專利名稱：一種輔助鑒定抗黃矮病小麥的方法及其專用引物對的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定抗黃矮病小麥的方法及其專用引物對。
背景技術(shù)：
小麥黃矮病是由蚜蟲介導(dǎo)的大麥黃矮病毒(BYDV)引起的小麥主要病毒病，一旦 感染即無藥可治，造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來，由于氣候條件的改變，傳播大麥黃矮病毒的 麥蚜在我國廣泛發(fā)生、日益嚴(yán)重，小麥黃矮病有從山西、甘肅、陜西等主發(fā)區(qū)向江淮和西南 麥區(qū)蔓延擴(kuò)散的趨勢。因此，選育抗黃矮病小麥新品種，是防治該病害的最經(jīng)濟(jì)有效途徑。優(yōu)良可利用的抗病基因是抗病育種的前提。迄今，小麥初級基因庫中尚未發(fā)現(xiàn)真 正有效的抗性基因。然而，小麥近緣植物一中間偃麥草高抗或免疫大麥黃矮病毒的多個 株系，作為重要抗源得到應(yīng)用和深入研究。中間偃麥草至少含有3個抗黃矮病基因，分別 位于第7同源群染色體7Ai#l長臂、7E長臂和第2同源染色體2Ai-2短臂上。科學(xué)家通 過小麥與中間偃麥草遠(yuǎn)緣雜交，育成抗黃矮病的部分雙二倍體TAF46，又以TAF46做橋梁 親本，育成抗黃矮病的二體附加系L1 (附加2條7Ai#l染色體)以及7Ai#lL雙端體附加 系，繼之，以L1為抗源，利用中國春ph突變體誘導(dǎo)部分同源染色體配對和組織培養(yǎng)兩條途 徑，將7Ai#l染色體上的抗黃矮病基因成功地導(dǎo)入小麥，育成一批抗黃矮病易位系，包括 YW642 (HW642)、YW443、YW243 (Xin, Z.，Zhang, Z.，Chen, X.，Lin, Z.，Ma, Y.，Xu, H.，Banks, P.，and Larkin, P. Development and characterization ofcommon wheat-Thinopyrum intermedium translocation lines with resistance tobarley yellow dwarf virus. Euphytica. 2001，119 :161_165 ；張增艷、辛志勇、陳孝等，抗黃矮病小麥新品系YW443的分 子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定，遺傳學(xué)報，2000, 27 (7) 614 620 ；張增艷，辛志勇，抗黃矮病小麥生物 技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜志，2005，5 4-7)，以及TC5-TC10、TC14等(Banks, P.，Larkin， P. , Bariana, H. , Lagudah, E. , Appels, R. , ffaterhouse, P. , Brettell, R. , Chen, X. , Xu, H. , Xin, Z. , Qian, Y. , Zhou, M. , Cheng, Z. , and Zhou, G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38:395-405)?；蚪M原位雜交(GISH)、分子標(biāo)記的快速發(fā)展為鑒定外源染色體、定位外源基因 提供了有力工具。利用GISH、RFLP標(biāo)記等技術(shù)，鑒定出具Bdv2的小麥-中間偃麥草易位系 TC5-TC10、TC14 (Banks，P. , Larkin, P. , Bariana, H. , Lagudah, E. , Appels, R.，Waterhouse， P，，Brettell，R.，Chen，X.，Xu, H，，Xin, Z.，Qian, Y.，Zhou，M.，Cheng，Z.，and Zhou，G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resi stance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38 395~405) 以及 YW642、YW443、YW243(張增艷，辛志勇，馬有志等，Mapping of a BYDV resistance gene from Thintermedium intermedium in wheat background by molecular markers， Sci ence in China (SeriesC)，1999，42 (6) :663_668，張增艷、辛志勇、陳孝等，抗黃矮病小 麥新品系YW443的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定，遺傳學(xué)報，2000，27 (7) 614 620 ；謝皓，陳孝，張增艷，辛志勇，林志珊，杜麗璞，馬有志，徐惠君，抗黃矮病小麥新品系YW243的選育和細(xì)胞 分子生物學(xué)鑒定，作物學(xué)報，2000，26 (6) 687-691 ；Xin, Z.，Zhang, Ζ.，Chen, X.，Lin, Ζ.， Ma, Y. , Xu, H. , Banks, P. , and Larkin, P. Development and characterization of common wheat-Thinopyrum intermedium translocation lines with resistance to barley yellow dwarf virus. Euphytica. 2001,119 :161-165)，發(fā)現(xiàn)攜帶抗黃矮病基因 Bdv2 的中間 偃麥草染色體7Ai#l長臂(7Ai#lL)端部小片段易位到小麥染色體7D長臂端部(張增艷，辛 志勇，馬有志等，Mapping of a BYDV resistancegene from Thintermedium intermedium in wheat background by molecular markers,Science in China (Series C),1999,42 (6) 663-668)。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶抗黃矮病基因Bdw2的小麥-中間偃麥草易位系YW642、YW443、 YW243, TC14等，高抗黃矮病，可以作為小麥抗黃矮病育種的重要抗源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定抗黃矮病小麥的方法及其專用引物對。本發(fā)明提供的輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的方法，包括如下步驟以待測小 麥的基因組DNA為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引 物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到1016bp的DNA片段，待測小麥為候選的攜帶TiSTKl基因的小 麥；如果沒有得到1016bp的DNA片段，待測小麥為候選的不攜帶TiSTKl基因的小麥；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；
4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病 相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮 病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述PCR 擴(kuò)增的程序如下94°C 3min ； 94°C 45s，68°C 35s, 72 °C 45s_lmin30s， 5 個循環(huán)；94 "C 45s, 66 "C 35s, 72 "C 45s_lmin30s，5 個循環(huán)；94 "C 45s, 64 "C 35s, 72°C 45s-lmin30s，25個循環(huán)；72°C IOmin0所述PCR擴(kuò)增的程序具體如下94°C 3min ； 94°C 45s, 68 °C 35s, 72 °C lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s, 66 °C 35s, 72 °C lmin30s，5 個循環(huán)； 94°C 45s，64°C 35s，72°C lmin30s，25 個循環(huán)；72°C IOmin0本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的方法，包括如下步驟以待 測小麥的cDNA為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物 對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到512bp的DNA片段，待測小麥為候選的攜帶TiSTKl基因的小麥； 如果沒有得到512bp的DNA片段，待測小麥為候選的不攜帶TiSTKl基因的小麥；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；
4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病 相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮 病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述PCR 擴(kuò)增的程序如下94 °C 3min ；94 °C 45s_lmin30s，68 °C 35s, 72 °C 45s-lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s, 64 °C 35s, 72 °C 45s-lmin30s, 25 個循環(huán)；72 °C lOmin。所述 PCR 擴(kuò)增程序具體如下 94°C 3min ；94°C 45s，68°C 35s，72°C 45s，5 個循環(huán)；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s，5 個循環(huán)； 94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s, 25 個循環(huán)；72°C lOmin。以上兩種方法中，PCR擴(kuò)增采用的引物對相同，但因為模板分別為基因組DNA或 cDNA，所以擴(kuò)增片段的大小有差異。所述待測小麥具體可為抗黃矮病的二體附加系L1、抗黃矮病的雙端體系7Ai#lL、 抗黃矮病易位系YW642、抗黃矮病易位系YW443、抗黃矮病易位系YW243、抗黃矮病易位系 TC14、中8601、中國春、YW641S、抗黃矮病的小麥-中間偃麥草附加系Z1或PmV。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。所述引物對可用于制備輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的試劑盒；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病 相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮 病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的試劑盒，包括所述引物對；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病 相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮 病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述方法所述引物對或所述試劑盒可用于輔助鑒定抗黃矮病小麥；攜帶TiSTKl 基因的小麥為候選的抗黃矮病小麥；不攜帶TiSTKl基因的小麥為候選的感黃矮病小麥?？?病性鑒定分級采用小麥黃矮病嚴(yán)重度的國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，即IT的標(biāo)準(zhǔn)，0-3為抗黃矮病小麥，6-8為感黃矮病小麥。所述方法，所述引物對或所述試劑盒可用于小麥育種。本發(fā)明的引物對和方法基于源于中間偃麥草的，小麥-中間偃麥草易位系YW642 共有的抗黃矮病重要基因TiSTKl的核苷酸序列(1822bp)。本發(fā)明成功地研發(fā)出抗黃矮病 重要基因TiSTKl的As-PCR標(biāo)記。攜帶TiSTKl基因的小麥為候選的抗黃矮病小麥。應(yīng)用 本發(fā)明的方法，準(zhǔn)確性高，可以實現(xiàn)早期篩選，節(jié)省時間和資源，對于抗黃矮病小麥育種具 有重大意義。


圖1為實施例2的電泳圖。圖2為實施例3的電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。中間偃麥草(Ti)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所資源種質(zhì)庫，編號為 Z1146。中8601 購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。中國春購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。大麥黃矮病病毒(BYDV-GAV株系)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。抗黃矮病易位系YW642(HW642)參考文獻(xiàn)張增艷，馬有志，辛志勇等，1998，應(yīng) 用基因組原位雜交技術(shù)鑒定抗黃矮病小麥新種質(zhì)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，31 (3) 1-4 ；Zhang Z， Xin Z，Ma Y，Chen X，Xu Q，Lin Z. 1999，Mapping of a BYDV resistance gene from Thinopyrum intermedium in wheat background by molecular markers. Sci China C Life Sci.42(6) :663_668.；該易位系是1991年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所辛志勇等 創(chuàng)制，張增艷等1996年鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保證向公眾提供?？裹S矮病易位系YW443 參考文獻(xiàn)張增艷、辛志勇、陳孝等，抗黃矮病小麥新品系 YW443的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定，遺傳學(xué)報，2000，27 (7) :614 620 ；該易位系是1991-1995 年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所辛志勇等創(chuàng)制，張增艷等1998-1999年鑒定出來；中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子育種組有保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保證 向公眾提供?？裹S矮病易位系YW243 參考文獻(xiàn)謝皓，陳孝，張增艷，辛志勇，林志珊，杜麗璞， 馬有志，徐惠君，抗黃矮病小麥新品系YW243的選育和細(xì)胞分子生物學(xué)鑒定，作物學(xué)報， 2000,26(6) 687-691 ；該易位系是1991-1995年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所辛志勇等 創(chuàng)制，謝皓等1998-1999年鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保證向公眾提供。TC14=Banks, P.，Larkin, P.，Bariana, H.，Lagudah, Ε. , Appels, R. , Waterhouse, P. , Brettell, R. , Chen, Χ. , Xu, H. , Xin, Ζ. , Qian, Y. , Zhou, Μ.,
7Cheng,Z. ,and Zhou,G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38 :395_405 ；該易位系是1991-1994年澳大利亞科學(xué)家Banks，Larkin與中 國科學(xué)家辛志勇、陳孝、徐惠君等創(chuàng)制，Banks, Larkin，等1995年鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院作物科學(xué)研究所引進(jìn)、有保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保證向公眾提供?？裹S矮病的二體附加系L1 參考文獻(xiàn):Cauderon, Y.，Saigne，B.，and Dauge， M. (1973)The resistance to wheat rusts of Agropyron intermedium and its use inwheat improvement. Proc Int Wheat Genet Symp Wheat Improvement,Vol. 4,E. R. Sears and L. M. S. Sears eds(Univ of Missouri, Columbia, MD), pp 401-407 ;L1 是 1973 年由法 國科學(xué)家Cauderon等創(chuàng)制；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所引進(jìn)、有保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院作物科學(xué)研究所保證向公眾提供?？裹S矮病的雙端體系7Ai#lL 參考文獻(xiàn)Banks，P.，Larkin, P.，Bariana, H.， Lagudah, E. , Appels, R. , ffaterhouse, P. , Brettell, R. , Chen, X. , Xu, H. , Xin, Z. , Qian, Y. , Zhou, M. , Cheng, Z. , and Zhou, G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38 :395_405 ；該易位系是 1991-1994 年澳大利亞科 學(xué)家Banks，Larkin與中國科學(xué)家辛志勇、陳孝、徐惠君等創(chuàng)制，Banks, Larkin，等1995年 鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所引進(jìn)、有保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究 所保證向公眾提供。YW641S 參考文獻(xiàn)Xiaodong Liu, ZengYan Zhang(通訊作者)，Zhiyong Xin, 2005, Molecular evidence of barley yellow dwarf virus replication/movement suppressed by the resistance gene Bdv2 derived from Th. intermedium, Journal of Genetic and Genomics (Yi Chuan Xue Bao) ,932 942-947 ；
是1996-1998年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所張增艷等選育、鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院作物科學(xué)研究所小麥分子課題組(張增艷研究員)保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究 所保證向公眾提供。PmV 參考文獻(xiàn):Li H, Chen X，Xin Z Y, Ma Y Z, Chen X Y, Jia X. Development and identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL. 6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew. Plant Breeding, 2005,124 :203_205 ; 該系是1997-2001年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所科學(xué)家陳孝、辛志勇等創(chuàng)制，李輝等 鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子課題組有保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物 科學(xué)研究所保證向公眾提供。抗黃矮病的小麥-中間偃麥草附加系Z1 (攜帶Bdv4)參考文獻(xiàn)Bmks，P.， Larkin，P.，Bariana, H.，Lagudah, E.，Appels, R.，Waterhouse, P.，Brettell，R.，Chen， X.，Xu, H.，Xin, Z.，Qian, Y.，Zhou，M.，Cheng，Z.，and Zhou，G. The use of cell culture for sub—chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995，38 :395_405 ；Zhang，Z.Y.，Xin, Z. Y.， and Larkin，P.J.2001. Molecular characterization of a Thinopyrum intermedium group 2chromosome (2Ai_2)conferring resistance to barley yellow dwarf virus.Genome, 44 1129-1135 ；Zl是在小麥基因組中附加了 1對中間偃麥草染色體2Ai_2，后者攜 帶抗黃矮病基因Bdv4，由澳大利亞科學(xué)家Banks，Larkin與中國科學(xué)家辛志勇、陳孝、徐惠 君等于1992-1995年創(chuàng)制、鑒定，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所有保存；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所保證向公眾提供。實施例1、引物對的發(fā)現(xiàn)利用抗黃矮病重要基因(TiSTKl)cDNA序列設(shè)計的一對引物，對抗黃矮病材料 (Ti、YW642)、感黃矮病小麥cDNA的擴(kuò)增序列所獲得的62個STK基因cDNA克隆的序列 測定和比對分析，發(fā)現(xiàn)中間偃麥草中有3個轉(zhuǎn)錄本，其中2個位于易位到抗病小麥的小 麥7D染色體的中間偃麥草7Ai#lL上，其中這個引物對即是易位到抗病小麥中的中間偃 麥草TiSTKl基因序列，另外感病小麥中有很高同源性的序列，并發(fā)現(xiàn)二者在5 ‘非編碼區(qū) 存在2個連續(xù)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)差異，將這2個連續(xù)的堿基差異設(shè)計為上游引物 TISTK1-ASF的3’端，然后利用PRIMER5引物設(shè)計軟件設(shè)計出與上游引物匹配的下游引物 TISTK1-ASR，即本發(fā)明的引物對。用本發(fā)明的引物對進(jìn)行擴(kuò)增，如果得到與序列1中對應(yīng)的 片段，該小麥為抗病材料，因為TiSTKl基因位于含Bdv2的中間偃麥草染色體7Ai#lL上，這 段染色體與小麥的難以交換，因此只要攜帶Bdv2的抗病小麥易位系、中間偃麥草、抗病小 麥雜交材料均可以擴(kuò)增出該特異帶，而感病小麥和攜帶PmV的抗白粉病小麥均不能擴(kuò)增。TISTKI-ASF :5，-CGCTCCCCTCCTTCCCCTTC-3，(序列 3)；TISTKI-ASR :5，-TGAGTATCTCCGTCGGATGAGTTGG-3，(序列 4)。實施例2、應(yīng)用引物對輔助鑒定抗黃矮病小麥應(yīng)用實施例1設(shè)計的引物對(由TISTK1-ASF和TISTK1-ASR組成的引物對)檢測 如下樣本抗黃矮病的中間偃麥草(Ti)；抗黃矮病的二體附加系Ll ；抗黃矮病的雙端體系 7Ai#lL ；抗黃矮病易位系YW642 (HW642)、YW443和YW243，以上抗黃矮病材料均攜帶TiSTKl 基因；中8601 (感黃矮病小麥)；中國春(CS ；感黃矮病小麥)；YW641S(YW642的感病姊妹 系)。一、抗病性鑒定分別種植上述生物材料(每份材料種植60株)，在苗期接種黃矮病病毒 (BYDV-GAV株系)的蚜蟲。鑷取攜帶BYDV-GAV的蚜蟲置于小麥或中間偃麥草的植株上，每 株約10只蚜蟲，接種30-40天后調(diào)查上述生物材料對黃矮病抗性?？共⌒澡b定分級采用小麥黃矮病嚴(yán)重度的國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，即IT的標(biāo)準(zhǔn)，見表1，參考文 獻(xiàn)“李光博，曾士邁，李振歧主編.小麥病蟲草鼠害綜合治理[M].北京中國農(nóng)業(yè)科技出 版社，1990”。表1小麥黃矮病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果表明Ti、Ll、7Ai#lL、YW642(HW642)、YW443 和 YW243 對 BYDV-GAV 株系侵染表 現(xiàn)高抗，它們對小麥黃矮病嚴(yán)重度為0，即都為健株；小麥品系中8601沖國春(CS)、YW641S 對小麥BYDV-GAV株系侵染表現(xiàn)感病，其黃矮病嚴(yán)重度為6-8級。二、應(yīng)用引物對輔助鑒定1、提取各個生物材料葉片的基因組DNA(gDNA)。2、以基因組DNA為模板，用TISTK1-ASF和TISTK1-ASF TISTK1-ASR組成的引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增體系ddH2017. 3ii 1，10XPCR Buffer 2. 5 u l,25mM MgCl2l. 5u 1, 2. 5mMdNTP mix 1. 5u 1, TISTK1-ASF (10 u M) 0. 5 u 1，TISTK1-ASR(10 u M) 0. 5 u 1, lOOng/uL gDNA 1 u 1, rTaq(5U/u 1)0. 2uPCR 擴(kuò)增程序:94°C 3min ；94°C 45s，68°C 35s, 72°C lmin30s, 5 個循環(huán)；94°C 45s, 66 °C 35s, 72 °C lmin30s，5 個循環(huán)；94 °C 45s, 64 °C 35s, 72 °C lmin30s，25 個循環(huán)； 72°C lOmin。3、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果見圖1。中間偃麥草、抗黃矮病的二體附加系L1、抗黃矮病的雙端體系7Ai#lL 以及抗黃矮病易位系的小麥材料中均可以擴(kuò)增出一條抗病特異帶(1016bp)；沒有攜帶 TiSTKl基因的感病小麥材料不能擴(kuò)增出該特異帶。4、分別將各個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序中間偃麥草、抗黃矮病的二體附加系L1、抗黃矮病的雙端體系7Ai#lL以及抗黃矮 病易位系的小麥材料中均可以擴(kuò)增出一條抗病特異帶(1016bp)，且該特異帶的序列均如序 列表的序列1自5，末端第52-1067位核苷酸所示(序列1所示DNA為TiSTKl基因的基因 組序列)。說明該擴(kuò)增帶可以作為該TiSTKl基因特異的PCR標(biāo)記。三、抗病性與TiSTKl基因的跟蹤對有特異擴(kuò)增帶的抗病株的下一代植株的抗病性進(jìn)行跟蹤。結(jié)果表明，利用該發(fā)明的TISTK1-ASF與TISTK1-ASR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凡是基因組DNA能夠擴(kuò)增出1016bp的 特異序列的待測植株均為含TiSTKl抗病單株。因此，利用本發(fā)明的引物對，根據(jù)該特異性 條帶，可以鑒定出測試植株中抗黃矮病重要基因TiSTKl的有無，輔助選擇抗黃矮病單株， 用于輔助選育抗黃矮病小麥新品系(種)；另外，利用該發(fā)明的TiSTKl特異的功能標(biāo)記輔 助選擇，無需每代都進(jìn)行人工接種、進(jìn)行抗病鑒定，有利于開展育種加代、實現(xiàn)一年2-3代 的育種程序，縮短抗黃矮病小麥育種的周期，加快育種進(jìn)程。實施例3、應(yīng)用引物對輔助鑒定抗黃矮病小麥應(yīng)用實施例1設(shè)計的引物對(由TISTK1-ASF和TISTK1-ASR組成的引物對)檢測 如下樣本抗黃矮病的二體附加系L1 ；抗黃矮病的雙端體系7Ai#lL;抗黃矮病易位系 YW642 (HW642)、YW443、YW243和TC14 ；中8601 (感黃矮病小麥)；抗黃矮病的小麥_中間偃 麥草附加系Z1 (攜帶Bdv4 ；抗黃矮病)、PmV (攜帶PmV ；抗白粉??；感黃矮病)。一、抗病性鑒定方法同實施例2的步驟一。結(jié)果表明Ll、7Ai#lL、YW6420W642)、YW443、YW243、TC14*Z1 對 BYDV-GAV 株系 侵染表現(xiàn)高抗，它們對小麥黃矮病嚴(yán)重度為0，即都為健株；中8601和PmV對小麥BYDV-GAV 株系侵染表現(xiàn)感病，其黃矮病嚴(yán)重度為6-8級。二、應(yīng)用引物對輔助鑒定1、提取各個生物材料葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以cDNA為模板，用TISTK1-ASF和TISTK1-ASR組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增體系ddH20 17. 3u 1,10XPCR Buffer 2. 5 u l,25mM MgCl2 1. 5u 1, 2. 5mMdNTP mix 1. 5 u 1, TISTK1-ASF (10 u M)0. 5 u 1, TISTK1-ASR (10 u M)0. 5 u 1, cDNAl u 1，rTaq (5U/ ii 1) 0. 2 ii 1。PCR 擴(kuò)增程序94 °C 3min ；94 °C 45s, 68 °C 35s, 72 °C 45s，5 個循環(huán)；94 °C 45s, 66°C 35s，72°C 45s，5 個循環(huán)；94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s, 25 個循環(huán)；72°C lOmin。同時，以保守的小麥看家基因(18SrRNA，F(xiàn) :5，-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3，，R 5，-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3，)作為內(nèi)標(biāo)基因使樣品間總cDNA濃度保持一致。3、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果見圖2。Ll、7Ai#lL、YW642 (HW642)、YW443、YW243 和 TC14 均擴(kuò)增得到 512bp 的特異條帶，Z1、中8601和PmV沒有得到該條帶。4、分別將各個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序抗黃矮病的二體附加系L1、抗黃矮病的雙端體系7Ai#lL以及抗黃矮病易位系的 小麥材料中均可以擴(kuò)增出一條抗病特異帶(512bp)，且該特異帶的序列均如序列表的序列 2自5，末端第53-564位核苷酸所示(序列2所示DNA為TiSTKl基因的cDNA序列)。TiSTKl基因僅在攜帶Bdv2基因的抗黃矮病的二體附加系L1、抗黃矮病的雙端體 系7Ai#lL以及抗黃矮病易位系中表達(dá)；在沒有攜帶TiSTKl基因的感黃矮病小麥材料、抗黃 矮病的Z1和抗白粉病的PmV(攜帶PmV)中均不表達(dá)。說明TiSTKl是攜帶Bdv2的抗黃矮 病材料特異表達(dá)的基因。上述結(jié)果進(jìn)一步證明本發(fā)明的引物對(As-PCR標(biāo)記)可以輔助選
11擇抗黃矮病基因TiSTKl與Bdv2，從而輔助鑒定和選擇抗黃矮病小麥材料。
權(quán)利要求
一種輔助鑒定攜帶TiSTK1基因的小麥的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到1016bp的DNA片段，待測小麥為候選的攜帶TiSTK1基因的小麥；如果沒有得到1016bp的DNA片段，待測小麥為候選的不攜帶TiSTK1基因的小麥；所述TiSTK1基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的程序如下94°C3min ； 94°C 45s，68°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s_lmin30s，25 個循環(huán)；72°C lOmin。
3.一種輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的方法，包括如下步驟以待測小麥的cDNA 為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；如果得到512bp的DNA片段，待測小麥為候選的攜帶TiSTKl基因的小麥；如果沒有得到 512bp的DNA片段，待測小麥為候選的不攜帶TiSTKl基因的小麥；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病相關(guān) 蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮病抗 性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的程序如下94°C3min； 94°C 45s，68°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 個循環(huán)；94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s_lmin30s，25 個循環(huán)；72°C lOmin。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述待測小麥為抗黃矮病的二 體附加系L1、抗黃矮病的雙端體系7Ai#lL、抗黃矮病易位系YW642、抗黃矮病易位系YW443、 抗黃矮病易位系YW243、抗黃矮病易位系TC14、中8601、中國春、YW641S、抗黃矮病的小 麥_中間偃麥草附加系Z1或PmV。
6.序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。
7.權(quán)利要求6所述引物對在制備輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的試劑盒中的應(yīng)用；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病相關(guān) 蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮病抗 性相關(guān)蛋白的DNA分子。
8.一種輔助鑒定攜帶TiSTKl基因的小麥的試劑盒，包括權(quán)利要求6所述引物對；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗黃矮病相關(guān) 蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物黃矮病抗 性相關(guān)蛋白的DNA分子。
9.權(quán)利要求1至6中任一所述方法，權(quán)利要求6所述引物對或權(quán)利要求8所述試劑盒 在輔助鑒定抗黃矮病小麥中的應(yīng)用；攜帶TiSTKl基因的小麥為候選的抗黃矮病小麥，不攜 帶TiSTKl基因的小麥為候選的感黃矮病小麥。
10.權(quán)利要求1至5中任一所述方法，權(quán)利要求6所述引物對或權(quán)利要求8所述試劑盒 在小麥育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定抗黃矮病小麥的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA(或cDNA)為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到1016bp(或512bp)的DNA(或cDNA)片段，測試小麥即為候選的攜帶TiSTK1基因的抗黃矮病小麥；如果沒有得到1016bp(或512bp)的PCR擴(kuò)增片段，測試小麥為候選的不攜帶TiSTK1基因的感黃矮病小麥。應(yīng)用本發(fā)明的方法，準(zhǔn)確性高，可以實現(xiàn)早期篩選，節(jié)省時間和資源，對于抗黃矮病小麥育種具有重大意義。
文檔編號C12N15/11GK101892315SQ201010226688
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者張增艷, 辛志勇, 陳亮, 高蘭英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所