染料的光敏化化學(xué)漂白的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供包括使用光敏化化學(xué)漂白以在生物樣品中檢測(cè)多靶標(biāo)的方法。所述方法包括提供包含多靶標(biāo)的生物樣品，使至少一個(gè)探針結(jié)合存在于樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)，和觀測(cè)來(lái)自探針的信號(hào)的步驟。所述方法還包括使包含結(jié)合的探針的樣品與電子轉(zhuǎn)移試劑接觸并照射樣品，由此啟動(dòng)通過(guò)光敏化化學(xué)漂白基本上滅活探針的光反應(yīng)的步驟。所述方法還包括使至少一個(gè)探針結(jié)合存在于樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)，并觀測(cè)來(lái)自探針的信號(hào)的步驟。結(jié)合、觀測(cè)和漂白的過(guò)程可以反復(fù)重復(fù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】染料的光敏化化學(xué)漂白
[0001] 背景 多種方法可用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中，以觀測(cè)生物樣品中的不同靶標(biāo)。例如，組織切片和其 它細(xì)胞學(xué)制品中的蛋白質(zhì)分析可使用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)（IHC)或免疫熒光的技術(shù)進(jìn) 行。生物樣品的蛋白質(zhì)分析還可使用固態(tài)免疫測(cè)定法例如使用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)或使用可例 如通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的基于細(xì)胞的測(cè)定法進(jìn)行。
[0002] 許多現(xiàn)有技術(shù)一次僅可檢測(cè)單一樣品中的幾個(gè)靶標(biāo)（例如IHC或基于熒光的蛋白 質(zhì)印跡，其中可檢測(cè)的靶標(biāo)數(shù)量受到基于熒光的檢測(cè)系統(tǒng)的限制）。靶標(biāo)的進(jìn)一步分析可需 要使用來(lái)自所述來(lái)源的額外生物樣品，這限制了測(cè)定靶標(biāo)的相對(duì)特征（例如生物樣品中多 個(gè)生物靶標(biāo)的存在、不存在、濃度和/或空間分布）的能力。此外，在某些情況下，可能可獲 得有限量的樣品以供分析之用或所述單個(gè)樣品可能需要進(jìn)一步的分析。
[0003] 重復(fù)分析單個(gè)樣品的方法描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 629, 125和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 741，046 中。特別地，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 741，046提供檢測(cè)生物樣品中的多靶標(biāo)的方法，其包括使用氧化 以滅活信號(hào)發(fā)生器（例如，漂白熒光染料）。氧化反應(yīng)通過(guò)使用氧化劑例如過(guò)氧化氫完成。
[0004] 此外，通過(guò)使信號(hào)發(fā)生器連續(xù)曝光于照射，即通過(guò)光漂白，可滅活信號(hào)。類(lèi)似于通 過(guò)氧化的信號(hào)滅活，這個(gè)過(guò)程可能是漫長(zhǎng)的，并且可能不進(jìn)行至完成，導(dǎo)致信噪比減少。此 夕卜，使樣品連續(xù)曝光于照射可損害生物樣品。因此，仍存在用于連續(xù)分析生物學(xué)靶標(biāo)的更 快、更溫和和更靈敏的方法的需求。
[0005] 簡(jiǎn)述 本文公開(kāi)新的用于高通量多路復(fù)用樣品分析的方法。所述方法采用，例如信號(hào)循環(huán)過(guò) 程，其中在各個(gè)循環(huán)中，光反應(yīng)步驟允許相同的信號(hào)發(fā)生器例如熒光團(tuán)重復(fù)用于隨后的循 環(huán)中以檢測(cè)另外的標(biāo)記物，例如蛋白質(zhì)。可采用這些方法，例如用于連續(xù)地分析生物樣品， 以尤其辨別生物樣品中多個(gè)生物靶標(biāo)的存在、不存在、濃度和/或空間分布。光反應(yīng)步驟可 包括應(yīng)用電子轉(zhuǎn)移試劑，例如硼酸鹽，并啟動(dòng)光反應(yīng)，例如，通過(guò)用可見(jiàn)光照射樣品，以滅活 信號(hào)發(fā)生器，例如，熒光染料。
[0006] 在一些實(shí)施方案中，所公開(kāi)方法的優(yōu)點(diǎn)可包括在各個(gè)循環(huán)中迅速破壞信號(hào)。例如， 在一些例子中，與常規(guī)方法中超過(guò)15分鐘相比，在約20秒內(nèi)觀測(cè)到猝滅。在一些實(shí)施方 案中，所公開(kāi)的方法還可表征為甚至在例如導(dǎo)致信噪比增加的高表達(dá)靶標(biāo)中缺乏殘留的熒 光。此外，所公開(kāi)的方法不損害生物樣品或其成分，例如，抗原決定部位，以致相同的樣品可 以在許多循環(huán)中使用。同樣，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與熒光染料的直接光漂白作用比較時(shí)， 所公開(kāi)的方法是有利的，因?yàn)樗鼈儾恍枰蓳p害生物樣品成分的高功率光。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種探測(cè)生物樣品中的多靶標(biāo)的方法，其包括： (a) 使至少一個(gè)探針結(jié)合存在于包含多靶標(biāo)的生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)； (b) 觀測(cè)來(lái)自步驟（a)中結(jié)合的至少一個(gè)探針的信號(hào)； (c) 使包含步驟（a)的結(jié)合探針的樣品與電子轉(zhuǎn)移試劑接觸； (d) 照射步驟（c)的樣品； (e) 使至少一個(gè)探針結(jié)合存在于步驟（d)的樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)；和 (f)觀測(cè)來(lái)自步驟（e)的結(jié)合探針的信號(hào)。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，步驟（a)中的探針包含光信號(hào)發(fā)生器，和步驟（b)中觀測(cè)到的 信號(hào)是光信號(hào)。在另外的實(shí)施方案中，光信號(hào)發(fā)生器是熒光信號(hào)發(fā)生器，和在步驟（b)中觀 測(cè)到的光信號(hào)是熒光信號(hào)。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，步驟（a)包括使一個(gè)以上的探針結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，照射步驟（d)中的樣品在緩沖劑的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施 方案中，照射在pH 5-9下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，照射在pH 6-8下進(jìn)行。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，照射步驟（d)中的樣品在4-50°C的溫度下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，照射樣品在20-30°C的溫度下進(jìn)行。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，照射步驟（d)中的樣品通過(guò)使樣品暴露于350 nm -1. 3 μΜ 波長(zhǎng)的光來(lái)完成。在一些實(shí)施方案中，照射樣品通過(guò)使樣品暴露于400-700 nm波長(zhǎng)的光來(lái) 完成。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，電子轉(zhuǎn)移試劑是硼酸鹽。在一些實(shí)施方案中，硼酸鹽由以下結(jié) 構(gòu)式表示：
【權(quán)利要求】
1. 一種探測(cè)生物樣品中的多靶標(biāo)的方法，其包括： (a) 使至少一個(gè)探針結(jié)合存在于包含多靶標(biāo)的生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)； (b) 觀測(cè)來(lái)自步驟（a)中結(jié)合的至少一個(gè)探針的信號(hào)； (c) 使包含步驟（a)的結(jié)合探針的樣品與電子轉(zhuǎn)移試劑接觸； (d) 照射步驟（c)的樣品； (e) 使至少一個(gè)探針結(jié)合存在于步驟（d)的樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)；和 (f) 觀測(cè)來(lái)自步驟（e)中結(jié)合的探針的信號(hào)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（a)的探針包含光信號(hào)發(fā)生器，和步驟（b)中觀測(cè)到的 信號(hào)是光信號(hào)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟（a)的探針包含熒光信號(hào)發(fā)生器，和步驟（b)中觀測(cè)到 的信號(hào)是突光信號(hào)。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（d)中照射樣品在pH 5-9的緩沖劑的存在下進(jìn)行。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（c)和（d)在4-50°C的溫度下進(jìn)行。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（d)中照射樣品通過(guò)使樣品暴露于350 nm - 1.3 μΜ 波長(zhǎng)的光而完成。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中步驟（d)中照射樣品通過(guò)使樣品暴露于400-700 nm波長(zhǎng)的 光而完成。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中電子轉(zhuǎn)移試劑是由以下結(jié)構(gòu)式表示的硼酸鹽：
其中： Ri、R2和R3各自獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、烯基、炔基、 芳基或雜芳基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代：(C1_C4)烷基、（C1-C4)烷氧 基、（C1-C4)烷基氨基、氨基、羥基、氰基、鹵素或硝基， R4是烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取 代基取代：(C1_C4)烷基、（C1-C4)烷氧基、（C1-C4)烷基氨基、氨基、羥基、氰基、鹵素或硝 基，和 M+選自有機(jī)和無(wú)機(jī)陽(yáng)離子。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中Ri、R2和R3各自是任選取代的芳基和R4是任選取代的烷基。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中Ri、R2和R3各自為未取代的苯基和R4為未取代的丁基，和 硼酸鹽為三苯基丁基硼酸鹽。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中M+是選自Li+、Na+或K+的無(wú)機(jī)陽(yáng)離子。
12. 權(quán)利要求3的方法，其中熒光信號(hào)發(fā)生器包含花青染料。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中花青染料是Cy3或Cy5。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（c)-(f)重復(fù)一次或多次。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（c)和（d)進(jìn)行約20秒至約15分鐘。
16. 權(quán)利要求1的方法，其還包括測(cè)量在觀測(cè)步驟（b)、步驟（f)或步驟（b)和（f)中 觀測(cè)到的信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)強(qiáng)度值。
17. 權(quán)利要求16的方法，其還包括使強(qiáng)度值與存在于樣品中的靶標(biāo)的數(shù)量相關(guān)。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（a)的探針和步驟（e)的探針各自包含信號(hào)發(fā)生器， 其中步驟（a)中的信號(hào)發(fā)生器不同于步驟（e)中的信號(hào)發(fā)生器。
19. 一種探測(cè)生物樣品中的多靶標(biāo)的方法，其包括： (a) 使多個(gè)探針結(jié)合存在于生物樣品中的多靶標(biāo)，其中多個(gè)探針包括第一組探針和第 二組探針； (b) 觀測(cè)來(lái)自步驟（a)中結(jié)合的第一組探針的第一組信號(hào)； (c) 使包含步驟（a)的結(jié)合探針的樣品與電子轉(zhuǎn)移試劑接觸； (d) 照射步驟（c)的樣品； (e) 自步驟（a)中結(jié)合的第二組探針生成第二組信號(hào)； (f) 觀測(cè)第二組信號(hào)。
20. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（d)中樣品的照射啟動(dòng)通過(guò)光敏化化學(xué)漂白基本上滅 活信號(hào)發(fā)生器的光反應(yīng)。
21. 權(quán)利要求1的方法，其中信號(hào)發(fā)生器被不可逆地改變。
22. 權(quán)利要求1的方法，其中在步驟（d)之后未觀測(cè)到可檢測(cè)的信號(hào)。
23. -種高通量多路復(fù)用生物樣品分析方法，該方法包括： 信號(hào)循環(huán)過(guò)程，其中在各個(gè)循環(huán)中，染色和成像之后是應(yīng)用電子轉(zhuǎn)移試劑和照射生物 樣品。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述方法允許快速信號(hào)循環(huán)而不顯著改變不同于探針的 生物樣品的成分。
25. -系列描繪光學(xué)標(biāo)記的生物靶標(biāo)的至少兩個(gè)圖像，其中： 在探測(cè)生物樣品的多靶標(biāo)的過(guò)程中獲得圖像，其中所述過(guò)程包括： (a) 使至少一個(gè)光學(xué)探針與存在于包含多靶標(biāo)的生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)結(jié) 合； (b) 觀測(cè)來(lái)自步驟（a)中結(jié)合的光學(xué)探針的信號(hào)； (c) 使包含步驟（a)的結(jié)合的光學(xué)探針的樣品與電子轉(zhuǎn)移試劑接觸； (d) 照射步驟（c)的樣品； (e) 使至少一個(gè)光學(xué)探針與存在于步驟（d)的樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合；和 (f) 觀測(cè)來(lái)自步驟（e)中結(jié)合的光學(xué)探針的信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK104114713SQ201280070449
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月23日
【發(fā)明者】A.納塔拉簡(jiǎn), A.蘇德, L.S.卡努馬勒, 陳國(guó)邦 申請(qǐng)人:通用電氣公司