本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種噬菌蛭弧菌凍干粉的制備方法。

背景技術(shù)：

利用生物工程技術(shù)來(lái)預(yù)防和治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病已被人們廣泛使用。特別是蛭弧菌的應(yīng)用受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。由于噬菌蛭弧菌主要裂解革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性致病菌，且對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，相較于傳統(tǒng)的物理化學(xué)抗生素消除致病菌有明顯的優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)的物理化學(xué)抗生素在消滅有害病菌上存在著明顯的弊端，物理方法對(duì)各種致病菌的消除作用只能應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的某一環(huán)節(jié)，不能實(shí)現(xiàn)整個(gè)領(lǐng)域的覆蓋?；瘜W(xué)以及抗生素方法經(jīng)長(zhǎng)期使用后致病菌容易形成抗逆性，降低使用效果，同時(shí)也破壞抑制了有益菌群，存在潛在的環(huán)境危害，最終不能有效地控制、消除致病菌。所以，噬菌蛭弧菌已經(jīng)逐漸廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中水體治理，魚(yú)蝦蟹中弧菌的預(yù)防與治療，以及雞鴨類腸道疾病的控制。

由于噬菌蛭弧菌不生成芽孢，對(duì)環(huán)境要求苛刻，其存活的環(huán)境溫度為4～45℃，現(xiàn)在使用的噬菌蛭弧菌的生物制劑是液體生物制劑。由于在液態(tài)制劑中，隨著自身菌的不斷生長(zhǎng)繁殖，會(huì)導(dǎo)致液態(tài)機(jī)制中的新陳代謝產(chǎn)物不斷積累，ph值逐漸變化，雜菌也會(huì)日益增值。同時(shí)，當(dāng)環(huán)境溫度高于25℃，液態(tài)制劑中的噬菌蛭弧菌的活菌數(shù)迅速衰減，其療效也迅速下降，因此，液體制劑在常溫下的保質(zhì)期只有三、四個(gè)月左右，嚴(yán)重影響了該生物制品的推廣應(yīng)用。因此，人們開(kāi)始將蛭弧菌進(jìn)行凍干制備成凍干粉以便于長(zhǎng)期的保存。

現(xiàn)有專利(申請(qǐng)?zhí)?9112389.1)將噬菌蛭弧菌(活菌體)與糞鏈球菌的活菌體混合制備成菌懸液，在將制備好的菌懸液與保護(hù)劑按一定比例混合，其保護(hù)劑為蔗糖與明膠組合或者蔗糖與脫脂奶粉的組合。再將混合液進(jìn)行預(yù)凍、升華、解析后得到凍干粉，其蛭弧菌在凍干后損失近一個(gè)數(shù)量級(jí)，存活率為50～70％之間。該專利的保護(hù)劑成分簡(jiǎn)單，凍干粉噬菌蛭弧菌存活率不高，為50～70％。同時(shí)，沒(méi)有公開(kāi)具體凍干工藝，缺乏具體的操作指導(dǎo)。最后宿主為糞鏈球菌，宿主種類單一，對(duì)于蛭弧菌的保存效果一般。

現(xiàn)有專利(申請(qǐng)?zhí)?0112230.4)闡述了一種宿主為死宿主的凍干制備方法。噬菌蛭弧菌按照滅活宿主培養(yǎng)方法制成菌液，獲得噬菌蛭弧菌水劑。將噬菌蛭弧菌水劑與穩(wěn)定劑混合，獲得凍干混合液，進(jìn)行冷凍干燥。其中其凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉蔗糖穩(wěn)定劑，冷凍干燥的溫度為-50℃～37℃。預(yù)凍溫度為-20～-50℃。但是，噬菌蛭弧菌宿主為致死的福氏志賀氏痢疾菌或者是大腸桿菌。使用滅活的宿主培養(yǎng)的蛭弧菌其侵染能力較弱，同時(shí)使用氯仿進(jìn)行滅活存在潛在的環(huán)境危害，同時(shí)宿主為福氏賀氏痢疾菌或大腸桿菌均具有較強(qiáng)的致病性，如果滅活不徹底對(duì)環(huán)境具有強(qiáng)大的破壞性。同時(shí)，凍干保護(hù)劑組分簡(jiǎn)單，專利中未提及凍干存活率是多少，凍干效果未知，存在明顯的不確定性，缺乏參考性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種存活率高、粉末狀的噬菌蛭弧菌凍干制劑的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

a.噬菌蛭弧菌菌懸液的獲得：按照噬菌蛭弧菌的常規(guī)培養(yǎng)方法獲得菌液，宿主為無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌，或者是將有害宿主分離后的噬菌蛭弧菌菌懸液；

b.保護(hù)劑溶液的配制：將保護(hù)劑溶液與所述步驟a的噬菌蛭弧菌菌懸液按照1：1體積比例混合，制得噬菌蛭弧菌待凍干混合液；

c.待凍干混合液的冷凍干燥：

將所述噬菌蛭弧菌待凍干混合液放置于真空冷凍干燥器中進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得噬菌蛭弧菌凍干制劑；

d.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，沖惰性氣體，使得制劑最終變成粉末狀；

e.將上述噬菌蛭弧菌凍干粉制劑在真空條件下或者填充惰性氣體的條件下進(jìn)行密封包裝，制得噬菌蛭弧菌凍干粉制劑成品。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述步驟a無(wú)致病性宿主為：枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸片球菌、乳酸鏈球菌、屎腸球菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌或戊糖片球菌的一種或幾種。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述步驟a的噬菌蛭弧菌菌懸液為含有無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌的噬菌蛭弧菌菌懸液。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述無(wú)致病性革蘭氏陰性菌來(lái)源為宿主本身或通過(guò)人工添加獲得，最終噬菌蛭弧菌與無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌數(shù)量比例為：1:10～1：100。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述的無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌為枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸片球菌、乳酸鏈球菌、屎腸球菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌或戊糖片球菌的一種或幾種。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述步驟b的保護(hù)劑溶液配制方法為，使用滅菌的純化水分別溶解脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、海藻糖、甘露醇、天門(mén)冬氨酸，使得其最終質(zhì)量濃度分別為2％～10％，2％～10％，2％～4％、2％～6％、2％～8％。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述步驟c中噬菌蛭弧菌菌懸液與保護(hù)劑溶液的混合體積比為1:1～1:2。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述步驟d對(duì)所述凍干制劑處理的參數(shù)為預(yù)凍溫度為-30～-20℃，預(yù)凍時(shí)間為2～5小時(shí)，冷凍干燥過(guò)程溫度范圍為-15～37℃，真空范圍為0.05毫巴～0.2毫巴，凍干時(shí)間為24～48小時(shí)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)方法中，所述步驟d中對(duì)所述塊狀的凍干制劑的性狀為：疏松的塊狀結(jié)構(gòu)，含水量為1～5％，存活率大于85％。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法獲得的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)、本發(fā)明通過(guò)多種凍干保護(hù)劑的復(fù)配，提高了蛭弧菌的凍干存活率。

2)、其次，本發(fā)明的噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的性狀為粉末狀，有利于凍干粉制劑的分散，即：根據(jù)實(shí)際使用需要，通過(guò)其他粉末進(jìn)行噬菌蛭弧菌粉制劑稀釋，已達(dá)到更好的使用效果。

3)最后，通過(guò)添加有益生態(tài)環(huán)境的宿主，不僅提高了凍干粉中噬菌蛭弧菌蛭弧菌復(fù)蘇的速度以及穩(wěn)定性。同時(shí)，在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中也發(fā)揮了積極的作用，不僅沒(méi)有潛在的環(huán)境危害，而且還有利于環(huán)境的保護(hù)。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了噬菌蛭弧菌凍干制劑的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

a.噬菌蛭弧菌菌懸液的獲得：按照噬菌蛭弧菌的常規(guī)培養(yǎng)方法獲得菌液，宿主為無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌，或者是將有害宿主分離后的噬菌蛭弧菌菌懸液；

b.保護(hù)劑溶液的配制：將保護(hù)劑溶液與所述步驟a的噬菌蛭弧菌菌懸液按照1：1體積比例混合，制得噬菌蛭弧菌待凍干混合液；

c.待凍干混合液的冷凍干燥：

將所述噬菌蛭弧菌待凍干混合液放置于真空冷凍干燥器中進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得噬菌蛭弧菌凍干制劑；

d.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，沖惰性氣體，使得制劑最終變成粉末狀；

e.將上述噬菌蛭弧菌凍干粉制劑在真空條件下或者填充惰性氣體的條件下進(jìn)行密封包裝，制得噬菌蛭弧菌凍干粉制劑成品。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟a中的無(wú)致病性宿主為：枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸片球菌、乳酸鏈球菌、屎腸球菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌或戊糖片球菌的一種或幾種。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟a的噬菌蛭弧菌菌懸液為含有無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌的噬菌蛭弧菌菌懸液。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述無(wú)致病性革蘭氏陰性菌來(lái)源為宿主本身或通過(guò)人工添加獲得，最終噬菌蛭弧菌與無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌數(shù)量比例為：1:10～1：100。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述的無(wú)致病性的革蘭氏陰性菌為枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸片球菌、乳酸鏈球菌、屎腸球菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌或戊糖片球菌的一種或幾種。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟b的保護(hù)劑溶液配制方法為，使用滅菌的純化水分別溶解脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、海藻糖、甘露醇、天門(mén)冬氨酸，使得其最終質(zhì)量濃度分別為2％～10％，2％～10％，2％～4％、2％～6％、2％～8％。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟c中噬菌蛭弧菌菌懸液與保護(hù)劑溶液的混合體積比為1:1～1:2。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟d對(duì)所述凍干制劑處理的參數(shù)為預(yù)凍溫度為-30～-20℃，預(yù)凍時(shí)間為2～5小時(shí)，冷凍干燥過(guò)程溫度范圍為-15～37℃，真空范圍為0.05毫巴～0.2毫巴，凍干時(shí)間為24～48小時(shí)。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟d中對(duì)所述塊狀的凍干制劑的性狀為：疏松的塊狀結(jié)構(gòu)，含水量為1～5％，存活率大于85％。

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)工藝1

a.噬菌蛭弧菌菌懸液的獲得。

常規(guī)培養(yǎng)方法：取50ml的蛭弧菌液(10⁷pfu/ml)與50ml地衣芽孢桿菌液(10⁸cfu/ml)混合，接種于20升發(fā)酵罐，裝液量為10升，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣量為10l/l/min，發(fā)酵3天，得到蛭弧菌發(fā)酵液

蛭弧菌發(fā)酵液培養(yǎng)配方：1％蛋白胨，0.3％牛肉膏，0.5％氯化鈉，0.3％酵母粉。

發(fā)酵結(jié)束后，向發(fā)酵液添加1升枯草芽孢桿菌菌液(10¹³cfu/ml)，保證噬菌蛭弧菌與枯草芽孢桿菌數(shù)量比例為：1:10。

b.保護(hù)劑溶液的配制與凍干液的制備

保護(hù)劑溶液配制過(guò)程為，使用滅菌的10升純化水分別溶解脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、海藻糖、甘露醇、天門(mén)冬氨酸，使得其最終質(zhì)量濃度分別為2％，2％，2％、2％、2％。將保護(hù)劑溶液與a工藝過(guò)程的噬菌蛭弧菌菌懸液按照1：1體積比例混合，制得20升噬菌蛭弧菌待凍干混合液；

c.噬菌蛭弧菌凍干制劑的制備

將工藝b中的噬菌蛭弧菌待凍干混合液放入東富龍真空冷凍干燥器(lyo-2m²)內(nèi)進(jìn)行凍干，其預(yù)凍溫度為-30℃，預(yù)凍時(shí)間為2小時(shí)，真空度為0.2毫巴，其中一次升華的溫度為-15℃，時(shí)間為24小時(shí)，二次升華溫度為10℃，時(shí)間為24小時(shí)，最后獲得800g凍干制劑為疏松的塊狀結(jié)構(gòu)，其含水量為5％，蛭弧菌存活率為95％

d.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，使用氮?dú)馄客ㄟ^(guò)流量計(jì)控制氣體流量，以0.5l/min的速度給真空包裝好的凍干粉沖氮?dú)猓钡桨b袋鼓起來(lái)為止，如此充氣抽真空，使得凍干制劑最終變成粉末狀，最終蛭弧菌存活率為95％。

實(shí)施例2噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)工藝2

a.噬菌蛭弧菌菌懸液的獲得。

按照噬菌蛭弧菌的如下常規(guī)培養(yǎng)方法獲得菌液

常規(guī)培養(yǎng)方法：取100ml的蛭弧菌液(10⁷pfu/ml)與100ml地衣芽孢桿菌液(10⁸cfu/ml)混合，接種于30升發(fā)酵罐，裝液量為20升，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣量為20l/l/min，發(fā)酵3天，得到蛭弧菌發(fā)酵液

蛭弧菌發(fā)酵液培養(yǎng)配方：1％蛋白胨，0.3％牛肉膏，0.5％氯化鈉，0.3％酵母粉。

發(fā)酵結(jié)束后，向發(fā)酵液添加1升地衣芽孢桿菌菌液(10¹³cfu/ml)，保證噬菌蛭弧菌與地衣芽孢桿菌數(shù)量比例為：1:100。

b.保護(hù)劑溶液的配制與凍干液的制備

保護(hù)劑溶液配制過(guò)程為，使用20升滅菌的純化水分別溶解脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、海藻糖、甘露醇、天門(mén)冬氨酸，使得其最終質(zhì)量濃度分別為5％，5％，5％、5％、5％。將保護(hù)劑溶液與a工藝過(guò)程的噬菌蛭弧菌菌懸液按照1：1體積比例混合，制得40升噬菌蛭弧菌待凍干混合液；

c.噬菌蛭弧菌凍干制劑的制備

將工藝b中的噬菌蛭弧菌待凍干混合液放入東富龍真空冷凍干燥器(lyo-2m²)內(nèi)進(jìn)行凍干，其預(yù)凍溫度為-25℃，預(yù)凍時(shí)間為4小時(shí)，真空度為0.2毫巴，其中一次升華的溫度為-5℃，時(shí)間為18小時(shí)，二次升華溫度為25℃，時(shí)間為18小時(shí)，最后獲得1600g凍干制劑為疏松的塊狀結(jié)構(gòu)，其含水量為5％，蛭弧菌存活率為95％

d.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，使用氮?dú)馄客ㄟ^(guò)流量計(jì)控制氣體流量，以0.5l/min的速度給真空包裝好的凍干粉沖氮?dú)?，直到包裝袋鼓起來(lái)為止，如此充氣抽真空，使得凍干制劑最終變成粉末狀；

e.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，沖惰性氣體，使得凍干制劑最終變成粉末狀。

實(shí)施例3噬菌蛭弧菌凍干粉制劑的生產(chǎn)工藝3

a.噬菌蛭弧菌菌懸液的獲得。

按照噬菌蛭弧菌的常規(guī)培養(yǎng)方法獲得菌液

常規(guī)培養(yǎng)方法：取50ml的蛭弧菌液(10⁷pfu/ml)與50ml糞腸球菌菌液(10⁸cfu/ml)混合，接種于10升發(fā)酵罐，裝液量為5升，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為5l/l/min，發(fā)酵3天，得到蛭弧菌發(fā)酵液.

蛭弧菌發(fā)酵液培養(yǎng)配方：1％蛋白胨，0.3％牛肉膏，0.5％氯化鈉，0.3％酵母粉。

b.保護(hù)劑溶液的配制與凍干液的制備

保護(hù)劑溶液配制過(guò)程為，使用10升滅菌的純化水分別溶解脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、海藻糖、甘露醇、天門(mén)冬氨酸，使得其最終質(zhì)量濃度分別為10％，10％，10％、10％、10％。將保護(hù)劑溶液與a工藝過(guò)程的噬菌蛭弧菌菌懸液按照1：2體積比例混合，制得15升噬菌蛭弧菌待凍干混合液；

c.噬菌蛭弧菌凍干制劑的制備

將工藝b中的噬菌蛭弧菌待凍干混合液放入東富龍真空冷凍干燥器(lyo-2m²)內(nèi)進(jìn)行凍干，其預(yù)凍溫度為-20℃，預(yù)凍時(shí)間為5小時(shí)，真空度為0.1毫巴，其中一次升華的溫度為0℃，時(shí)間為15小時(shí)，二次升華溫度為37℃，時(shí)間為15小時(shí)，最后獲得1200g凍干制劑為疏松的塊狀結(jié)構(gòu)，其含水量為5％，蛭弧菌存活率為93％

d.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，使用氮?dú)馄客ㄟ^(guò)流量計(jì)控制氣體流量，以0.5l/min的速度給真空包裝好的凍干粉沖氮?dú)猓钡桨b袋鼓起來(lái)為止，如此充氣抽真空，使得凍干制劑最終變成粉末狀；

e.將塊狀的凍干制劑進(jìn)行反復(fù)抽真空，沖惰性氣體，使得凍干制劑最終變成粉末狀。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。