豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合 病毒RvHBJX及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病，主要以懷孕母豬發(fā)生 流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙疾病以及仔豬和生長(zhǎng)育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀為 特征（Rossowetal.，1994)。2006年初夏以來(lái)，嚴(yán)重型PRRS暴發(fā)，并迅速席卷我國(guó)主要養(yǎng) 豬地區(qū)，造成大批生豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。疫苗被認(rèn)為是防控與凈化 PRRSV的重要工具。但是，PRRSV感染能引起免疫抑制與持續(xù)性感染，減毒活疫苗的長(zhǎng)期使 用存在毒力返強(qiáng)等潛在風(fēng)險(xiǎn)（Madsenetal.，1998)。感染性克隆技術(shù)為新型疫苗的研宄提 供了技術(shù)保障。自從第一株P(guān)RRSV的感染性克隆成功構(gòu)建以來(lái)（Meulenbergetal.，1998)， 反向遺傳操作技術(shù)已用于分析和研宄PRRSV的基因結(jié)構(gòu)與功能、病毒RNA合成的調(diào)控機(jī)制、 致病機(jī)制，以及新型疫苗的研宄。
[0003] 一般說(shuō)來(lái)，用同源性高的毒株進(jìn)行免疫能獲得較好的抵抗力。因此將流行毒株的 某些基因置換到傳統(tǒng)疫苗中，也許能提高疫苗的免疫效力。Ellingson等人利用MLV疫苗 毒、MN184毒株為親本病毒構(gòu)建了 5個(gè)嵌合病毒，其中兩個(gè)是MLV疫苗毒、MN184毒株5'UTR/ 0RF1相互置換的病毒，一個(gè)是以MLV為骨架置換了MN1840RF5-6的嵌合病毒，一個(gè)是以MLV 為骨架置換了MN1840RF7-3 'UTR的嵌合病毒，一個(gè)是以MLV為骨架置換了MN184毒株3 'UTR 的嵌合病毒。這些嵌合病毒免疫后的攻毒實(shí)驗(yàn)顯示MLV疫苗毒、MN184毒株5'UTR/0RF1相 互置換的病毒及以MLV為骨架置換了MN1840RF5-6的嵌合病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生與傳統(tǒng)細(xì)胞 培養(yǎng)疫苗相似的抵抗力。Lee等人用韓國(guó)PRRSV流行毒株的結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)置換了感染性 cDNA克隆質(zhì)粒中的相應(yīng)區(qū)域并拯救出相應(yīng)的PRRSV嵌合病毒，該病毒能夠被自然感染豬的 血清所中和，相應(yīng)的體內(nèi)試驗(yàn)尚未開(kāi)展。以上結(jié)果說(shuō)明通過(guò)嵌合病毒來(lái)研制新型疫苗是可 行的。
[0004]我國(guó)先前的分離毒株P(guān)RRSVHB-1 (sh) /2002(GenBank收錄號(hào)AY150312)(Gao etal.，2004)，在全基因組序列上與高致病性毒株的同源性最高（97. 2%)，但致病性 低。該毒株經(jīng)MARC-145細(xì)胞連續(xù)傳代，獲得能在MARC-145細(xì)胞中良好增殖的克隆毒株 HB-1/3. 9 (GenBank收錄號(hào)EU360130)(冉智光等，2006)，與高致病性毒株的全基因組序列 同源性為97. 4%。這兩個(gè)毒株基因組高度同源而生物學(xué)特性，如毒力、致病性、生長(zhǎng)特性、免 疫原性等差異較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒；本發(fā)明的另一目的在 于提供該嵌合病毒作為嵌合疫苗候選株的用途。
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒，命名為RvHBJX，是以低致 病性PRRSV毒株HB-1/3. 9為骨架，含有高致病性PRRSV毒株JXwn06結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的嵌 合病毒。
[0007] 其中，高致病性PRRSV毒株JXwn06結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的基因序列如SEQIDNO. 1所 不〇
[0008] 本發(fā)明提供了豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒，是通過(guò) 以下方法構(gòu)建得到：
[0009] (1)以pWSK-JXwn為模板，PCR擴(kuò)增得到JXwn06的整個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物 命名為HJSP-S2 ;
[0010] (2)以pWSK-HB-1/3. 9為模板，分別PCR擴(kuò)增HB-1/3. 9結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)兩側(cè)序列， 分別命名為HJSP-S1、HJSP-S3 ;
[0011] (3)將步驟（1)和（2)的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S33個(gè) 片段作為模板，PCR擴(kuò)增得到HJSP-S123 ;
[0012] (4)HJSP-S123純化后經(jīng)RsrII、AscI雙酶切，連接到相同雙酶切的 pWSK-HB-1/3. 9質(zhì)粒中，完成PRRSV嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建，命名為pW-HJSP。
[0013] 其中，步驟（l)PCR擴(kuò)增使用的引物為JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQID NO. 2、3 所示；
[0014] 步驟（2)PCR擴(kuò)增分別以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R為引物，其核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 4-7所示；
[0015] 步驟（3)?〇?擴(kuò)增的引物為耵-包81〇1^和耵-包8丨〇111?，其核苷酸序列如5￡0 10 NO. 8-9 所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法，包括以 下步驟：
[0017] (1)構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒；
[0018] (2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。
[0019] 上述方法中，步驟（1)的克隆質(zhì)粒通過(guò)以下方法構(gòu)建得到：
[0020] 1)以pWSK-JXwn為模板，PCR擴(kuò)增得到JXwn06的整個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物 命名為HJSP-S2 ;
[0021] 2)以pWSK-HB-1/3. 9為模板，分別PCR擴(kuò)增HB-1/3. 9結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)兩側(cè)序列， 分別命名為HJSP-S1、HJSP-S3 ;
[0022] 3)將步驟1)和2)的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2,HJSP-S33個(gè)片 段作為模板，PCR擴(kuò)增得到HJSP-S123 ;
[0023] 4)HJSP-S123純化后經(jīng)RsrII、AscI雙酶切，連接到相同雙酶切的 pWSK-HB-1/3. 9質(zhì)粒中，完成PRRSV嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建，命名為pW-HJSP。
[0024] 全基因組序列測(cè)定表明，pW-HJSP質(zhì)粒中結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)與JXwn06 -致，而其余 骨架與HB-1/3. 9 -致，同時(shí)HB-1/3. 9親本拯救病毒的兩個(gè)遺傳標(biāo)記MluI與SfiI酶切 位點(diǎn)仍然存在。
[0025] 進(jìn)一步地，步驟1)中PCR擴(kuò)增使用的引物為JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如 SEQIDNO. 2、3 所示；步驟 2)中PCR擴(kuò)增分別以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R為引 物，其核苷酸序列分別如SEQIDNO. 4-7所示；步驟3)中PCR擴(kuò)增的引物為HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQIDNO. 8-9所示。
[0026] 本發(fā)明的制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法中，步驟（2)的嵌 合病毒RvHBJX的拯救通過(guò)以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0027] 1)用RsrII、PacI內(nèi)切酶消化pW-HJSP全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒，使質(zhì)粒線性化；獲 得的線性化質(zhì)粒經(jīng)酚氯仿抽提及無(wú)水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后質(zhì)粒 的濃度；
[0028] 2)立即進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；
[0029] 3)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)TURBODNaseI消化后，用DMRIE-C脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，每 天觀察并記錄細(xì)胞病變CPE的產(chǎn)生情況；將出現(xiàn)明顯CPE的細(xì)胞培養(yǎng)上清在MARC-145細(xì)胞 上進(jìn)行連續(xù)傳代，每代3-5d。獲得的拯救病毒即為RvHBJX。
[0030] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述步驟2)的體外轉(zhuǎn)錄是按照mMessagemMachinc?High YieldCappedRNATranscriptionkit(AmbionInc.，Texas,USA)操作說(shuō)明進(jìn)行的。
[0031] 本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合疫苗，含有本發(fā)明提供的豬繁殖與呼 吸綜合征嵌合病毒RvHBJX或其傳代培養(yǎng)后的病毒。
[0032] 本發(fā)明提供了豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒或其傳代培養(yǎng)后的病毒在制備疫苗 中的用途。
[0033] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)嵌合病毒RvHBJX在MARC-145細(xì)胞上連續(xù)傳代80次后，病毒滴度由第 5代的104 5TCID5(l/mL升高至107.51TCID5(l/mL。經(jīng)過(guò)多次連續(xù)的體外傳代，嵌合病毒的細(xì)胞適 應(yīng)能力顯著提高。
[0034] 本發(fā)明通過(guò)選擇RvHBJXP40、P60、P80毒株人工感染仔豬，分析比較其對(duì)高致病性 PRRSV感染的免疫保護(hù)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV嵌合毒株RvHBJXP40、P60和P80細(xì)胞傳代毒株 免疫仔豬后均能減輕感染仔豬的臨床癥狀，降低感染仔豬血清中的病毒載量，顯著降低仔 豬的死亡數(shù)量，減輕病毒感染造成的肺臟損傷。該嵌合病毒經(jīng)MARC-145細(xì)胞體外連續(xù)傳代 80次，該病毒遺傳性質(zhì)表現(xiàn)穩(wěn)定；病毒對(duì)宿主細(xì)胞的適應(yīng)性隨傳代次數(shù)的增加逐漸增強(qiáng)； PRRSV嵌合毒株RvHBJXP60傳代60次（P60)及以上對(duì)本體動(dòng)物具有較好的安全性，且接種 后能夠?qū)Ω咧虏⌒訮RRSV毒株感染提供100%的免疫保護(hù)，可作為豬繁殖與呼吸綜合征的 疫苗候選株開(kāi)發(fā)。
[0035] 經(jīng)動(dòng)物安全性試驗(yàn)及攻毒保護(hù)性試驗(yàn)證明，本發(fā)明所獲得的豬繁殖與呼吸綜合征 嵌合疫苗HBJX接種仔豬后不會(huì)引起明顯的臨床癥狀，作為疫苗使用的安全性較好；并能夠 為感染仔豬提供較好的免疫保護(hù)，減輕高致病性PRRSV感染帶來(lái)的危害。該嵌合疫苗的病 毒骨架來(lái)源于臨床分離的自然低