專利名稱:有效抑制不同毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的非翻譯區(qū)特異人工微小rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域。具體涉及有效抑制不同毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)復(fù)制的非翻譯區(qū)特異人工微小RNA的制備與使用。
背景技術(shù):
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病,以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)、 死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及仔豬呼吸道癥狀和高死亡率為主要特征。目前,該病主要用疫苗接種進(jìn)行預(yù)防,但現(xiàn)有滅活苗的免疫效果不確實(shí),弱毒疫苗有散毒風(fēng)險(xiǎn),迫切需要研究防控該病的新策略。RNA干擾(RNAi)是近年來(lái)快速發(fā)展的一種序列特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù),在功能基因組研究、新藥開(kāi)發(fā)、癌癥治療和抗病毒感染等方面具有廣泛的應(yīng)用。在抗病毒感染方面,RNAi幾乎能抑制所有病毒的復(fù)制。具有RNAi作用的包括小干擾RNA (siRNA)和微小 RNA (miRNA),兩者既有相似性又有差異性,前者是化學(xué)合成和轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的21堿基雙鏈 RNA,需與目標(biāo)序列完全互補(bǔ),結(jié)合導(dǎo)致相應(yīng)mRNA的降解;后者是由長(zhǎng)RNA轉(zhuǎn)錄子加工成的成熟產(chǎn)物,不需與目標(biāo)序列完全互補(bǔ),結(jié)合導(dǎo)致mRNA翻譯阻滯。目前用于抑制PRRSV復(fù)制研究的都是針對(duì)病毒蛋白編碼基因的siRNA,所用毒株都是同源單一毒株。PRRSV的5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)核酸序列高度保守,含病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)控元件;3’ UTR有高度保守的八核苷酸序列,對(duì)PRRSV復(fù)制具有重要作用,與病毒基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒顆粒包裝密切相關(guān)。本發(fā)明根據(jù)PRRSV 5’ UTR和3’ UTR保守區(qū)序列設(shè)計(jì)人工miRNA,用人工miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞,經(jīng)抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞, 根據(jù)50%組織細(xì)胞感染劑量(TCID5tl)和病毒基因表達(dá)抑制篩選有效的人工miRNA,篩選的人工miRNA不僅能有效抑制同源PRRSV的復(fù)制,而且能抑制異源毒株的復(fù)制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于篩選有效抑制不同毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的非翻譯區(qū)特異人工微小RNA。本發(fā)明所述的有效抑制不同毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的非翻譯區(qū)特異人工微小RNA (miRNA),它的序列如SEQ ID N0:l_4之一所示。上述的特異人工miRNA表達(dá)載體構(gòu)建、miRNA設(shè)計(jì)、雙鏈寡核苷酸合成與克隆、 miRNA表達(dá)檢測(cè)及其對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制作用如下
a、人工miRNA表達(dá)載體構(gòu)建參考小鼠BIC基因非編碼mRNAmiR-155 5’和3’側(cè)翼序列,人工合成miRNA表達(dá)盒,中間引入兩個(gè)m^sl位點(diǎn),兩端分別引入HindIII和DraIII位點(diǎn),將其插入真核表達(dá)載體PCDNA3的相同位點(diǎn),獲得人工miRNA表達(dá)載體pcDNA-miR ;
b、miRRNAi 設(shè)計(jì)用 BLOCK-iT RNAi Designer 軟件分析 PRRSV 的 UTR 序列,獲得 10 個(gè)針對(duì)5’ UTR和6個(gè)針對(duì)3’ UTR的目標(biāo)序列,根據(jù)星級(jí)評(píng)分和序列比對(duì)結(jié)果,各選擇3個(gè)進(jìn)行表達(dá)研究;
c、雙鏈寡核苷酸合成與克隆用分析軟件中的DesignmiR RNAi指令產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸,將人工合成的雙鏈寡核苷酸插入限制酶KdsI線性化的pcDNA-miR載體;
d、有效miRNA篩選用miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Marc_145細(xì)胞,用PRRSV感染后,根據(jù)細(xì)胞病變抑制程度初步選擇有效miRNA ;
e、miRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞獲得用miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Marc_145細(xì)胞,經(jīng)G418篩選獲得抗性細(xì)胞,用PolyA加尾RT-PCR檢測(cè)序列特異miRNA表達(dá);
f、PRRSV復(fù)制抑制效果檢測(cè)用不同毒株P(guān)RRSV感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,定期收集病毒,在 Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行50%組織細(xì)胞感染劑量(TCID5tl)測(cè)定;定期收集細(xì)胞,用miRNA cDNA 合成試劑盒檢測(cè)miRNA表達(dá)。在上述步驟d中,利用表達(dá)載體細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒感染試驗(yàn),篩選得針對(duì)5’ UTR 和3’ UTR的人工miRNA各2條,其中有效抑制不同毒株P(guān)RRSV復(fù)制的5’ UTR人工miRNA 兩條,針對(duì)的目標(biāo)序列分別為5-ACATTTGTTGTCAGGAGCT -3 (SEQ ID NO 1)和5-TTTGTATTCAGGAGCTGTG-3 (SEQ ID NO 2);有效抑制不同毒株 PRRSV 復(fù)制的 3,UTR 人工miRNA兩條,針對(duì)的目標(biāo)序列分另U為5-TGCCTCTATCACCTATTCA-3 (SEQ ID NO 3)和 5-TGTGCCTCAGTCACCTATT-3 (SEQ ID NO :4)。步驟e中,從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中能檢測(cè)到序列特異miRNA ;步驟f中,miRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞在兩株P(guān)RRSV感染后4 檢測(cè)不到病毒復(fù)制,感染后7 的TCID5tl較對(duì)照組下降4. Olog 以上,感染后96h的TCID5tl較對(duì)照組下降3. 51og以上。本發(fā)明篩選的人工miRNA不僅能抑制同源株P(guān)RRSV復(fù)制,而且能抑制異源株P(guān)RRSV復(fù)制。本發(fā)明中,用BLOCK-iT RNAi Designer軟件進(jìn)行miR RNAi設(shè)計(jì),是因?yàn)樵摴臼翘峁㏑NAi產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)的專業(yè)公司,其可靠性已被實(shí)驗(yàn)證實(shí);用pcDNA-miR作為人工 miRNA表達(dá)載體,是因?yàn)樵撦d體用限制酶rn^sl線性化后,可直接與編碼人工miRNA的雙鏈寡核苷酸連接,不僅可同時(shí)表達(dá)兩個(gè)針對(duì)相同或不同病毒(基因)的人工miRNA,而且其CMV啟動(dòng)子用組織特異表達(dá)啟動(dòng)子替換后可用于靶向RNA干擾研究。與針對(duì)PRRSV蛋白編碼基因的SiRNA相比,本發(fā)明篩選的針對(duì)病毒5’ UTR和3’ UTR 的人工miRNA不僅能抑制同源毒株復(fù)制,而且能抑制異源毒株復(fù)制,不僅可作為抗PRRS的新型生物制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā),而且可用于抗病豬品系培育。
圖1是人工miRNA表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖
Pcmv代表人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子;5’ miR和3’ miR代表小鼠miR-155側(cè)翼序列;pre-miRNA ds oligo為編碼前體miRNA的雙鏈寡核苷酸;TK polyA為T(mén)K基因轉(zhuǎn)錄終止序列;NruI、HindIII JbsI、DraIII為限制酶切位點(diǎn)。圖2是有效人工miRNA篩選
miR5UTRl-3 分別代表 PRRSV 5,UTR 人工 miRNA miR5UTRl、miR5UTR2、miR5UTR3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miR3UTRl-3 分別代表 3,UTR 人工 miRNA miR3UTRl、miR3UTR2、miR3UTR3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miRcon為針對(duì)綠色熒光蛋白基因的對(duì)照miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;No miRNA為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照。
圖3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中序列特異miRNA的RT-PCR檢測(cè)
M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1: miR5UTRl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;2: miR5UTR2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;3: miR3UTRl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;4: miR3UTR2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;5:空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照;6:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照。圖4 VR2332株P(guān)RRSV感染miRNA表達(dá)細(xì)胞中的GP5基因半定量RT-PCR檢測(cè)頂圖為PRRSV GP5和內(nèi)參猴β-actin基因轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖;底圖縱
坐標(biāo)為兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)百分率;miR5UTRl-2分別代表PRRSV 5’ UTR人工 miRNA miR5UTRl、miR5UTR2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miR3UTRl_2 分別代表 3,UTR 人工 miRNA miR3UTRl、miR3UTR2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miRcon為對(duì)照miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;No miRNA 為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖5 VR2332株P(guān)RRSV感染miRNA表達(dá)細(xì)胞中的病毒滴度檢測(cè)
縱坐標(biāo)代表病毒滴度(TCID5tl);橫坐標(biāo)代表病毒感染后時(shí)間;miR5UTRl-2分別代表 PRRSV 5,UTR 人工 miRNA miR5UTRl、miR5UTR2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miR3UTRl_2 分別代表 3'UTR人工miRNA miR3UTRl、miR3UTR2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miRcon為對(duì)照miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;No miRNA為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖6 JXAl株P(guān)RRSV感染miRNA表達(dá)細(xì)胞中的病毒滴度檢測(cè)
縱坐標(biāo)代表病毒滴度(TCID5tl);橫坐標(biāo)代表病毒感染后時(shí)間;miR5UTRl-2分別代表 PRRSV 5,UTR 人工 miRNA miR5UTRl、miR5UTR2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miR3UTRl_2 分別代表 3'UTR人工miRNA miR3UTRl、miR3UTR2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;miRcon為對(duì)照miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;No miRNA為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式生物材料來(lái)源
pcDNA3 載體從美國(guó) Invitrogen life technologies 公司引進(jìn);實(shí)施例
一、人工miRNA表達(dá)載體構(gòu)建
參考小鼠BIC非編碼mRNA序列(GenBank ACCESSION AY096003)中5’ miR側(cè)翼序列(134-160核苷酸)和3’ miR側(cè)翼序列(221-265核苷酸)以及單純皰疹病毒TK基因 (GenBank ACCESSION HQ686001) polyA 序列(1115-1136 核苷酸),設(shè)計(jì)人工 miRNA 表達(dá)盒,兩端分別引入HindIII和DraIII位點(diǎn),5,miR和3’ miR側(cè)翼序列之間引入兩個(gè)BbsI位點(diǎn)(5-GTGTCTTCAAGATCTGGAAGACAT-3,SEQ ID NO :5)。將序列送南京金斯瑞生物科技有效公司進(jìn)行化學(xué)合成,合成序列克隆在pMD-18載體。用限制酶HindIII和DraIII將miRNA表達(dá)盒從合成載體上切下,與同酶切去除多克隆位點(diǎn)和BGH polyA序列的真核表達(dá)載體pcDNA3 (Invitrogen公司)連接,獲得由人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子和單純皰疹病毒TK基因polyA 信號(hào)控制的人工miRNA表達(dá)載體pcDNA-miR (見(jiàn)圖1),經(jīng)序列測(cè)定證明表達(dá)載體構(gòu)建正確。二、miR RNAi 設(shè)計(jì)
用 Invitrogen 公司的 BLOCK—iT RNAi Designer 在線軟件(www. invitrogen. com)分析 Ch-Ia 株 PRRSV 5,UTR和 3,UTR 序列(ACCESSION AY032626),獲得 10 個(gè)針對(duì) 5,UTR和 6
個(gè)針對(duì)3’ UTR的目標(biāo)序列(表1 ),根據(jù)該軟件推薦的星級(jí)評(píng)分和序列比對(duì)結(jié)果,各選擇3彳星級(jí)評(píng)分最高和GenBank中100株P(guān)RRSV保守的目標(biāo)序列進(jìn)行表達(dá)研究,選擇出的5’ UTR6、 5,UTR7、5,UTRlO、3,UTR2、3,UTR3 禾Π 3,UTR4 對(duì)應(yīng)的人工 miRNA 分別命名為 miR5UTRl、 miR5UTR2、miR5UTR3、miR3UTRl、miR3UTR2 和 miR3UTR3。用同樣的策略,設(shè)計(jì) 1 個(gè)針對(duì)綠色熒光蛋白基因(GenBank Accession U55762)的人工miRNA作為對(duì)照,命名為miRcon。 三、雙鏈寡核苷酸合成與克隆
用BLOCK-iT RNAi Designer軟件中的Design miR RNAi指令產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸(表 2)序列,將序列送美國(guó)IDT公司進(jìn)行單鏈寡核苷酸(oligo)合成。將每對(duì)單鏈寡核苷酸進(jìn)行退火,反應(yīng)體系為正鏈 DNA oligo (200 μΜ) 5 μ 1,負(fù)鏈 DNA oligo (200 μ Μ) 5μ 1, IOX Oligo Annealing Buffer 2μ 1 (IOOmM Tris-Hcl PH 8. 0,500mM Nacl,IOmM EDTA), 去離子水8μ1。將反應(yīng)體系在94° C孵育5min,然后緩慢冷卻到室溫使其退火。用限制酶m^I消化pcDNA-miR載體(圖1 ),與退火產(chǎn)生的雙鏈寡核苷酸連接,獲得的人工miRNA表達(dá)載體分別命名為 pcDNA-miR5UTRl、pcDNA-miR5UTR2、pcDNA_miR5UTR3、pcDNA_miR3UTRl、 pcDNA-miR3UTR2、pcDNA-miR3UTR3、pcDNA-miRcon。用酶切法和序列測(cè)定法驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。
權(quán)利要求
1. 一種有效抑制不同毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的非翻譯區(qū)特異人工微小 RNA,其特征在于,它的序列如SEQ ID N0:l_4之一所示。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計(jì)的有效抑制不同毒株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)復(fù)制的非翻譯區(qū)特異人工微小RNA(miRNA)屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域,所述微小RNA序列如SEQIDNO1-4之一所示。本發(fā)明還公開(kāi)了包括基于RNA聚合酶II的人工miRNA表達(dá)載體構(gòu)建、miRRNAi設(shè)計(jì)、雙鏈寡核苷酸合成與克隆、miRNA表達(dá)檢測(cè)及其對(duì)不同毒株P(guān)RRSV復(fù)制的抑制作用。與針對(duì)其它PRRSV基因的siRNA相比,本發(fā)明篩選的人工miRNA針對(duì)病毒RNA基因組的非翻譯區(qū)保守序列,既能抑制同源毒株復(fù)制,也能抑制異源毒株復(fù)制,既可用于抗PRRSV感染制劑開(kāi)發(fā),也可用于轉(zhuǎn)基因豬抗病品系培育。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102296069SQ20111025546
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者夏冰, 夏曉莉, 孫懷昌, 宋紅芹, 張?chǎng)斡? 陳陽(yáng) 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)