專利名稱：一種高親和力的CTLA4-Ig融合蛋白突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程產(chǎn)品領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種具有高親和力的 CTLA4-Ig融合蛋白突變體和其在制備治療免疫排斥反應(yīng)或者自身免疫性疾病藥物中的用 途。
背景技術(shù)：
CTLA-4，即細(xì)胞毒 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4 (Cytotoxic T Lymphocyte associate Antigen-4，又稱⑶15 ，是表達(dá)在活化T細(xì)胞表面的標(biāo)志性分子之一。研究表明，該分子是 維持體內(nèi)T細(xì)胞穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控因子，具有抑制活化T細(xì)胞增值的功能，與CD^構(gòu)成了一 對(duì)十分重要的免疫調(diào)節(jié)因子。目前，它被作為免疫抑制受體進(jìn)行了廣泛的研究，在臨床上有 可能作為抑制免疫排斥反應(yīng)的制劑進(jìn)行應(yīng)用。
T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞表面參與產(chǎn)生共刺激作用的分子統(tǒng)稱為共刺激分子。目前 公認(rèn)最重要的共刺激通道為共刺激通路。B7位于抗原提呈細(xì)胞，與T細(xì)胞表面的 CD28分子結(jié)合可以產(chǎn)生共刺激。當(dāng)T細(xì)胞激活后，其細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)另外一種可以與B7細(xì) 胞結(jié)合的分子CTLA-4。CTLA-4與B7的親和力很高，該分子與B7細(xì)胞結(jié)合后可以誘導(dǎo)B7 細(xì)胞的調(diào)亡。因此目前認(rèn)為它對(duì)T細(xì)胞激活有負(fù)調(diào)節(jié)作用，對(duì)于維持人體內(nèi)免疫狀態(tài)的平 衡起重要作用。
CTLA-4是一種極性跨膜蛋白。將這種蛋白的膜外可溶性部分與抗體分子的Fc片 段的編碼區(qū)融合在一起構(gòu)成的融合基因sCTLA4-Ig，插入適當(dāng)?shù)妮d體，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞后可 以得到一種天然不存在的融合蛋白，它既有細(xì)胞表面受體預(yù)期原有配體結(jié)合的能力，又有 抗體分子一樣的可溶性。CTLA4-Ig融合蛋白半衰期和抗體分子接近，保持活性時(shí)間比較長(zhǎng)。 利用人源基因獲得的蛋白分子在體內(nèi)不會(huì)引起免疫反應(yīng)。目前已經(jīng)由多種類似的可溶性融 合蛋白質(zhì)被制備出來(lái)并成功地用于臨床。CTLA-4的可溶性受體可以競(jìng)爭(zhēng)性地與B7分子結(jié) 合，而且其對(duì)B7的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于⑶觀，因此可以明顯地抑制通道。
CTLA4-Ig融合蛋白也可以用于一些自身免疫性疾病的治療。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 是一種慢性自身免疫性疾病，它能引起關(guān)節(jié)炎癥和畸形。同時(shí)也能引起周身系統(tǒng)性疾病，例 如血管炎、身體局部出現(xiàn)類風(fēng)濕性皮下小結(jié)、肺部疾病、血液紊亂和骨質(zhì)疏松癥。類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎是一種漸進(jìn)發(fā)展的風(fēng)濕性疾病，在發(fā)達(dá)國(guó)家中病人比例大概占2%。這種疾病的特點(diǎn) 是持續(xù)不斷的關(guān)節(jié)膜炎，破壞軟骨和造成骨侵蝕，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)接合處外周發(fā)生結(jié)構(gòu)性畸 形。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的癥狀包括關(guān)節(jié)腫脹、炎癥、晨僵和疼痛。最終嚴(yán)重患者發(fā)展為結(jié)構(gòu)性損 壞，包括伴隨骨侵蝕的關(guān)節(jié)損傷(Principals of Internal Medicine, Harrison, 13. sup. thedition,pages 1648-1655)此外，患者呈現(xiàn)出其他各種器官損傷的并發(fā)癥，包括皮膚、腎 臟、心臟、肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼睛的損傷。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，其中涉及T淋巴細(xì)胞與 抗原提呈細(xì)胞間的抗原非特異性相互作用?？傮w上說(shuō)，T細(xì)胞的反應(yīng)程度主要取決于T細(xì) 胞表面分子與其配體相互作用所引導(dǎo)的共刺激反應(yīng)。(Mueller, et al. , 1989 Ann. Rev.3Immunol. 7 :445-480)關(guān)鍵的共刺激信號(hào)主要是由T細(xì)胞表面受體⑶觀和CTLA-4以及位于 抗原提呈細(xì)胞上的配體，例如B7相關(guān)分子CD80和CD86決定(Linsley，P. and Ledbetter, J.1993Αηη· Rev. Immunol. 11 :191-212)。
T細(xì)胞激活過(guò)程中缺少共刺激因子會(huì)導(dǎo)致無(wú)能T細(xì)胞反應(yīng)(ktiwartz，R. H.，1992 Cell71 :1065-1068),使其不再對(duì)刺激發(fā)生反應(yīng)。由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的 免疫系統(tǒng)疾病，其中一種治療策略是開發(fā)新的試劑用來(lái)阻斷內(nèi)源性的CD^或者CTLA-4與 B7的結(jié)合。Abata^pt由施貴寶公司開發(fā)，已經(jīng)獲得批準(zhǔn)在美國(guó)用于治療對(duì)抗TNF α治療 無(wú)效的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人。Abatac印t是可溶性的CTLA-4分子與抗體Fc的融合蛋白， 通過(guò)與內(nèi)源性的CTLA-4受體分子競(jìng)爭(zhēng)，阻斷共刺激信號(hào)。Belatacept同樣是由施貴寶公司 開發(fā)，與Abataapt僅僅具有兩個(gè)氨基酸的不同。
由于CTLA4_Ig融合蛋白的藥理作用是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)阻斷共刺激因子對(duì)T細(xì)胞的激活， 因此，如果開發(fā)出具有更高親和力的CTLA4-Ig融合蛋白，不但可以顯著提高抑制活性，更 加有效的阻斷共刺激因子對(duì)T細(xì)胞的激活，同時(shí)還可以降低使用劑量，降低治療成本。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請(qǐng)人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了多種具有高親和力 的CTLA4-Ig融合蛋白突變體。這些突變體與Abataapt相比具有更高的親和力活性，能夠 更加有效的阻斷共刺激因子對(duì)T細(xì)胞的激活。高親和力的CTLA4-Ig融合蛋白突變體可用于 制備治療免疫排斥反應(yīng)或者自身免疫性疾病藥物，與Abatac印t相比，可以降低使用劑量， 降低治療成本。
本發(fā)明公開了
1，一種高親和力的CTLA4-Ig融合蛋白突變體，其特征在于所述突變體包括如SEQ ID NO :2所示的CTLA-4膜外區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代，所述位 點(diǎn)為第四、61或104位氨基酸的位置。
2，上述的突變體，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上由脯氨酸、賴氨酸、谷 氨酸或絲氨酸取代。
3，上述1或2所述的突變體，其特征在于所述突變體的親和力與Abataapt相比 提高至少2倍。
4，上述3所述的突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:6，7， 11，13，15，16，18，19 或 20 之一。
5，上述1或2所述的突變體，其特征在于所述突變體的親和力與Abata^pt相比 提高至少4倍。
6，上述5所述的突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:6，7， 16，18，19 或 20。
7，上述1或2所述的突變體，其特征在于所述突變體的親和力與Abataapt相比 提高至少10倍。
8，上述7所述的突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO 20。
9，一種制劑，含有上述1至8任一所述的突變體和可藥用的載體。
10，上述1至9任一所述的突變體或其制劑在制備治療免疫排斥反應(yīng)或者自身免疫性疾病藥物中的用途。
11，上述10的用途，其中自身免疫性疾病為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
更具體地，本發(fā)明的申請(qǐng)人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，首先構(gòu)建了 CTLA-4膜外區(qū)基因和Fc區(qū) 基因，然后將CTLA-4膜外區(qū)基因和Fc區(qū)基因融合表達(dá)、純化，獲得CTLA4-Ig融合蛋白。根 據(jù)圖1所示的氨基酸突變位點(diǎn)，采用overlapPCR的方式對(duì)CTLA4_Ig突變體進(jìn)行構(gòu)建，其 構(gòu)建與表達(dá)、純化的方法與未突變的原本CTLA4-Ig融合蛋白相同。所述CTLA4-Ig突變體 包括CTLA-4膜外區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代，所述位點(diǎn)為第29、 51、53、61、95或104位氨基酸的位置，取代氨基酸為脯氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或絲 氨酸。
對(duì)于本發(fā)明，任何合適的真核表達(dá)載體都可以使用，這些載體可以為 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。
本發(fā)明的申請(qǐng)人對(duì)上述CTLA4_Ig突變體進(jìn)行了 biacore鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，申 請(qǐng)人構(gòu)建的原本CTLA4-Ig融合蛋白的親和力與Abatac^pt的親和力相似。相對(duì)于未突變 的原本CTLA4-Ig融合蛋白或市售的Abatac印t，提高親和力程度較高的單點(diǎn)突變體為第 29位脯氨酸或賴氨酸取代(D29Y或D29K)的突變體，親和力提高了約4倍；第61位脯氨酸 取代(D61Y)或第104位谷氨酸或絲氨酸取代(D104E或D104Q的突變體，親和力至少提高 了 2倍。提高親和力程度較高的單點(diǎn)組合突變體為第四位脯氨酸和第61位脯氨酸同時(shí) 取代(擬9Y，D61Y)的突變體，第61位脯氨酸和第104位谷氨酸同時(shí)取代(D61Y，D104E)的 突變體，第四位脯氨酸和第104位谷氨酸同時(shí)取代(擬9Y，D104E)的突變體，上述三個(gè)兩單 點(diǎn)組合突變體的親和力提高了至少4倍；第四位脯氨酸、第61位脯氨酸和第104位谷氨酸 三單點(diǎn)組合取代(擬9Y，D61Y，D104E)的突變體親和力提高最大，至少提高了 18倍。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，高親和力的CTLA4_Ig融合蛋白突變體，其最佳突變位點(diǎn)為第 29,61或104位氨基酸位點(diǎn)，最佳取代的氨基酸為脯氨酸或谷氨酸。并且，多個(gè)單點(diǎn)組合突 變體的親和力要高于單點(diǎn)突變體。
本發(fā)明公開上述CTLA4_Ig融合蛋白突變體，可以和藥學(xué)上可以接受的輔料一起 組成藥物制劑組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，制劑可為制藥領(lǐng)域常用的混懸、水針、凍干等 制劑，優(yōu)選水針或凍干制劑，對(duì)于本發(fā)明公開的上述CTLA4-Ig融合蛋白突變體的水針或凍 干制劑，藥學(xué)上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑和緩沖液之一或 其組合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或 80) ；poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷 基、亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量應(yīng)使CTLA4_Ig融合蛋白 突變體顆?；厔?shì)最小，溶液穩(wěn)定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類包 括谷氨酸單鈉或組氨酸，醇類包括三元醇、高級(jí)糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液 穩(wěn)定劑的加入量應(yīng)該使最后形成的制劑在本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間內(nèi)保持 穩(wěn)定狀態(tài)，等滲調(diào)節(jié)劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液可以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸 鹽緩沖液之一。
上述制劑為包含CTLA4_Ig融合蛋白突變體的組合物，在對(duì)包括人在內(nèi)的動(dòng)物給 藥后，阻斷共刺激因子對(duì)T細(xì)胞激活的效果明顯。具體來(lái)講，CTLA4-Ig融合蛋白突變體通 過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活作用，對(duì)治療免疫排斥反應(yīng)或者自身免疫性疾病有效，可以作為治療上述疾病的藥物使用。
本發(fā)明中CTLA4_Ig融合蛋白突變體及其組合物在對(duì)包括人在內(nèi)的動(dòng)物給藥時(shí)， 給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴(yán)重性，以及給藥途徑而異，可以參考動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果和種種情況，總給藥量不能超過(guò)一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是0. 1 3000mg/天。


圖1. CTLA-4膜外區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列。圖中第一行序列表示CTLA-4膜外 區(qū)的堿基序列，第二行序列表示氨基酸序列。其中有下劃線的地方表示構(gòu)建突變體的突變 點(diǎn)，其堿基序列上對(duì)應(yīng)的是其序列號(hào)。
圖2. biacore檢測(cè)Abatac^pt及CTLA4_Ig突變體。不同突變體按照相同濃度，等 倍比稀釋在50μ Ι/min流速和25°C環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)。圖中所示為，不同CTLA4_Ig突變體在 相同濃度下的sensorgram圖。WT，表示未突變的原本CTLA4_Ig融合蛋白。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施 例不包括對(duì)傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)拉的方法，將編碼蛋白的基因 插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域 中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J. , Fritsch, Ε. F. and Maniais, Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Sedition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
實(shí)施例1. CTLA-4膜外區(qū)基因和Fc區(qū)基因的克隆
用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人淋巴細(xì)胞，用Trizol試劑Gnvitrogen公司產(chǎn)品) 提取總RNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CTLA-4膜外區(qū)基因(GeneID :1493)，并用引物FC有義GCCCAGA TTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGAC 和 FC 反義GAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG 擴(kuò)增抗體 Fc 區(qū)。 PCR反應(yīng)均采用熱啟動(dòng)，反應(yīng)條件94°C 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T(pr0mega公司)載體中，測(cè) 序驗(yàn)證后確認(rèn)獲得了正確的克隆。SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2顯示了 CTLA-4膜外區(qū)的 核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分別顯示了 IgGl Fc區(qū)的核苷酸序列 和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CT和pGEM-T/Fc。
實(shí)施例2. CTLA4-Ig融合蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物將合成的信號(hào)肽序列SEQ ID NO 5與克隆出來(lái)的CTLA-4膜外基因片段 進(jìn)行overlapPCR，將連接測(cè)序正確的片段與抗體IgGl Fc進(jìn)行overlapPCR，裝pGEM-Τ載體 進(jìn)行測(cè)序。挑選測(cè)序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切CTLA4_Ig融合蛋白基因，經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳純化回收，與用HindIII和EcoR I酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)(美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，構(gòu)建成真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)，記作pcDNA3. 1 (+) (CTLA4_Ig)。
實(shí)施例3.融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)與純化
于3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3X105 CH0-K1細(xì)胞(ATCC CRL-9618)，細(xì)胞培養(yǎng) 至90% -95%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染取質(zhì)粒1(^8(質(zhì)粒？00嫩3.1(+) (CTLA4-Ig)10y g和20 μ ILipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司產(chǎn)品)分別溶于 500 μ 1 無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形 成，其間用3ml無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂 質(zhì)體復(fù)合物加入到板中，CO2孵箱培養(yǎng)4小時(shí)后補(bǔ)加2ml含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置 于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后細(xì)胞換含600yg/ml G418選擇培養(yǎng)基篩選抗性克 隆。取細(xì)胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)篩選高表達(dá)克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C過(guò) 夜，用2% BSA-PBS于37°C封閉濁，加入待測(cè)的抗性克隆培養(yǎng)上清或標(biāo)準(zhǔn)品(Abata^pt)， 37°C溫育濁，加入HRP-羊抗人Fc(CH2)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37°C溫育lh，加入TMB于37°C作用 5min，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)A450值。將篩選得到的高表達(dá)克隆用無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培 養(yǎng)，用ftOtein A親和柱(GE公司產(chǎn)品)分離純化融合蛋白。將純化的融合蛋白用PBS進(jìn) 行透析，最后以紫外吸收法定量。
實(shí)施例4.融合蛋白突變體的構(gòu)建及表達(dá)
采用overlapPCR的方式對(duì)CTLA4_Ig突變體進(jìn)行構(gòu)建，其構(gòu)建與表達(dá)、純化的方法 與原本CTLA4-Ig融合蛋白相同(如實(shí)施例1至3所述)。其中，CTLA-4膜外區(qū)的突變點(diǎn)選 擇見圖1所示，突變體氨基酸序列見SEQ ID NO :6 20。
實(shí)施例5. CTLA-4/Ig突變體的biacore鑒定
將CM5芯片(GE公司)在50 μ 1/min的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液)中25°C平衡 30min,然后用100 μ 1的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)和100 μ 1 EDC (1-乙基-3- (3- 二甲基 氨丙基)-碳化二亞胺)混合，以 ο μ 1/ml活化芯片8min。然后將終濃度為5 μ g/ml的 CD86-Fc蛋白(R&D公司)以10 μ 1/ml的流速包被芯片，最終Δ Ru = lOORu。然后用PBS 緩沖液50 μ 1/min平衡lOmin。將待檢測(cè)樣品以等兩倍比稀釋五個(gè)濃度，50 μ 1/min上樣 75sec，然后用PBS解離IOmin。圖2顯示了在相同樣品濃度下biacore檢測(cè)的sensorgram 圖；具體檢測(cè)親和力數(shù)值見表1。其中，我們構(gòu)建的原本CTLA4-Ig融合蛋白的親和力與 Abatacept的親和力相似。
相對(duì)于未突變的原本CTLA4_Ig融合蛋白，提高親和力程度較高的單點(diǎn)突變體為 突變體CTmutl和CTmut2，親和力分別提高了 3. 98和4. 04倍；突變體CTmut6，親和力提高 了 2. 倍；突變體CTmutlO，親和力提高了 2. 68倍。最終，親和力提高最高的為三點(diǎn)組合 突變體CTmutl5，其親和力最終提高了 18. 2倍。
相對(duì)于市售的Abatacept，提高親和力程度較高的單點(diǎn)突變體為突變體CTmutl 和CTmut2，親和力分別提高了 4. 24和4. 31倍；突變體CTmut6，親和力提高了 2. 44倍；突變 體CTmutlO，親和力提高了 2. 86倍。最終，親和力提高最高的為三點(diǎn)組合突變體CTmutl5， 其親和力最終提高了 19. 4倍。
表一
突變體名稱位置突變?yōu)榘被酺, WT mutant KtJ /RdKabat i-ir mutant d /l^dKdWT=25.73±3 nMCTmutlCTmut2CTmut3CTm ut4CTmut5CTmut6CTmut CTmut8CTmut9CTmutlO串-點(diǎn)組合突變體CTmutlICTmut 12CTmutl 3CTmut 14CTmut 15Kdabat=27.42±3 nMD29AlaTyrD29AlaLysD51ThrLysD53MetGIuD61LeuLysD61LeuTyrD95GluTyrD104LeuGluD104LeuAsnD104LeuSerD29Y’D61YD29Y，D53ED61Y,D104ED29Y,D104ED29Y,D61Y,D104E3.98 士 0.19 4.04 ± 0.90 0.55 ±0.14 1.75 ±0.07 1.85±0.16 2.29 ±0.31 1.64 士 0.12 2.00 士 0.39 0.88 ±0.06 2.68 土 1.144.68 ± 1.78 1.83 ±0.25 4.52 ±0.14 5.47 ±0.56 18.20 士 1.054.24 士 0.20 4.3 i 土 0.96 0.58 ±0.15 1.87 ±0.08 1.97 士 0.]7 2.44 ±0.33 1.75 士 0.13 2.13 ±0.42 0.94 士 0.06 2.86 ± 丨.224.99 ± 1.90 1.95 ±0.27 4.82±0.15 5.83 土 0.60 19.40± 1.12
實(shí)驗(yàn)誤差采用SD表示，通過(guò)三次不同的實(shí)驗(yàn)確定。WT，表示未突變的原本 CTLA4-Ig融合蛋白；abat，表示市售Abatac^pt ；CTmutl CTmutl5，表示單點(diǎn)突變或單點(diǎn) 組合突變的CTLA4-Ig融合蛋白突變體。
序列表
<110>上海抗體藥物國(guó)家工程研究中心有限公司
<120> 一種高親和力的CTLA4_Ig融合蛋白突變體
<160>20
<170>PatentIn version 3. 2
<210>1
<211>375
<212>DNA
<213>CTLA_4膜外區(qū)核苷酸序列
<400>1
atgcacgtgg
tgtgagtatg
gacagccagg
ctagatgatt
ggactgaggg
ccatactacc
ccagattctg
<210>2
<211>125
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<213>CTmut9氨基酸序列
<400>14
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275280285
ValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThr
290295300
ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu
305310315320
ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSer
325330335
ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer
340345350
LeuSerProGlyLys
355
<210>15
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutlO氨基酸序列
<400>15
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151015
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202530
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354045
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505560
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65707580
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859095
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100105110
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115120125
SerSerAspLysThrHisThrSerProProSerProAlaProGluLeu
130135140
LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr
145150155160
LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
180185190
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer
195200205
ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu
210215220
AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAla
225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
260265270
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275280285
ValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThr
290295300
ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu
305310315320
ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSer
325330335
ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer
340345350
LeuSerProGly Lys
355
<210>16
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutll氨基酸序列
<400>16
MetHisValAlaGlnProAlaValValLeuAlaSerSerArgGlylie
151015
AlaSerPheValCysGluTyrAlaSerProGlyLysTyrThrGluVal
202530
ArgValThrValLeuArgGlnAlaAspSerGlnValThrGluValCys
354045
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505560
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65707580
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859095
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100105110
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115120125
SerSerAspLysThrHisThrSerProProSerProAlaProGluLeu
130135140
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145150155160
LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
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195200205
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210215220
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225230235240
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LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
180185190
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer
195200205
ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu
210215220
AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAla
225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
260265270
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290295300
ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu
305310315320
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325330335
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340345350
LeuSerProGlyLys
355
<210>18
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutl3氨基酸序列
<400>18
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151015
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202530
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354045
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859095
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100105110
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115120125
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130135140
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145150155160
LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
180185190
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer
195200205
ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu
210215220
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225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
260265270
ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAla
275280285
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290295300
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340345350
LeuSerProGlyLys
355
<210>19
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutl4氨基酸序列
<400>19
MetHisValAlaGlnProAlaValValLeuAlaSerSerArgGlylie
151015
AlaSerPheValCysGluTyrAlaSerProGlyLysTyrThrGluVal
202530
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354045
AlaAlaThrTyrMetMetGlyAsnGluLeuThrPheLeuAspAspSer
505560
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130135140
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145150155160
LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
180185190
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer
195200205
ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu
210215220
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225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
260265270
ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAla
275280285
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290295300
ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu
305310315320
ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSer
325330335
ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer
340345350
LeuSerProGlyLys
355
<210>20
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutl5氨基酸序列
<400>20
MetHisValAlaGlnProAlaValValLeuAlaSerSerArgGlylie
151015
AlaSerPheValCysGluTyrAlaSerProGlyLysTyrThrGluVal
202530
ArgValThrValLeuArgGlnAlaAspSerGlnValThrGluValCys
354045
AlaAlaThrTyrMetMetGlyAsnGluLeuThrPheTyrAspAspSer
505560
IleCysThrGlyThrSerSerGlyAsnGlnValAsnLeuThrlieGln
65707580
GlyLeuArgAlaMetAspThrGlyLeuTyrlieCysLysGluGluLeu
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165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
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195200205
ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu
210215220
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225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
260265270
ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAla
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ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu
305310315320
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325330335
ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer
340345350
LeuSerProGlyLys
35權(quán)利要求
1.一種高親和力的CTLA4-Ig融合蛋白突變體，其特征在于所述突變體包括如SEQ IDNO 2所示的CTLA-4膜外區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代，所述位 點(diǎn)為第四、61或104位氨基酸的位置。
2.權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上由脯氨酸、賴 氨酸、谷氨酸或絲氨酸取代。
3.權(quán)利要求1或2所述的突變體，其特征在于所述突變體的親和力與Abataapt相比 提高至少2倍。
4.權(quán)利要求3所述的突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQID NO :6， SEQID NO 7,SEQ ID N0:11，SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO :18， SEQ ID NO 19 或 SEQ ID NO :20。
5.權(quán)利要求1或2所述的突變體，其特征在于所述突變體的親和力與Abataapt相比 提高至少4倍。
6.權(quán)利要求5所述的突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQ ID NO :16，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 19 或 SEQ ID NO :20。
7.權(quán)利要求1或2所述的突變體，其特征在于所述突變體的親和力與Abataapt相比 提高至少10倍。
8.權(quán)利要求7所述的突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQID NO 20。
9.一種制劑，含有上述1至8任一所述的突變體和可藥用的載體。
10.權(quán)利要求1至9任一所述的突變體或其制劑在制備治療免疫排斥反應(yīng)或者自身免 疫性疾病藥物中的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中自身免疫性疾病為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有高親和力的CTLA4-Ig融合蛋白突變體和其在制備治療免疫排斥反應(yīng)或者自身免疫性疾病藥物中的用途。所述突變體包括CTLA-4膜外區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代。這些突變體與Abatacept相比具有更高的親和力活性，能夠更加有效的阻斷共刺激因子對(duì)T細(xì)胞的激活。
文檔編號(hào)A61P37/02GK102030828SQ20091005795
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者侯盛, 李博華, 王皓, 趙磊, 郭亞軍 申請(qǐng)人:上?？贵w藥物國(guó)家工程研究中心有限公司