一種ERK信號通路抑制劑NdpA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種ERK信號通路抑制劑NdpA，屬于細胞生物學領域。本發(fā)明確定了可以抑制ERK信號通路的肺炎克雷伯桿菌分泌蛋白NdpA，并且發(fā)現(xiàn)NdpA通過直接結(jié)合ERK并抑制其磷酸化而實現(xiàn)對ERK信號通路的抑制。本發(fā)明成果可為臨床多種疾病的治療提供新的工具和思路，尤其在抗腫瘤、緩解動脈粥樣硬化和痛風等多種藥物的開發(fā)和臨床應用等方面將有著廣闊的前景，也可以直接應用于科研領域或指導開發(fā)ERK的抑制劑。此外，該成果還對尋找新的抗感染藥物靶點和篩選新藥具有重要的理論意義。
【專利說明】
一種ERK信號通路抑制劑NdpA
技術(shù)領域
[00011本發(fā)明涉及一種ERK信號通路抑制劑NdpA，尤其是一種能抑制ERK信號通路的肺炎 克雷伯桿菌分泌蛋白，屬于細胞生物學領域。
【背景技術(shù)】
[0002]炎癥，也就是人們常說的"發(fā)炎"，本是機體對外界刺激產(chǎn)生的一種保護性反應，其 臨床表現(xiàn)為：紅、腫、熱、痛和功能性障礙。通常情況下，炎癥對機體是有益的，但是有些時 候，炎癥也是某些疾病的罪魁禍首。
[0003] 絲裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)反應通 路是真核細胞信號傳遞的重要途徑之一。在哺乳動物細胞中，幾乎所有的生長因子和細胞 因子都可以激活該途徑，并啟動早期應答基因的表達。MAPK信號通路可以被多種應激原(如 病原產(chǎn)物、促炎因子、滲透壓、機械刺激等)激活，最終磷酸化大量蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)錄因子、細 胞骨架蛋白、激酶和其他酶類，因而極大地影響了細胞的代謝、形態(tài)、生長、生存和分裂等功 能。
[0004] 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（The extracellular signal-regulated kinase，ERK)是 MAPK家族中首先被鑒定出來的成員，包括分子量為44kDa的ERK1、分子量為42kDa的ERK2等 多種亞型，它們有90%的同源性，其保守的磷酸化位點為11^185-611117^87^狀2)或 Thrfos-Glu-TyrfOS(ERKl)t3ERK信號通路可被胰島素和各種生長因子通過受體酪氨酸激酶 (Receptor tyrosine kinase，RTK)激活。當受體結(jié)合配基被活化后，小G蛋白Ras便會釋放 GDP并結(jié)合GTP而被活化，活化的Ras隨即招募MAP3K家族成員Raf到質(zhì)膜，并激活兩個ERK特 異性激活劑MEKl和MEK2。除了沿著Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2途徑激活外，ERK信號通路還 可以被促炎因子和病原相關分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMMs)激活，如TNFa和LPS。此外，ERK信號通路還可以被身體內(nèi)的"危險信號"激活，如動脈 粥樣硬化患者的氧化型低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL)和痛風患者的尿酸 結(jié)晶。已有大量實驗證實ERK信號通路的活性與多種病理過程及重要疾病密切相關，包括： 炎癥反應、肝臟疾病、風濕性關節(jié)炎、肥胖癥和糖尿病等代謝性疾病以及腫瘤等。因此， ERK1/2可作為潛在的藥物靶點，ERK1/2的抑制劑對多種疾病的治療也將取得很好的臨床效 果。
[0005] 肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)屬于腸桿菌科(Enterrobacteriace) 克雷伯菌屬(KlebsielIae)，在自然界分布很廣泛。近幾年，肺炎克雷伯桿菌成為了僅次于 大腸桿菌的最重要的條件致病菌，嚴重威脅著人類的健康，常引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染。 肺炎克雷伯桿菌通常聚集在人類的皮膚、咽、胃腸道、傷口、尿道和呼吸道，其中在醫(yī)院內(nèi)感 染中，該菌最常出現(xiàn)在呼吸道和尿道。肺炎克雷伯桿菌傾向于感染免疫力低下的群體，例如 老人和兒童。當機體抵抗力低下或服用免疫抑制劑以及長期大量服用抗生素導致菌群失調(diào) 時，該病原菌易感染宿主致病，如肺炎、敗血癥、肝膿腫、腦膜炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎或是傷口感 染。而且在肺炎克雷伯桿菌感染的早期階段，宿主的炎癥反應受到了抑制。由于具有快速傳 播的特點，肺炎克雷伯桿菌在醫(yī)院有著爆發(fā)的態(tài)勢。
[0006] 類核相關蛋白（Nucleoid-associated proteins)是一類廣泛存于革蘭氏陰性細 菌中非常保守的蛋白，參與細菌DNA的構(gòu)象改變、復制、重組、修復和轉(zhuǎn)錄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種ERK信號通路抑制劑，旨在抑制ERKl/ 2磷酸化，使其上游激活劑MEKl不能與ERK1/2相互作用，從而抑制ERK1/2磷酸化。
[0008]所述抑制劑是肺炎克雷伯桿菌分泌蛋白NdpA，其氨基酸序列如(a)或(b)或(c):
[0009] (a)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0010] (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有 抑制ERK信號通路活性的由(a)衍生的多肽或其類似物；
[0011] (c)與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似 物。
[0012 ]所述抑制劑能抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1 /2的磷酸化。
[0013] 本發(fā)明還提供一種ERK信號通路抑制劑突變體，是在SEQ ID NO. 1所示序列基礎 上，將第15位的賴氨酸K突變?yōu)楸彼酇，或?qū)⒌?6位的精氨酸突變丙氨酸A，或?qū)⒌?3位的 亮氨酸L突變?yōu)楣劝彼酔。
[0014]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供所述抑制劑的制備方法，包括以下步驟： [0015] (1)構(gòu)建含有編碼NdpA蛋白的基因的重組質(zhì)粒pET-28a-NdpA，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌BL21中，在30°C以IPTG誘導蛋白表達；
[0016] (2)超聲破菌，高速離心后收取上清液，將上清液流過填充好的Ni-NTA Agarose 中，然后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入含有咪唑的洗脫液洗脫蛋白，將收集的 洗脫液加入到I OkD的蛋白濃縮管中，離心濃縮；
[0017] ⑶在蛋白濃縮管中加入PBS混勾后離心、分裝蛋白，先用液氮速凍，再放到-80°C 保存待用。
[0018] 本發(fā)明提供ERK信號通路抑制劑可用于篩選、制備治療ERK信號通路相關的疾病的 藥物，或用于篩選、制備抗腫瘤、緩解動脈粥樣硬化和痛風的藥物，或用于篩選、制備治療肺 炎克雷伯桿菌導致的感染性疾病的藥物。
[0019] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌分泌性效應蛋白NdpA通過抑制ERK1/2磷酸化而抑制 ERK信號通路。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)NdpA通過自身的D模序與ERK1/2直接結(jié)合，導致MEKl不能與ERKl/ 2相互作用，使得ERK1/2不能磷酸化激活。由于臨床上多種疾病的發(fā)生都與ERK信號通路的 異常激活相關，因此控制ERK1/2的磷酸化水平有利于治療很多疾病。本發(fā)明成果將來可為 臨床多種疾病的治療提供新的工具和思路，尤其在抗腫瘤、緩解動脈粥樣硬化和痛風等多 種藥物的開發(fā)和臨床應用等方面將有著廣闊的前景，也可以直接應用于科研領域或指導開 發(fā)ERK信號通路的抑制劑。此外，該成果還對尋找新的抗肺炎克雷伯桿菌等病原導致的感染 性疾病的藥物靶點和篩選新藥具有重要的實際意義。
【附圖說明】
[0020] 圖I = (A)NdpA抑制ERK信號通路，每組數(shù)據(jù)(平均值土標準誤差）至少代表3個獨立 的實驗，*P〈〇. 05，#P〈0.0 l (雙尾未配對t檢驗）；（B)NdpA抑制ERK1/2磷酸化。
[0021] 圖2:NdpA 與 ERK1/2 相互作用。
[0022] 圖3: NdpA抑制MEK1和ERK1 /2的相互作用。
[0023] 圖4: (A)D模序的突變體NdpA(L21E)顯著地削弱了NdpA對ERK信號通路的抑制作 用，每組數(shù)據(jù)(平均值土標準誤差)至少代表3個獨立的實驗，撲〈0.05，*撲〈0.01(雙尾未配 對t檢驗）；（B)D模序的突變體NdpA(L21E)不能有效結(jié)合ERK1/2; (C)突變體NdpA(L21E)不能 有效抑制ERK1/2的磷酸化。
【具體實施方式】
[0024] 由于ERKl和ERK2高度相似，其同源性高達90%，且細胞中ERK2的含量遠高于ERKl， 所以以下是實施例采用ERK2，ERK2基因序列如GeneID :5594所示。MEKl基因的序列如 GeneID: 5604所不。
[0025]實施例1 NdpA對ERK信號通路活化的抑制作用
[0026] (A)采用雙熒光報告基因技術(shù)檢測NdpA對ERK信號通路的影響
[0027] 1)構(gòu)建含有編碼NdpA基因的重組質(zhì)粒p3 XFlag-CMVH-NdpA;
[0028] 2)采用重疊延伸PCR法將MEKl蛋白中的218位絲氨酸以及222位絲氨酸分別突變?yōu)?谷氨酸和天冬氨酸后獲得MEKl-ED基因片段，構(gòu)建含有編碼MEKl-ED基因的重組質(zhì)粒pCS2-HA-MEKl-ED；
[0029] 3)采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒p3 X Flag-CMVH-NdpA和檢測ERK信號通路活化 情況的質(zhì)粒 pGal4-Elk、pGal4-luc、pRL-TK(購買自 Promega 公司）以及質(zhì)粒 pCS2-HA-MEKl-ED共轉(zhuǎn)染進HEK293T細胞；
[0030] 4)轉(zhuǎn)染6h后換新鮮的無血清培養(yǎng)基，24h后用promega公司的試劑盒以及熒光測量 儀檢測NdpA對MEKl -ED激活的ERK信號通路的影響。
[0031] (B)檢測NdpA對ERK1/2磷酸化的影響
[0032] 將上述檢測熒光后的細胞裂解液用BCA法定量后用于Western Blot實驗，用P-ERKl/2(9101;Cell Signaling)抗體和ERK1/2抗體（9102;Cell Signaling)分別檢測ERKl/ 2的磷酸化水平和總ERK1/2蛋白量。
[0033] (C)實驗結(jié)果分析
[0034] 雙熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明NdpA可以顯著抑制MEKl-ED激活的ERK信號通路(見 圖1A);而對應的Western Blot證明NdpA可以抑制ERK1/2的磷酸化（見圖1B);因此NdpA是通 過抑制ERK1/2的磷酸化而阻礙ERK信號通路的活化。
[0035]實施例2 NdpA蛋白能夠與ERK蛋白相互作用
[0036] 由于肺炎克雷伯桿菌與大腸桿菌同屬于腸桿菌科，兩者的相似性較高，用大腸桿 菌純化的蛋白較在細胞里轉(zhuǎn)染表達的蛋白更能夠模擬肺炎克雷伯桿菌NdpA與宿主靶蛋白 的相互作用，所以本實施例用大腸桿菌BL21純化了融合蛋白His-NdpA，用His-NdpA檢測其 與HEK293T細胞內(nèi)過表達的Flag-ERK2的相互作用。
[0037] (A)His-NdpA蛋白的制備
[0038] 1)構(gòu)建含有編碼NdpA基因的重組質(zhì)粒pET-28a-NdpA，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 中；
[0039] 2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在30°C條件下加入IPTG過夜誘導蛋白表達；
[0040] 3)超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0041 ] 4)將上清液緩緩流過填充好Ni-NTAAgar〇Se(Qiagen公司）中，然后加入柱洗滌緩 沖液充分洗滌柱子，最后加入2_3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0042] 5)將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管(millipore)中，3000rpm離心濃縮 20min；
[0043] 6)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻后重復離心（同步驟5);
[0044] 7)分裝蛋白，先用液氮速凍，再放到-80°C保存待用。
[0045] (B)免疫共沉淀（0〇-;[1111]11111(^代(^。;^&1:;[011，&3-1?)實驗
[0046] 1)構(gòu)建編碼ERK2的質(zhì)粒p3XFlag-ERK2轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞，6h后更換新鮮含有 10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24h后收集細胞，用Co-IP裂解液裂解，4°C、12000g離心 IOmin，收集上清；
[0047] 2)在裂解后的上清中加入偶聯(lián)了Flag抗體的凝膠顆粒(F3165 !Sigma-AldrichMPI His-NdpA，4°C 過夜孵育；
[0048] 3)Western Blot檢測Flag_ERK2和His-NdpA的結(jié)合情況。
[0049] (C)實驗結(jié)果分析
[0050]從圖2中可以看出，偶聯(lián)了Flag抗體的凝膠顆粒不能免疫沉淀HiS-NdpA，而在 Flag-ERK2的存在的情況下則可以有效地免疫沉淀His-NdpA，這就說明NdpA能夠與ERK蛋白 相互作用。
[0051 ] 實施例3 NdpA蛋白抑制MEKl與ERK2的相互作用
[0052] (A)Co-IP 實驗
[0053] 1)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pCNDA6A-MEKl、p3 X Flag-ERK2、p3 X Flag-NdpA;
[0054] 2)將重組質(zhì)粒 pCNDA6A-MEKl 和 p3XFlag-ERK2和（或）p3XFlag-NdpA 共轉(zhuǎn)染到 HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮含有10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24h后收集細胞，用 Co-IP裂解液裂解細胞，4°C、12000g離心10min，收集上清；
[0055] 3)在裂解后的上清中加入偶聯(lián)了Myc抗體的凝膠顆粒(SC-40AC;Santa Cruz)，4°C 過夜孵育；
[0056] 4)Western Blot檢測Flag_ERK2和Myc-MEKl的結(jié)合情況。
[0057] (B)實驗結(jié)果分析
[0058] 從圖3中可以看出，MEKl能夠結(jié)合ERK2,但是過表達NdpA后，MEKl便不能有效結(jié)合 ERK2〇
[0059] 實施例4突變體NdpA(L21E)
[0060] (A)采用雙熒光報告基因技術(shù)檢測NdpA對ERK信號通路的影響
[0061 ] 1)構(gòu)建含有編碼NdpA/NdpA (K15A) /NdpA (R16A) /NdpA (L21E) /NdpA (2 3E)基因的重 組質(zhì)粒 p3XFlag-CMV14-NdpA/NdpA(K15A)/NdpA(R16A)/NdpA(L21E)/NdpA(23E);
[0062] 2)采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒 p3XFlag-CMV14-NdpA/NdpA(K15A)/NdpA (R16A)/NdpA(L21E)/NdpA(23E)和檢測 ERK 信號通路活化情況的質(zhì)粒 pGal4-Elk、pGal4-luc、pRL-TK以及表達ERK信號通路組成型激活劑HA-MEKl-ED的質(zhì)粒pCS2HA-MEKl-ED共轉(zhuǎn)染 進HEK293T細胞；
[0063] 4)轉(zhuǎn)染6h后換新鮮的無血清培養(yǎng)基，24h后用promega公司的試劑盒以及熒光測量 儀檢測 NdpA 及突變體 NdpA(K15A)/NdpA(R16A)/NdpA(L21E)/NdpA(23E)對 MEKl-ED 激活的 ERK信號通路的影響。
[0064] (B) Hi s -NdpA/Hi s -NdpA (L21E)蛋白的制備
[0065] 1)構(gòu)建含有編碼NdpA基因的重組質(zhì)粒pET-28a-NdpA、pET-28a-NdpA(L21E)，并將 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0066] 2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在30°C條件下加入IPTG過夜誘導蛋白表達；
[0067] 3)超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0068] 4)將上清液緩緩流過填充好Ni-NTAAgar〇Se(Qiagen公司）中，然后加入柱洗滌緩 沖液充分洗滌柱子，最后加入2_3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0069] 5)將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管(millipore)中，3000rpm離心濃縮 20min；
[0070] 6)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻后同步驟5)重復離心；
[0071] 7)分裝蛋白，先用液氮速凍，再放到-80°C保存待用。
[0072] (C)ERK蛋白的制備
[0073] 1)構(gòu)建含有編碼ERK2基因（GeneID:5594)的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ERK2，并將該質(zhì) 粒和編碼GST-PreScission Protease(PSP)的質(zhì)粒（SG3050-0101;SHANGHAI GENOMICS)分 別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0074] 2)將攜帶GST-ERK2和GST-PSP質(zhì)粒的大腸桿菌BL21分別在30°C條件下加入IPTG誘 導蛋白表達，過夜誘導表達；
[0075] 3)超聲破菌，高速離心后分別收取上清液；
[0076] 4)將上清液分別緩緩流過填充好Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare公 司）中，然后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0077] 5)將收集的洗脫液分別加入到IOkD的蛋白濃縮管(millipore)中，3000rpm離心濃 縮20min;
[0078] 6)將等體積的GST-ERK2和GST-PSP混合，并與Glutathione Sepharose 4B在4°C過 夜孵育；
[0079] 7)收集上清并加入到IOkD的蛋白濃縮管(mi 11 ipore)中，3000rpm離心濃縮20min;
[0080] 8)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻后重復離心（同步驟5);
[0081] 9)分裝蛋白，先用液氮速凍，再放到-80°C保存待用。
[0082] (D)體外 pull-down 實驗
[0083] 1)將攜帶 His-NdpA 或 His-NdpA(L21E)蛋白的Ni-NTAAgarose(Qiagen 公司）與 ERK2 于4°C過夜孵育。
[0084] 2)Western Blot檢測His-NdpA或His-NdpA(L21E)與ERK2的結(jié)合情況。
[0085] (E) NdpA (L21E)對ERK1 /2磷酸化的影響
[0086] 1)采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCS2-HA-MEKl-ED和p3 X Flag-CMVH-NdpA 或 p3XFlag-CMV14-NdpA(L21E)進 HEK293T 細胞；
[0087] 2)轉(zhuǎn)染6h后換新鮮的無血清培養(yǎng)基，24h后通過Western Blot檢測NdpA或NdpA (L 21E)對磷酸化E RK1 / 2的磷酸化的影響。
[0088] (F)實驗結(jié)果分析
[0089] 突變體NdpA(L21E)明顯削弱了NdpA對ERK信號通路的抑制作用，而突變體NdpA (K15A) /NdpA (R16A) /NdpA (23E)對ERK信號通路依然是明顯的抑制(見圖4A); NdpA在體外能 夠直接結(jié)合ERK2,但是突變體NdpA(L21E)卻不能有效結(jié)合ERK2(見圖4B);與NdpA相比，突變 體NdpA(L21E)不能有效抑制ERK1/2的磷酸化(見圖4C)。
[0090] 雖然本發(fā)明已以較佳實例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù) 的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍 應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種ERK信號通路抑制劑，其特征在于，氨基酸序列如以下(a)或(b)或(C)所示： (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有ERK 信號通路抑制活性的由(a)衍生的多肽或其類似物； (c) 與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似物。2. 權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征在于，直接與ERK1/2結(jié)合，抑制MEK1和ERK1/2的結(jié) 合，從而抑制ERK1/2被MEK1磷酸化激活。3. -種ERK信號通路抑制劑，其特征在于，是在SEQ ID NO. 1所示序列基礎上，將第15位 的賴氨酸K突變?yōu)楸彼酇，或?qū)⒌?6位的精氨酸突變丙氨酸A，或?qū)⒌?3位的亮氨酸L突變 為谷氨酸E。4. 一種制備要求1-3任一所述的抑制劑的方法，其特征在于， (1) 構(gòu)建含有編碼NdpA蛋白的基因的重組質(zhì)粒pET-28a-NdpA，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌BL21中，在30°C以IPTG誘導蛋白表達； (2) 超聲破菌，高速離心后收取上清液，將上清液流過填充好的Ni-NTAAgarose中，然后 加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入含有咪唑的洗脫液洗脫蛋白，將收集的洗脫液 加入到10kD的蛋白濃縮管中，離心濃縮； (3) 在蛋白濃縮管中加入PBS混勻后離心、分裝蛋白，先用液氮速凍，再放到-80°C保存 待用。5. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在篩選、制備治療ERK信號通路相關的疾病的藥物中 的用途。6. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在篩選、制備抗腫瘤、緩解動脈粥樣硬化和痛風的藥 物中的用途。7. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在篩選、制備治療肺炎克雷伯桿菌導致的感染性疾 病的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N1/21GK105859844SQ201610213178
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月7日
【發(fā)明人】劉翠華, 許光華, 汪靜, 李冰曦, 嚴景華
【申請人】中國科學院微生物研究所