一種檢測小麥矮腥黑粉菌的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病原檢測技術(shù)，特別是涉及檢測小麥矮腥黑粉菌的試劑盒和方 法。 技術(shù)背景
[0002] 小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病 是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害，也是我國外來生物入侵研宄 的主要物種之一（王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國進(jìn)境植物檢疫有害生物選編，中華人 民共和國動植物檢疫局和農(nóng)業(yè)部植物檢疫實(shí)驗(yàn)所編，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997, 95? 98)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產(chǎn)量損失一般為20?50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)75? 90%，甚至絕產(chǎn)。病菌抗逆性極強(qiáng)，其冬孢子在土中可存活3?7年，包裹在菌癭中的冬孢 子甚至可保持活力長達(dá)10年以上。此病害一旦發(fā)生，很難防治或根除，所以國際上有15個(gè) 國家將其列為檢疫對象加以防范。我國從20世紀(jì)60年代開始一直將此病害列為一類對外 檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在形態(tài)學(xué)上 極為相似，難于區(qū)別。
[0003] 傳統(tǒng)的病害診斷、檢測方法主要是依據(jù)病原形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的特性， 不但過程繁瑣、時(shí)間周期長，而且準(zhǔn)確性差、精度不高。因此，利用分子生物學(xué)手段快 速、準(zhǔn)確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。1996年Ferreira等 (FerreiraM.A. ,TooleyP.ff. ,HatziloukasE.etc.Isolationofaspeciesspecific mitochondrialDNAsequenceforidentificationofTilletiaindica,theKarnal buntofwheatfungus[J].ApplicationEnvironmentMicrobiology,1996,62:87 ? 93)首次將PCR技術(shù)引進(jìn)到印度腥黑穗病（TilletiaindicaMitra)的鑒定中來，他們 選擇了印度腥黑粉菌線粒體DNA的一個(gè)2.3kb的EcoRI片段進(jìn)行了克隆和測序，設(shè) 計(jì)的特異性引物Til/Ti4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等 (Smith0.P. ,PetersonG.L.BeckR.J.etc.DevelopmentofaPCR-basedmethodfor identificationofTilletiaindica,causalagentofkarnalbuntofwheat[J]. Phytopathology, 1996, 86:115?122)通過克隆印度腥黑粉菌線粒體DNA的DraI片段， 進(jìn)行了序列分析，設(shè)計(jì)了兩套寡核苷酸引物對Til7/Ml和Til7/M2,能分別從印度腥黑粉菌 中擴(kuò)增出大小為825bp和118bp特異性片段，也實(shí)現(xiàn)了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。 2000 年Frederic等(FrederickR.D. ,SnyderK.E. ,TooleyP.ff.Identificationand DifferentiationofTilletiaindicaandT.walkeriusingthePolymeraseChain Reaction[J].Phytopathology, 2000, 90:951-960.)根據(jù)線粒體的差異設(shè)計(jì)了 5 對針對印 度腥黑粉菌的特異性引物和3對針對黑麥草腥黑粉菌的特異性引物，分別能將印度腥黑粉 菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。張競宇等（張競宇，張正光，鄭 小波，等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測[J].高技術(shù)通訊，2004, 1:31?36)利用核糖體 ITS序列上的差異在Tilletia屬20個(gè)種中設(shè)計(jì)了一對特異性引物T1/T2,能將T.indica和 T.walkeri從其它種中區(qū)分開來，而后又根據(jù)T.indica和T.walkeri線粒體之間的差異設(shè) 計(jì)了一對特異性引物M1/M2,可以將二者區(qū)分開來，為了使反應(yīng)更為靈敏，建立了套式PCR 技術(shù)，以便于提供更簡單的鑒定方法。梁宏等（梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種 檢疫性真菌rDNA2IGS區(qū)的擴(kuò)增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2006,36(5):407-412) 依據(jù)核糖體的IGS1區(qū)特性，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣 屬種中鑒別出來。2004年高強(qiáng)（高強(qiáng).小麥矮腥黑穗病的分子檢測[D].長沙，湖南農(nóng)業(yè)大 學(xué)，2004)利用RAH)技術(shù)找到了一條可以將小麥網(wǎng)腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區(qū) 別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌之間沒有找到有差異的 條帶，沒能將二者分開。2006年周業(yè)琴，劉素萍等（周業(yè)琴，劉素萍，周國梁，等.水稻腥 黑粉病菌的單孢檢測[J]。植物檢疫，2006, 20:38?41)應(yīng)用核糖體ITS序列的通用引物 Till/Til4和兩對特異性引物（Hor2/Hor9;Hml/Hm5)結(jié)合建立了套式PCR技術(shù)，可以將水 稻腥黑粉菌標(biāo)定出來。本實(shí)驗(yàn)室陳萬權(quán)、劉太國、劉建華利用AFLP技術(shù)，找到了小麥矮腥黑 粉菌的特異性片段，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區(qū)分開來，該技術(shù)已經(jīng)獲得國家 發(fā)明專利，專利號為：200510080073. 7,但未報(bào)道其檢測的靈敏度，尚未在海關(guān)檢疫中應(yīng)用。 [0004] 酶聯(lián)免疫檢測方法，具有速度快，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，在病原菌檢測中多有應(yīng)用，但 是該技術(shù)的特異性和靈敏性依賴于采用的抗體一抗原之間的特異性識別及捕獲性能，以及 影響膠體金顯色的一些因素。具體在檢測一種病原時(shí)，需要篩選或者制備得到特異性好的 單克隆抗體，并對影響因素進(jìn)行調(diào)整才有可能獲得好的特異性和靈敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明基于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，提供一種適用于檢測矮腥黑粉菌的單克隆抗體， 以及依賴該抗體的特異性好，靈敏度高的檢測方法和試劑盒。具體方案如下：
[0006] 一株雜交瘤細(xì)胞，其特征在于：用于分泌對小麥矮腥黑粉菌（Tilletia controversaKUhn)的單克隆抗體，名稱為：F-2-1,其保藏號為CGMCCNo. 9714。
[0007] -種對小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn)的單克隆抗體，其特征在 于，由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞所分泌。
[0008] 所述單克隆抗體在檢測小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn)或者檢測 小麥矮腥黑穗病中的用途。
[0009] -種檢測小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn)的試劑盒，包括試紙條 和微孔板，
[0010] 所述試紙條包括底板、樣本吸收墊、反應(yīng)膜和吸水墊；所述樣本吸收墊、反應(yīng)膜、吸 水墊依次黏貼安裝在所述底板上；
[0011] 其特征在于：所述微孔板的微孔中有凍干的微孔試劑，所述微孔試劑指膠體金標(biāo) 記權(quán)利要求2所述的單克隆抗體而得的金標(biāo)抗體；
[0012] 所述反應(yīng)膜分為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)包被有小麥矮腥黑粉菌多克隆抗 體，所述質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。
[0013] 所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。
[0014] -種檢測小麥矮腥黑粉菌的方法，其特征在于采用上述試劑盒對待測物進(jìn)行檢 測，其步驟如下：
[0015] (1)制備待測樣本溶液
[0016] (2)向所述微孔中滴加樣本溶液，混勾，將所述試紙條上對應(yīng)樣本吸收墊的一端插 入微孔中并接觸到其中的微孔試劑，讀取所述試紙條的檢測結(jié)果判斷待測樣品是否含有小 麥矮腥黑粉菌。
[0017] 所述待測物為疑似攜帶小麥矮腥黑粉菌的小麥植株或其組織，所述制備待測樣本 溶液指：取小麥植株或其組織5g放入10mLPBS緩沖溶液中，并加入終濃度為質(zhì)量體積百分 比0. 2%的助溶劑聚乙二醇2000,超聲提取5-10分鐘，取上清。
[0018] 上述試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
[0019] (1)準(zhǔn)備對小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體及多克隆抗體
[0020] (2)制備微孔試劑，樣本吸收墊、反應(yīng)膜和吸水墊，
[0021] (3)將樣本吸收墊，反應(yīng)膜和吸水墊依次黏貼安裝在底板上；
[0022] 其特征在于制備微孔試劑包括如下幾部分：
[0023] 膠體金溶液：在100ml質(zhì)量百分比為0.01%的氯金酸水溶液中，加入1.5ml 1%的 檸檬酸三鈉溶液，加熱攪拌冷卻得膠體金溶液；
[0024] 準(zhǔn)備小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物：在磁力攪拌下，在所述膠體金 溶液中加入〇. 2mol/L碳酸鉀調(diào)pH值至7. 2,按lml膠體金加60yg抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶 液中加入所述小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10%BSA至BSA在 膠體金溶液中的終濃度為體積百分含量為1%，靜置30min;12000rpm、4°C離心30min，棄 上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液重懸沉 淀，得到的小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物溶液，置4°C備用；
[0025] 所述復(fù)溶緩沖液：pH7. 2,含牛血清白蛋白、吐溫-20的0. 05mol/L磷酸鹽溶液，其 中牛血清白蛋白的終濃度為體積百分含量0. 05-0. 10%，吐溫-20的終濃度為質(zhì)量百分含 量 0? 05%;
[0026] 微孔試劑：向微孔板的微孔中加入50y1所述小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體-膠體 金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度為_70°C條件下，預(yù)凍4h