充分搖晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置一周；6)4000轉(zhuǎn)離心10分鐘；7)吸取上清并分裝，4℃保存。
(二)Transwell檢測細(xì)胞遷移1、20ug/ml鼠尾I型膠原封閉8um-孔徑，24孔Transwell(BD公司)聚乙烯膜(6.5-mm insert membrane)的下層，4℃過夜；2、PBS洗膜，并用1mg/ml BSA封閉；3、NIH 3T3，HCT-116及HT-29細(xì)胞用0.4％的DMEM培養(yǎng)液饑餓處理12小時；4、用0.02％EDTA和0.125％trpsin消化液將細(xì)胞消化下來，0.1％BSA的DMEM培養(yǎng)液洗一遍之后，用0.1％BSA的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞的最終濃度為1×106cells/ml；5、Transwell下層各孔加600ul 0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)液，對照組為0.5％BSA的DMEM培養(yǎng)液；6、Transwell上層各孔加入100ul NIH 3T3細(xì)胞懸液(1×106cells/ml，0.1％BSA的DMEM培養(yǎng)液)；7、37℃孵育4小時后，吸出上層細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗上層Transwell膜；8、10％中性福爾馬林固定10分鐘，PBS洗一遍；9、0.5％結(jié)晶紫染色5分鐘，雙蒸水洗兩遍，室溫晾干；10、計(jì)算遷移到下層膜上的細(xì)胞量，在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取10個視野計(jì)數(shù)；11、數(shù)據(jù)處理每一組數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組與組之間的比較用t檢驗(yàn)。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
用Transwell分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或空載體的HCT-116和HT-29兩種細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，IC53超表達(dá)能顯著促進(jìn)其遷移，結(jié)果見圖9。
實(shí)施例8、IC53超表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116對基質(zhì)的黏附一、材料與方法1、5ug/ml的Matrigel封閉24孔板，4℃過夜；2、PBS洗一遍，并用2％的BSA封閉30分鐘；3、NIH 3T3，HCT-116及HT-29細(xì)胞用0.4％的DMEM培養(yǎng)液饑餓處理12小時；4、用0.02％EDTA和0.125％trpsin消化液將細(xì)胞消化下來，0.1％BSA的DMEM培養(yǎng)液洗一遍之后，用0.1％BSA的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞的最終濃度為2×106cells/ml；5、24孔板各孔加入500ul NIH 3T3，HCT-116及HT-29細(xì)胞細(xì)胞懸液(2×106cells/ml，0.1％BSA的DMEM培養(yǎng)液)；6、37℃孵育1小時后，吸去培養(yǎng)基，在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取10個視野照相；7、然后用10％中性福爾馬林固定10分鐘，PBS洗一遍；8、0.5％結(jié)晶紫染色5分鐘，雙蒸水洗兩遍，室溫晾干；9、用100ul5％SDS+50％乙醇溶解，室溫放置20分鐘，吸出溶液轉(zhuǎn)到酶標(biāo)板中，490nm測OD，重復(fù)三次。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果促進(jìn)細(xì)胞黏附過程的基因有整合素等。而IC53超表達(dá)能上調(diào)integrinα2，和integrinα4。我們推測IC53超表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞黏附，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或空載體的HCT-116細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，IC53超表達(dá)能顯著促進(jìn)這種細(xì)胞的黏附，結(jié)果見圖10。
實(shí)施例9、IC53基因促進(jìn)結(jié)腸癌瘤體生長一、材料1、免疫缺陷小鼠為了排除其它因素的干擾，本實(shí)驗(yàn)均用免疫缺陷小鼠，即俗稱的裸鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所，BALB/c Nude、5-6周齡、雌性。這種小鼠胸腺缺失，為第11對染色體隱性遺傳；由于無胸腺，不能使T細(xì)胞正常分化，故T細(xì)胞免疫缺陷；B淋巴細(xì)胞正常，但功能缺陷，抗體主要為IgM，只有少量IgG；無接觸敏感性，無移植排斥反應(yīng)，因此廣泛用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和疾病發(fā)生機(jī)理的研究。
2、細(xì)胞選用轉(zhuǎn)染IC53基因、空載體及未轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基(10％FBS，100單位/ml的青霉素，100單位/ml的鏈霉素)，37℃，5％CO2進(jìn)行培養(yǎng)。待HCT-116細(xì)胞長至70-80％匯合，用0.125％的胰酶消化下來，1×PBS洗兩遍，再用適當(dāng)體積的1×PBS重懸，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以調(diào)整細(xì)胞濃度，最后將細(xì)胞懸浮于適量PBS中，每只裸鼠接種0.7×106個細(xì)胞。
二、方法1、腫瘤細(xì)胞皮下接種裸鼠用帶6號針頭的一次性1ml注射器抽取上述準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液接種于裸鼠(BALB/c Nude，♀，5～6周齡)右側(cè)腹背部皮下。每個處理組(轉(zhuǎn)染IC53基因、空載體及未轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞)均有6只裸鼠。
2、觀測腫瘤的生長狀況每3-4天觀察一次腫瘤的形成情況，并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的直徑。腫瘤的體積用公式V＝a×b2/2來計(jì)算，其中a為腫瘤最長的直徑，而b則是與這條長徑垂直的直徑。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染IC53基因能顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116在裸鼠體內(nèi)的瘤體生長。
實(shí)施例10、結(jié)腸癌的檢測試劑盒一、成分及含量1、0.1％胰蛋白酶；2、羊血清(10％)；3、一抗鼠抗人單克隆IC53抗體；(實(shí)驗(yàn)室制備)4、生物素化二抗工作液；5、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液；(試劑盒中自帶)
6、DAB，3，3-二氨基聯(lián)苯胺，30mg溶于100ml PBS緩沖液后，加30ml到立式染缸中，顯示8-10分鐘。
7、細(xì)胞核分化液100ml 75％酒精中加濃鹽酸0.5ml，混勻；加30ml到立式染缸中，分化3-5秒。
8、中性樹膠。(試劑盒中自帶，用100ul封片)二、本試劑盒的使用方法(一)組織切片包括結(jié)腸腺癌及其正常癌旁組織。
1、石蠟切片(4μm)60℃干烤2小時；2、常規(guī)脫蠟至水(二甲苯I15分鐘-二甲苯II15分鐘-100％乙醇-95％-90％-80％-70％乙醇-水)；3、3％H2O2室溫孵育5分鐘；4、PBS沖洗3次；5、0.1％的胰蛋白酶37℃消化30分鐘；6、0.1％Tritonx-100PBS洗1分鐘；7、4℃預(yù)冷的4％多聚甲醛固定8分鐘；8、PBS沖洗3次；9、3％H2O2室溫孵育5分鐘；10、PBS沖洗3次；11、10％羊血清室溫封閉15分鐘，傾去，勿洗；(蓋住切片即可，約0.5ml)12、滴加適當(dāng)比例稀釋(1∶100)的一抗，37℃孵育1小時；13、PBS沖洗3次；14、滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育10分鐘；15、PBS沖洗3次；16、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30分鐘；17、PBS沖洗3次；18、DAB鏡下觀察顯色；19、加自來水中止顯色反應(yīng)；
20、蘇木素復(fù)染2分鐘；21、自來水沖洗；22、細(xì)胞核分化液25秒；(加30ml到立式染缸中，分化3-5秒)23、流水沖洗2分鐘；24、梯度酒精(70％-80％-90％-95％-100％-100％)；25、二甲苯透明5分鐘；中性樹膠封片。(用100ul封片)三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，免疫組化顯示IC53在結(jié)腸癌組織表達(dá)較癌旁正常組織高，在50例結(jié)腸癌病人中，陽性率為72％。
實(shí)施例11、判斷結(jié)腸癌預(yù)后的檢測試劑盒(含原位雜交試劑)一、成分及含量在實(shí)施例10的成分基礎(chǔ)上添加下述試劑1)特異性擴(kuò)增引物上游引物5’-gtctgaggggactgactct-3’，5pM/50ml；下游引物5’-gaagatctcaagctccatg-3’，5pM/50ml；2)初級親和素/辣根過氧化物酶工作液；3)生物素標(biāo)記的信號擴(kuò)增工作液；4)次級親和素/辣根過氧化物酶工作液。
二、本試劑盒的使用方法見實(shí)施例3。
本發(fā)明通過免疫組化和原位雜交分析了IC53在癌癥組織與正常組織間的表達(dá)差異，并分析了IC53超表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移、粘附及裸鼠中瘤體生長的影響，發(fā)現(xiàn)IC53在結(jié)腸癌中高表達(dá)并對結(jié)腸癌的發(fā)展起促進(jìn)作用。根據(jù)這個發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種用于判斷結(jié)腸癌預(yù)后的檢測試劑盒，可利用免疫組化方法檢測IC53在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，并還可通過原位雜交驗(yàn)證其特異性，操作簡單易行、結(jié)果安全可靠、并且易于臨床推廣。
權(quán)利要求
1.IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物在制備檢測結(jié)腸癌的試劑中的應(yīng)用，其相關(guān)產(chǎn)物包括蛋白、肽、抗體及本基因相關(guān)的正、反義寡核甘酸和小干擾RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IC53基因在制備檢測結(jié)腸癌的試劑中的應(yīng)用，其特征在于所述的IC53基因相關(guān)產(chǎn)物是指IC53基因、IC53基因的剪接體、IC53基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA、IC53基因編碼的肽段和IC53基因的抗體中的一種或幾種。
3.IC53基因在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的IC53基因在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物由有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的IC53基因在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體為天然分離得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的IC53基因在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體為化學(xué)合成得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的IC53基因在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接體、或IC53基因的反義寡核苷酸、或IC53基因編碼的肽段、或IC53基因的抗體為通過生物工程方法制備得到的。
8.一種檢測結(jié)腸癌的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含有以下試劑1)0.1％胰蛋白酶；2)10％羊血清；3)一抗鼠抗人單克隆IC53抗體；4)生物素化二抗工作液；5)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液；6)DAB3，3-二氨基聯(lián)苯胺，30mg溶于100ml PBS緩沖液；7)細(xì)胞核分化液100ml 75％酒精中加濃鹽酸0.5ml，混勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測結(jié)腸癌的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含有以下試劑1)特異性擴(kuò)增引物上游引物5’-gtctgaggggactgactct-3’，5PM；下游引物5’-gaagatctcaagctccatg-3’，5PM；2)初級親和素/辣根過氧化物酶工作液；3)生物素標(biāo)記的信號擴(kuò)增工作液；4)次級親和素/辣根過氧化物酶工作液。
10.權(quán)利要求8或9所述的一種檢測結(jié)腸癌的試劑盒用于檢測結(jié)腸癌進(jìn)程中IC53基因的表達(dá)情況。
11.權(quán)利要求8或9所述的一種檢測IC53基因的試劑盒用于開發(fā)針對IC53基因靶點(diǎn)的診斷和治療結(jié)腸癌的藥物。
12.權(quán)利要求8或9所述的一種檢測IC53基因的試劑盒用于研究針對IC53基因靶點(diǎn)的結(jié)腸癌的關(guān)鍵通路。
全文摘要
本發(fā)明公開了IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物在制備檢測結(jié)腸癌的試劑中的應(yīng)用，其相關(guān)產(chǎn)物包括蛋白、肽、抗體及本基因相關(guān)的正、反義寡核甘酸和小干擾RNA。本發(fā)明的有益效果是1)首次發(fā)現(xiàn)了IC53基因超表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，提供了一種診斷結(jié)腸癌的新思路，為研究開發(fā)治療結(jié)腸癌的藥物提供了新的靶點(diǎn)；2)通過免疫組化和原位雜交分析了IC53在癌癥組織與正常組織間的表達(dá)差異，并分析了IC53超表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移、粘附及裸鼠中瘤體生長的影響，發(fā)現(xiàn)IC53在結(jié)腸癌中高表達(dá)并對結(jié)腸癌的發(fā)展起促進(jìn)作用。據(jù)此，提供了一種用于診斷結(jié)腸癌的檢測試劑盒，利用免疫組化方法檢測IC53在結(jié)腸癌病變組織中的表達(dá)情況，操作簡單易行、結(jié)果安全可靠、易于臨床推廣。
文檔編號A61K48/00GK1556221SQ200410000070
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者惠汝太, 陳敬洲, 韓玉, 王偉, 石毅, 張銀輝, 于暉, 甄一松, 宋曉東 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院