專利名稱：黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護領(lǐng)域檢測用的標(biāo)準分子，特別是涉及一種黑麥草腥黑粉菌檢測用標(biāo)準分子及其制備方法。
背景技術(shù)：
黑麥草腥黑粉菌(Tilletia walkeri Castebury&Carris)是一種與小麥印度腥黑穗病菌在形態(tài)特征上極為相似的真菌，主要為害黑麥草。該菌分布于美國、澳大利亞、新西蘭、加拿大、丹麥、荷蘭、日本、西班牙等地，我國尚未有報道。黑麥草腥黑粉菌于1996年在美國農(nóng)業(yè)部展開的對小麥印度腥黑穗病菌的大普查中于美國俄勒R州和東南部諸州的小麥種子洗滌液中首次發(fā)現(xiàn)，1999年Castlebury等根據(jù)其在形態(tài)特征上及生物學(xué)上與小麥印度腥黑穗病菌的微弱差別進行鑒定，并將其命名。該菌與小麥印度腥黑穗病菌形態(tài)學(xué)特征和分子學(xué)特征都十分相似，并且在實驗室人工接種條件下可侵染小麥(Mathre et al, 2000)。黑麥草腥黑粉菌與小麥印度腥黑穗病菌冬孢子在大小和顏色上較為接近，只是前者的孢子外壁紋飾比較粗，孢壁具有腦紋結(jié)構(gòu)(Castlebury etal.，1997)。章桂明等對小麥印度腥黑穗病菌及其近似種的冬孢子的形態(tài)特征在掃描電鏡下進行了比較，認為兩者形態(tài)學(xué)特征非常接近，只獲得少量孢子的情況下難以從形態(tài)學(xué)方面將兩菌進行區(qū)別，需要較多的孢子綜合分析才能得出結(jié)論(章桂明，1999)。在分子生物學(xué)方面，Larocthe等應(yīng)用AFLP方法來區(qū)別小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草腥黑粉菌，建立了區(qū)別小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草腥黑粉菌的AFLP方法(Larocthe et al.，1997)。Pimentel等利用RAPD和PCR-RFLP的分析方法研究了黑麥草腥黑粉菌及其近似種，結(jié)果表明黑麥草腥黑粉菌的特有酶切位點是Sca I，它與小麥印度腥黑穗病菌之間的相似性達到85% ；而RAPD方法的研究結(jié)果則顯示當(dāng)軟件的支持率為100%時，這兩種菌之間僅有25%的相似性(Pimentel et al.，1998)。McDonald等利用r印-PCR基因指紋技術(shù)對黑麥草腥黑粉菌及其近似種的基因組DNA進行了分析，得到其基因組指紋圖譜，通過 GeCompar (4. 0)軟件分析成功的將黑麥草腥黑粉菌和小麥印度腥黑穗病菌及其它近似種和相關(guān)種區(qū)分開(McDonald et al.，2000)。上述檢測方法由于對實驗操作要求比較高，而且重復(fù)性差，在實際操作中難以推廣應(yīng)用。因此Frederick等在Ferreira研究的基礎(chǔ)上進一步分析了小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草腥黑粉菌2. 3kb的線粒體DNA，并設(shè)計了擴增擴增黑麥草腥黑粉病菌的3對特異性引物，建立了黑麥草腥黑粉病菌常規(guī)PCR檢測方法和實時熒光PCR檢測方法(Frederick et al.，2000)。程穎慧等對2. 3kb的線粒體序列分析，分別設(shè)計了擴增小麥印度腥黑穗病菌的4對特異性引物和擴增黑麥草腥黑粉菌的2對特異性引物，對ITS序列進行分析設(shè)計了擴增所有供試材料的通用引物，建立了兩種菌的常規(guī)PCR檢測方法、雙重PCR的檢測技術(shù)、單孢PCR的檢測方法、實時單色熒光PCR檢測方法以及小麥印度腥黑穗病菌的實時雙色熒光PCR檢測方法(程穎慧等，2002)；易建平等對ITS序列進行分析設(shè)計了擴增所有供試材料的通用引物，利用套式PCR檢測方法對冬孢子進行檢測，
3建立了黑麥草腥黑粉菌的套式PCR檢測方法(易建平等，2003)。章桂明等Q005)對黑麥草腥黑粉菌和小麥印度腥黑穗病菌分子檢測方法進行研究，并在上述基礎(chǔ)上制定了黑麥草腥黑粉菌實時熒光PCR檢測方法國家標(biāo)準。 分子生物學(xué)檢測方法在實際檢測過程中需要陽性參考物質(zhì)作為對照，用以實驗結(jié)果的分析和判定，確保實驗結(jié)果的可靠性?，F(xiàn)階段黑麥草腥黑粉菌分子檢測所用的陽性參考物質(zhì)通常是其基因組DNA。但基因組DNA獲取過程較復(fù)雜，制備非常不方便，其穩(wěn)定性也尚不能滿足長期及經(jīng)常性使用的需要，并且由于不同檢測實驗室間使用的基因組DNA來源不同，提取質(zhì)量存在差異，使得不同實驗室的檢測結(jié)果缺乏可比性和重復(fù)性，從而制約了黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準及其它分子檢測方法的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備簡便、特異性強、具有良好均勻性和穩(wěn)定性的黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子。本發(fā)明的另一目的在于提供上述標(biāo)準分子的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述標(biāo)準分子的檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子，所述標(biāo)準分子為能夠進行復(fù)制的質(zhì)粒，且所述質(zhì)粒含有以下序列A和序列B中的至少一種，所述序列A與Genebank中編號為AF218061的序列99. 65%同源；所述序列B與Genebank中編號為AF399887的序列100%同源。在本發(fā)明具體的實施方式中，所述序列A為kq ID No. 1所示的序列，所述序列B Skq ID No. 2所示的序列。所述質(zhì)粒優(yōu)選為T載體，更優(yōu)選為pMD19-T。本發(fā)明還公開了上述黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子的制備方法，所述方法包括 以黑麥草腥黑粉菌DNA為模板進行PCR擴增，所述PCR擴增的引物包括下述引物對a和引物對b中的至少一對，將擴增得到的DNA序列轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，引物對a:Seq ID No. 3 5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘Seq ID No. 4 5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘引物對b:Seq ID No. 5 5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘Seq ID No. 6 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。在本發(fā)明具體的實施方式中，是采用所述引物對a和引物對b分別進行PCR擴增， 將引物對a擴增得到的片段與pMD19-T載體進行連接，將連接后得到的重組子以及引物對b 擴增得到的片段分別用限制性內(nèi)切酶)(bal和KpnI進行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物的大片段，將回收的片段進行連接。本發(fā)明還公開了上述黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子的檢測方法，所述方法包括， 利用特異性檢測引物和探針，以所述標(biāo)準分子為模板進行實時熒光PCR反應(yīng)，并且所述探針5'端和3'端分別標(biāo)記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。
所述特異性檢測引物分別含有kq ID No. 7和kq ID No. 8所示的序列，探針含有kq ID No. 9所示的序列Seq ID No. 7 5' -CTCGAGCCACTCCGTTGG-3‘Seq ID No. 8 5' -GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3‘Seq ID No. 9 5' -TACTCTTCATTGCCCTCA-3‘由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于利用本發(fā)明的方法制備得到的黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子，具有可以長期穩(wěn)定保存、高拷貝數(shù)、易獲得、純度高和制備方便等特點，并且制備簡便、特異性強、具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，可以替代黑麥草腥黑粉菌的基因組DNA用于黑麥草腥黑粉菌的定性PCR、 定量PCR檢測及分析，解決了黑麥草腥黑粉菌檢測中標(biāo)準分子缺乏的難題。該標(biāo)準分子適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用。


圖1為本發(fā)明所述標(biāo)準分子示意圖。圖2為以引物MP3-1、MP3-2和探針MPb3對本發(fā)明所述標(biāo)準分子以及黑麥草腥黑粉菌基因組DNA的實時熒光PCR特異性檢測結(jié)果圖。圖3為以引物MP3-1、MP3-2和探針MPb3對本發(fā)明所述標(biāo)準分子的實時熒光PCR
靈敏度檢測結(jié)果圖。圖4為以引物MP3-1、MP3-2和探針MPb3對本發(fā)明所述標(biāo)準分子的實時熒光PCR 擴增標(biāo)準曲線。圖5為本發(fā)明所述標(biāo)準分子測序結(jié)果與網(wǎng)上公布的黑麥草腥黑粉菌及其近似種線粒體2. 3kb序列比對結(jié)果。圖6為本發(fā)明所述標(biāo)準分子測序結(jié)果與網(wǎng)上公布的黑麥草腥黑粉菌ITS序列比對結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子的構(gòu)建一、實驗試劑1、供試菌株小麥印度腥黑穗病菌截獲來自巴西、印度和墨西哥小麥，黑麥草腥黑粉菌截獲自美國小麥，上述供試菌株均由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)研究中心保存 (表 1)。表1供試菌株
權(quán)利要求
1.一種黑麥草腥黑粉菌檢測的標(biāo)準分子，其特征在于所述標(biāo)準分子為能夠進行復(fù)制的質(zhì)粒，且所述質(zhì)粒含有以下序列A和序列B中的至少一種，所述序列A為kq ID No. 1所示序列；所述序列B為kq ID No. 2所示序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準分子，其特征在于所述序列A為kqlDNo. 1所示序列與Genebank中編號為AF218061的黑麥草腥黑粉菌2. 3kb序列99. 65%同源；所述序列B為 Seq ID No. 2所示序列與編號為AF399887的黑麥草腥黑粉菌ITS序列100%同源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 2任意一項所述的標(biāo)準分子，其特征在于所述質(zhì)粒為T載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的標(biāo)準分子，其特征在于所述T載體為pMD19-T。
5.權(quán)利要求1 4任意一項所述的黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子的制備方法，所述方法包括以黑麥草腥黑粉菌DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增，所述PCR擴增的弓|物包括下述弓| 物對a和引物對b中的至少一對，將擴增得到的DNA序列轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，引物對a:Seq ID No. 3:5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘Seq ID No. 4:5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘引物對b :Seq ID No. 5:5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘Seq ID No. 6 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于采用所述引物對a和引物對b分別進行PCR擴增，將引物對a擴增得到的片段與PMD19-T載體進行連接，將連接后得到的重組子以及引物對b擴增得到的片段分別用限制性內(nèi)切酶^CbaI和KpnI進行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物的大片段，將回收的片段進行連接。
7.權(quán)利要求1 4任意一項所述的黑麥草腥黑粉菌檢測標(biāo)準分子的檢測方法，所述方法包括，利用特異性檢測引物和探針，以所述標(biāo)準分子為模板進行實時熒光PCR反應(yīng)，并且所述探針5'端和3'端分別標(biāo)記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。所述特異性檢測引物分別含有^^ ID似.7和％(1 ID No. 8所示的序列，探針含有％(1 ID No. 9所示的序列SeqIDNo. 75'-CTCGAGCCACTCCGTTGG-3‘SeqIDNo. 85'-GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3SeqIDNo. 95'-TACTCTTCATTGCCCTCA-3‘
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑麥草腥黑粉菌檢測的標(biāo)準分子，為能夠進行復(fù)制的質(zhì)粒，且所述質(zhì)粒中含有序列A(Seq ID No.1)和序列B(Seq ID No.2)中的至少一種。序列A與黑麥草腥黑粉菌線粒體DNA一段2.3kb的核酸序列同源性為99.65％，B與黑麥草腥黑粉菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列同源性為100％。本發(fā)明還公開了上述標(biāo)準分子的制備方法和檢測方法。本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準分子可以代替黑麥草腥黑粉菌DNA作為黑麥草腥黑粉菌分子檢測的陽性對照，該標(biāo)準分子適用于對黑麥草腥黑粉菌的定性PCR和定量PCR檢測。該標(biāo)準分子適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用。
文檔編號C12Q1/68GK102212611SQ20101014903
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者向才玉, 李小焦, 王穎, 程穎慧, 章桂明, 陳枝楠 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心, 深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院