TLC)分離瓊膠寡糖，點樣:取一塊硅膠板，在距離硅膠板底端2cm處標上一條直線，在直線上每隔2cm作一標記，方便點樣。用0.5mm的點樣管吸取樣品在瓊膠版上進行點樣，使點樣斑點不超過2_，使點樣點自然干燥。展層:將已點好樣的硅膠板的點樣端放入到裝有展層劑的層析缸中，使展層劑的液面不要超過點樣點，密閉層析缸，自上而下展層，當層析劑上升到硅膠板頂端1cm處，立即取出硅膠板，于60°C的烘箱中烘干。顯色:取出已烘干的硅膠板，將顯色劑均勻噴灑在硅膠板上，放置到60°C的烘箱中加熱，直至層析斑點出現。
[0016]本發(fā)明的有益效果:篩選出一株生產瓊膠酶的海洋微生物，分類命名為溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus) A-001。在貝類腸道微生物篩選出可降解瓊膠的溶藻弧菌，國內外少有報道。該菌以常見碳源，氮源，無機鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基，生產周期短，12h可達到對數生長期，該菌種能誘導表達瓊膠酶。通過簡單的分離純化方法即可得到瓊膠寡糖。
【具體實施方式】
[0017]以下是說明本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明并不限于此。
[0018]實施例1
海洋貝類腸道采取樣液，吸取lml進行稀釋(10、10 2，10 3，10 4，10 5，10 6，10 7，10 8)，吸取0.2ml涂布于瓊脂篩選培養(yǎng)基上，在28°C下，培養(yǎng)48h后，挑選有明顯凹陷的菌落，經過分離純化后，將菌種轉接接到液體培養(yǎng)基28°C，150rpm,搖瓶培養(yǎng)32h，離心取上清液(上清液即為粗酶液)，采用分光光度法檢測培養(yǎng)基中的瓊脂酶活性，經過初篩，共分離獲得6株能長瓊膠酶的細菌，結合瓊膠酶的生產能力，最終選定溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus')A-001作為出發(fā)菌株。
[0019]實施例2
經形態(tài)學和生理生化特性研究，產瓊膠酶菌株的特征如下:
菌落形態(tài):菌落濕潤，顯乳白色，邊緣整齊，圓形。
[0020]細胞形態(tài):彎曲短桿狀。
[0021]生理生化特征:為革蘭氏陰性菌，具有運動性，氧化酶陽性，可利用葡萄糖、淀粉為碳源，也可利用蛋白胨，酵母膏，硝酸銨，硫酸銨，氯化銨等作為生長所需的氮源。
[0022]對保藏號為CCTCC Μ 2015555的菌株的16SrDNA基因進行PCR擴增與序列測定，發(fā)現其16SrDNA的基因部分片斷長度為1420bp，經過NCBI和核糖體數據庫進行比對，鑒定為溶藻弧菌(Vibr1A-001，擬命名為溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus)A-001，菌株的16S rRNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0023]實施例3 (1)將溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus) A-001在種子培養(yǎng)基中，用250mL錐形瓶裝62mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于25°C，140rpm搖床培養(yǎng)24h后得到種子發(fā)酵液，所述種子培養(yǎng)基為:氯化鈉35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，瓊脂
2.0g/L，七水硫酸亞鐵0.1 g/L,調節(jié)pH為7，自來水水配制。
[0024](2 )用250mL錐形瓶裝90mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按11%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后于28°C，150rpm搖床培養(yǎng)培養(yǎng)48h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液，所述種子培養(yǎng)基為:氯化鈉35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，瓊脂2.0g/L,七水硫酸亞鐵0.1 g/L，調節(jié)pH為7，自來水水配制，該實施例所得的瓊膠酶的活力為13.01U/
mLo
[0025]實施例4
取5g瓊脂，加入到盛有100ml蒸餾水的三角瓶中，加熱煮沸使瓊脂溶解，并迅速冷卻到40°C，加入1% (w/v)上述制作的瓊膠酶，于40°C，酶解反應40h，將酶解液在10000r/min離心20min，取上清液于lOKDa超濾膜上進行過濾，收集過濾液，凍干，即得到瓊膠寡糖。
【主權項】
1.一株溶藻弧菌，其特征在于:所述溶藻弧菌為溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus)A-001，已于2015年9月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC N0:M2015555。2.一種如權利要求1所述的溶藻弧菌用于瓊膠寡糖的制備。3.如權利要求2所述的溶藻弧菌用于瓊膠寡糖的制備，其特征在于:其制備方法包括如下步驟: (1)用250mL錐形瓶裝50-90mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于28°C，150rpm搖床培養(yǎng)15h后得到種子發(fā)酵液，所述種子培養(yǎng)基為:氯化鈉35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，瓊脂2.0g/L，七水硫酸亞鐵0.1 g/L，調節(jié)pH為7.5，自來水水配制; (2)用250mL錐形瓶裝90mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按5-10%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)32-60h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:氯化鈉35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，瓊脂2.0g/L，七水硫酸亞鐵0.1 g/L,調節(jié)pH為7自來水水配制，而后將發(fā)酵培養(yǎng)基經過4°C，10000r/min離心15min之后，取上清液； (3)在上清液中加入固體硫酸銨使飽和度達到30%-90%，進行鹽析，置4°C冷室過夜，4°C, 8000r/min 離心 20min 取沉淀； (4)將得到的沉淀加入0.02mol/L的Tris_HCl緩沖液中進行溶解，離心取上清液，將收集的上清液放入透析袋中進行透析，將透析液過預平衡的陰離子交換色譜DEAE-S印harose FF柱，用480mL的含0.3_1M NaCl的Tris-HCl緩沖液進行線性洗脫，洗脫速度為1.5 mL/min，檢測波長為280nm，洗脫液以4.5mL/管分部收集，測定收集到的溶液的酶活，將有活性的部分合并，凍干，_20°C保藏備用； (5)取0.5g瓊脂，加入到盛有100ml蒸餾水的三角瓶中，加熱煮沸使瓊脂溶解，并迅速冷卻到40°C，加入1% (w/v)上述制作的瓊膠酶，40°C，酶解反應40h ;將酶解液在10000r/min離心20min，取上清液于lOKDa超濾膜上進行過濾，收集過濾液，凍干，即得到瓊膠寡糖。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株溶藻弧菌（<i>Vibrio</i><i>？alginolyticus</i>）A-001，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，其保藏編號為？CCTCC？M2015555，保藏日期：2015.9.18，以及用該菌株產生的瓊膠酶制備瓊膠寡糖的方法。本發(fā)明以該菌株作為菌種，采用碳源、氮源、無機鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基產酶，發(fā)酵液通過硫酸銨進行鹽析，離心，透析，過離子交換柱及凝膠柱，制得酶干粉，并用瓊膠酶和0.5%的瓊膠底物反應，于超濾膜上過濾，收集濾液、凍干，即獲得瓊膠寡糖。CCTCC NO:M201555520150918
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/63, C12P19/14
【公開號】CN105349461
【申請?zhí)枴緾N201510832586
【發(fā)明人】鄭寶東, 張林林, 江玉姬, 張龍濤, 張怡, 郭娟娟, 王培森, 李慶旺
【申請人】福建農林大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月26日