一株產(chǎn)瓊膠酶溶藻弧菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及篩選一株產(chǎn)瓊膠酶溶藻弧菌及其制備瓊膠寡糖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瓊膠，還被稱為瓊脂，具有水溶性，是一種復(fù)雜的混合物，三大海藻多糖之一。由于瓊膠具有較好的穩(wěn)定性與膠凝性等特性，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用十分廣泛。隨著海藻多糖工業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，對(duì)瓊膠多糖降解酶的研究深度與廣度也在不斷加大。根據(jù)瓊膠酶對(duì)糖苷鍵作用點(diǎn)的差異可以將其分為α-瓊膠酶和瓊膠酶，這兩種酶分別裂解瓊膠糖的α-1，3糖苷鍵與β-1，4糖苷鍵，并獲得3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖和D-半乳糖。該類酶以瓊膠作為反應(yīng)底物，可利用其功能的特異性來獲得聚合度各異的瓊寡糖，如瓊?cè)?、瓊四糖、瓊五糖、新瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖，這些瓊膠寡糖具有抗氧化、抑制脂質(zhì)過氧化、減慢淀粉水解和保濕等化學(xué)特性。瓊膠酶及降解瓊膠的菌株也成為近年來海洋生物資源研究、開發(fā)的焦點(diǎn)之一。
[0003]瓊膠酶來源廣泛，目前獲得產(chǎn)瓊膠酶的海洋微生物主要集中在海水中富集篩選產(chǎn)瓊膠酶的菌株，如假單胞菌屬，交替假單胞菌屬，交替單胞菌屬，微顫菌屬，弧菌屬，鏈霉菌屬，噬細(xì)胞菌屬。海洋雜食動(dòng)物及其腸道微生物具有較高的藻類多糖降解酶開發(fā)潛力，目前在濱螺屬，海兔屬，冠海詹屬等腸道內(nèi)分離到降解瓊膠的酶。
[0004]瓊膠酶主要來源于海洋軟體動(dòng)物和海洋微生物。于1902年Gran首次從海水中篩選到瓊膠降解微生物一瓊膠假單胞菌(Psudomonas galatica)以來，研究人員已經(jīng)從海水系統(tǒng)中分離到多種不同屬種的瓊膠分解菌。如分勿如識(shí)艦細(xì)胞菌屬)(DuckworthM et al.，1968)、類假單胞菌屬)(Von Hofsten B et al.，1975)、Pseudomanas we 11 antypicum{井氏假單胞菌)(王選良，Streptomyces{鏈霉菌屬)(Bibb MJ et al.,(假單胞菌屬)(Belas R et al., 1989)、Vibr1(弧菌屬)(Aoki et al., 1990)、Altermonas agarlytics GJ1B (交替假單胞菌)(Potin etal., 1993)、Alterococcus{交替球菌屬)(Shieh WY et al., 1998)、Thalassomonas sp.JAMB-A33 (海洋嗜冷單胞菌)(Ohta et al.，2005)。因此篩選新的微生物制備瓊膠低聚糖成為當(dāng)前研究者的新任務(wù)。
[0005]我國(guó)海藻資源豐富，為開發(fā)生產(chǎn)瓊膠低聚糖奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，現(xiàn)在傳統(tǒng)工業(yè)上主要采用酸水解法生產(chǎn)瓊膠低聚糖，酶法生產(chǎn)瓊膠低聚糖的工業(yè)比較少，酸水解法生產(chǎn)瓊膠低聚糖存在很多不足，包括生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)操作繁瑣，降解成分復(fù)雜，水解產(chǎn)物不穩(wěn)定、不易純化，不利于瓊膠低聚糖的回收和利用。而酶法生產(chǎn)瓊膠低聚糖反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單、易于控制，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)的低聚糖產(chǎn)物均一且不易被破壞，有利于高效生產(chǎn)和回收特定的瓊膠低聚糖，現(xiàn)在酶法生產(chǎn)瓊膠低聚糖是成為產(chǎn)業(yè)界主要關(guān)注點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是篩選出一種產(chǎn)瓊膠酶的新菌株，并提供一種利用此菌株制備瓊膠酶生產(chǎn)瓊膠寡糖方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株篩選自海洋貝類腸道的細(xì)菌，可以用于制備瓊膠酶(agarase)，其分類命名為溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus) A_001，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，地址:武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2015555，保藏日期:2015.9.18。
[0008]微生物菌株的篩選與鑒定:
本發(fā)明從海洋貝類腸道采取樣液，接種到瓊脂篩選培養(yǎng)基上，于28°C倒置培養(yǎng)48h后，觀察菌落周圍現(xiàn)象，把周圍有顯著凹陷或者透明圈的菌落挑選出來，并在2216E斜面培養(yǎng)基上保存，得到可以降解瓊膠的菌株。將具有降解瓊膠的菌株用無菌牙簽接種在篩選培養(yǎng)基上，28 °C怛溫倒置培養(yǎng)48h后，用魯戈氏碘液進(jìn)行染色觀察。如果菌株產(chǎn)瓊膠酶可以降解瓊膠，則瓊膠被降解后不會(huì)被染色，而菌落周圍將形成透明圈，測(cè)定透明圈的直徑。取經(jīng)過純化的可降解瓊膠菌株，按無菌操作各挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有25mL種子培養(yǎng)基的三角瓶里，于28°C、150r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)24h，再分別取10mL種子培養(yǎng)液接種到90mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，150r/min搖床震蕩培養(yǎng)32h，將發(fā)酵好的培養(yǎng)液于5000r/min、4°C條件下離心15min，取上清液作為胞外酶粗酶液測(cè)定酶活力，篩選出酶活最高的菌株。最終篩選出目標(biāo)菌株，對(duì)其進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)和16srDNA序列分析，確定其屬于溶藻弧菌(alginolyticus )，命名為溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus') A-001。
[0009]用所述溶藻弧菌(Vibr1生產(chǎn)瓊膠酶生產(chǎn)瓊寡糖方法包括如下步驟:
(1)用250mL錐形瓶裝50-90mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于28°C，150rpm搖床培養(yǎng)15h后得到種子發(fā)酵液，所述種子培養(yǎng)基為:氯化鈉35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，瓊脂2.0g/L，七水硫酸亞鐵1 g/L，調(diào)節(jié)pH為7.5左右，自來水水配制。
[0010](2)用250mL錐形瓶裝90mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按5-10%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)32-60h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:氯化鈉35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，瓊脂2.0g/L，七水硫酸亞鐵1 g/L，調(diào)節(jié)pH為7自來水水配制。而后將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過4°C，10000r/min離心15min之后，取上清液。
[0011](3)在上清液中加入固體硫酸銨使飽和度達(dá)到30%_90%，進(jìn)行鹽析，置4°C冷室過夜，4°C，8000r/min 離心 20min 取沉淀。
[0012](4)將得到的沉淀加入0.02mol/L的Tris-HCI緩沖液中進(jìn)行溶解，離心取上清液，將收集的上清液放入透析袋中進(jìn)行透析，將透析液過預(yù)平衡的陰離子交換色譜DEAE-S印harose 卩卩柱(2.6。111 X 30cm)，用 480ml 的含 0.3-lMNaCl 的 Tris-HCI 緩沖液進(jìn)行線性洗脫，洗脫速度為1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，洗脫液以4.5mL/管分部收集。測(cè)定收集到的溶液的酶活，將有活性的部分合并，凍干，_20°C保藏備用。
[0013](5)取0.5g瓊脂，加入到盛有100ml蒸餾水的三角瓶中，加熱煮沸使瓊脂溶解，并迅速冷卻到40°C，加入1% (w/v)上述制作的瓊膠酶，40°C，酶解反應(yīng)40h。將酶解液在10000r/min離心20min，取上清液于lOKDa超濾膜上進(jìn)行過濾，收集過濾液，凍干，即得到瓊膠寡糖。
[0014]用該方法生產(chǎn)的瓊膠酶的檢測(cè)方法:
取步驟(2)得到含有瓊脂酶的上清液lmL，加入20mL的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(其中含有瓊膠0.2%)，置于40°C搖床中酶解60min，后加入2mLDNS試劑，沸水浴5_10min。冷卻至室溫后，用蒸餾水補(bǔ)齊刻度，使用分光光度計(jì)在520nm下進(jìn)行檢測(cè)。1U定義為lmin產(chǎn)生lug還原糖所需的酶量。
[0015]用該方法生產(chǎn)的瓊膠寡糖的檢測(cè)方法:
薄層層析法(