一種高效篩選低溫噬菌體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于從環(huán)境中高效篩選低溫噬菌體的經(jīng)濟(jì)適用方法，可反復(fù)利用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，通過雙層平板法篩選低溫噬菌體，其采用的改良的PYGV底層培養(yǎng)基為組分含量為常規(guī)PYGV培養(yǎng)基組分含量1/10的培養(yǎng)基或者為缺少2×維生素和/或25%D-葡萄糖的1/10PYGV培養(yǎng)基，該方法所用培養(yǎng)基含量?jī)H為普通方法的1/30，不但節(jié)約成本、經(jīng)濟(jì)，而且效率很高，在同樣的培養(yǎng)時(shí)間和空間內(nèi)，可提高效率近2.5倍，適用于實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)代生物工程中環(huán)境中低溫噬菌體的分離等領(lǐng)域。
【專利說明】一種高效篩選低溫噬菌體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于篩選低溫噬菌體的高效、經(jīng)濟(jì)的方法，特別涉及一種以六孔細(xì)胞板替代雙層平板培養(yǎng)平皿以及利用改良的貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基篩選低溫曬菌體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在，其總量達(dá)IO31單位，對(duì)生物尤其是其他微生物的進(jìn)化影響深刻。噬菌體由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因組小、便于操作等優(yōu)點(diǎn)，常常被用作生物基因復(fù)制及表達(dá)調(diào)控研究的模型，對(duì)近現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展做出了突出的貢獻(xiàn)。
[0003]從自然環(huán)境溫度來看，低溫環(huán)境分布最廣，生物圈約80%以上為常年低于5°C的低溫地區(qū)，而噬菌體在低溫生物圈包括極地水環(huán)境、海洋、高原湖泊以及冰雪冰川等生境中的豐度非常高，通常能達(dá)到IO5-1O8mI'低溫噬菌體是指在小于等于4°C的條件下能侵染宿主并增殖的細(xì)菌病毒。在這些低溫環(huán)境中，低溫噬菌起著非常重要的生態(tài)作用。近年來，由于氣候變暖，給全球水生生物圈如海洋、湖泊、冰川、濕地等帶來了非常顯著的影響，而低溫噬菌體作為這類環(huán)境中的一個(gè)重要的動(dòng)態(tài)組成部分，就其多樣性研究及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用受到了科學(xué)家的高度重視，也是目前現(xiàn)代微生物學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。因此，分離和鑒定有價(jià)值的低溫噬菌體及其功能基因已成為當(dāng)代國(guó)際微生物研究領(lǐng)域的重要工作。
[0004]傳統(tǒng)的常溫及高溫噬菌體分離篩選通常是利用直徑為9 cm的平板，通過雙層瓊脂平板法分離噬菌體:底層平板為固體培養(yǎng)基，上層半固體培養(yǎng)基以瓊脂作為凝固劑。雙層平板法又叫雙層瓊脂平板法，先在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中倒入底層固體培養(yǎng)基，凝固后待用。融化上層培養(yǎng)基，待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至50°C左右時(shí)，每管中加入敏感指示菌菌液，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液，混合后立即倒入上層平板鋪平。培養(yǎng)一段時(shí)間后，如有噬菌體，則在雙層培養(yǎng)基的上層出現(xiàn)透亮無菌圓形空斑一噬菌斑，計(jì)算噬菌斑的數(shù)量。雙層平板法需要分別制作兩次平板，大量使用時(shí)需要耗費(fèi)大量時(shí)間來制備。
[0005] 目前報(bào)道的低溫噬菌體的分離培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基、PYGV培養(yǎng)基等，本發(fā)明利用改良的PYGV培養(yǎng)基分離得到的低溫噬菌體多于PYGV培養(yǎng)基分離到的低溫噬菌體，而且節(jié)約成本；同時(shí)，六孔細(xì)胞培養(yǎng)板具有良好的透明度，適用于觀察噬菌斑。以六孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離噬菌體經(jīng)濟(jì)、適用、提高效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在于提供一種經(jīng)濟(jì)、適用、大量快速篩選低溫噬菌體的方法，該方法上層半固體平板是以瓊脂糖而不是瓊脂作為培養(yǎng)基的組分配制而成；二是分離培養(yǎng)基采用貧營(yíng)養(yǎng)的1/10含量PYGV固體培養(yǎng)基或者為缺少2 X維生素和/或25% D-葡萄糖的1/10含量PYGV培養(yǎng)基。[0007]本發(fā)明方法的具體步驟如下:
(1)低溫宿主菌的分離將采集的土樣或水樣，通過常規(guī)稀釋平板法在改良的PYGV培養(yǎng)基上、15_28°C條件下分離純化得到不同種類的低溫宿主菌，將分離得到的低溫宿主菌分別接種到改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，10-28°C下150rpm培養(yǎng)10_18h，直到宿主菌的濃度達(dá)到107-109CFU/ml ；
(2)噬菌體富集液的制備
將采集的土樣或水樣加入到改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，置于4-15°C靜置培養(yǎng)1-2周，吸取富集液，離心去除菌體，然后通過0.22 μ m的濾膜過濾，濾液即為噬菌體富集液，用于噬菌體的分離，其中樣品和液體培養(yǎng)基混合的比列為5-10g 土樣或5-10ml水樣加入到IOOml培養(yǎng)基；
(3)雙層平板法分離低溫噬菌體
采用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為培養(yǎng)皿，先在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中倒入改良的PYGV底層培養(yǎng)基，凝固后待用；
上層半固體培養(yǎng)基采用3-5g/L的瓊脂糖作為凝固劑，其余成分同改良的PYGV底層培
養(yǎng)基;
分離低溫噬菌體:將100-300 μ I噬菌體富集液分別與200-400 μ I不同宿主菌菌液混合，10-28°C靜置10-30min，然后加入2_3mL加熱融化并冷卻至20_30°C上層半固體培養(yǎng)基，混勻，倒入改良的PYGV底層培養(yǎng)基上，形成雙層平板，10-28°C培養(yǎng)2-3d，觀察噬菌斑產(chǎn)生情況； (4)低溫噬菌體純化
用牙簽挑取單個(gè)噬菌斑，接種于液體PYGV培養(yǎng)基中，經(jīng)稀釋后重復(fù)噬菌斑實(shí)驗(yàn)，直至噬菌斑的大小和形態(tài)特征保持均勻和一致，即得到純化的低溫噬菌體；
其中所述改良的PYGV底層培養(yǎng)基為1/10PYGV培養(yǎng)基，即組分含量為常規(guī)PYGV培養(yǎng)基組分含量1/10的培養(yǎng)基(不包括瓊脂，瓊脂的量為15-20g/L)，或者為缺少2 X維生素和/或25% D-葡萄糖的1/10PYGV培養(yǎng)基。
[0008]1/10 PYGV培養(yǎng)基即為除瓊脂外的組分含量為常規(guī)PYGV培養(yǎng)基組分含量1/10的培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基瓊脂的使用量為15-20g/L，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂。
[0009]本發(fā)明中所述噬菌體富集液的滴度為105_107PFU/ml。
[0010]本發(fā)明中所述常規(guī)PYGV培養(yǎng)基的成分包括如下:
蛋白腺 10g/L,酵母提取物 5g/L, Hutner’ basal 20mL/L, 25% D-葡萄糖 10mT,/T,, 2X維生素5m/L ；
其中:Hutner’ basal營(yíng)養(yǎng)離子鹽溶液為:MgSO4.7H20 29.7g/L，氮三乙酸lOg/L,CaCl2.2Η20 3.35g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 99mg/L, (NH4) 6Mo7024.4H20 9.25mg/L, Metals 44 50ml/L ；
Metals 44 溶液成份為:ZnSO4.7Η20 10.95g/L, FeSO4.7Η20 5g/L, Sodium EDTA 2.5g/L, MnSO4.H2O 1.54g/L, CuSO4.5H20 392mg/L, Co (NO3) 2.6H20 248mg/L, Na2B4O7.IOH2O177mg/L ；
2X維生素溶液配方如下:鹽酸維生素B6 20mg/L, p_對(duì)氨基苯甲酸10mg/L,泛酸鈣10mg/L,煙酰胺10mg/L,維生素B2 10mg/L,鹽酸硫胺素10mg/L,生物素4mg/L,葉酸4mg/L，維生素 B12 0.2mg/L。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下:
傳統(tǒng)雙層平板的缺陷，以直徑為9cm的培養(yǎng)皿來分離低溫噬菌體，制作下層平板時(shí)需要一塊一塊的制作平板。操作麻煩，花費(fèi)時(shí)間較多，同時(shí)增加了培養(yǎng)基染菌的風(fēng)險(xiǎn)。而用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板來分離低溫噬菌體制板時(shí)一次可以得到相當(dāng)于6個(gè)9cm的培養(yǎng)皿所得的平板，大大增加了效率；在倒上層平板時(shí)，不能讓半固體培養(yǎng)基溫度過低，否則瓊脂糖凝固會(huì)造成實(shí)驗(yàn)失敗，使用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí)，速度提升了，由于瓊脂糖凝固而造成實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)大大降低。
[0012]在分離低溫噬菌體的過程中，往往需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，使其中的病毒達(dá)到一個(gè)合適的豐度，以便形成清晰的噬菌斑，進(jìn)行后續(xù)的分離鑒定。在分離之初，對(duì)原始樣品中的病毒豐度難以精確估計(jì)，不好確定稀釋梯度，所以一次要用很多的平板來做平行梯度。利用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板來做分離，可以在一塊板上做六個(gè)梯度，并且便于同一組稀釋梯度之間的比較。在初期盲篩低溫噬菌體的過程中，這種高通量的篩選辦法大大減少了工作量，提高了效率。
[0013]低溫環(huán)境通常為貧(寡)營(yíng)養(yǎng)的，因此本發(fā)明采用改良的貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基PYGV來分離低溫噬菌體，而在實(shí)際操作中僅使用1/10含量改良的培養(yǎng)基即可達(dá)到較好的分離效果，本發(fā)明利用培養(yǎng)細(xì)胞的六孔板來分離低溫噬菌體，細(xì)胞培養(yǎng)板不但提供細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境，還具有更好的透明度，適用于觀察噬菌斑。該方法所用培養(yǎng)基含量較少，不但節(jié)約成本、經(jīng)濟(jì)，而且節(jié)省培養(yǎng)空間，在相同的培養(yǎng)時(shí)間和空間中，可提高效率近2.5倍。
[0014]本發(fā)明中用0.3-0.5%的瓊脂糖代替瓊脂作為凝固劑，作為膠凝劑的瓊脂糖是不含硫酸酯(鹽)的非離子型多糖 ，是形成凝膠的組分。瓊脂糖在水中一般加熱到90°C以上溶解，溫度下降到35°C左右時(shí)形成良好的半固體狀的凝膠，低熔點(diǎn)瓊脂糖的凝固溫度可以低到8-17°C。因此相對(duì)于瓊脂而言，瓊脂糖的凝固溫度更低，適合低溫噬菌體的分離；而分離常溫及高溫噬菌體采用的瓊脂，其形成凝膠的溫度在40°C以上，不適合分離低溫噬菌體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明采用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離低溫噬菌體結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖，用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1:改良的PYGV培養(yǎng)基篩選分離低溫噬菌體的方法，具體內(nèi)容如下:
(1)低溫宿主菌的分離:將采集自云南省納帕海濕地的土樣或水樣，采用固體改良的PYGV培養(yǎng)基通過稀釋平板法在15°C下分離不同的低溫細(xì)菌，劃線得到單菌落，作為可能的宿主菌，用無菌接種環(huán)挑取一環(huán)單菌落，接種于改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，15°C，150rpm培養(yǎng)16h，直到宿主菌的濃度達(dá)到約108CFU/ml ；
(2)噬菌體富集液的制備
將采集自云南省納帕海濕地的土樣或水樣加入到改良的液體PYGV培養(yǎng)基中(其中IOg土樣加入到IOOml培養(yǎng)基中，IOml水樣加入到IOOml培養(yǎng)基中)，置于15°C靜置培養(yǎng)1_2周，吸取富集液，5000rpm離心5min以去除菌體，然后通過0.22 μ m的濾膜過濾，濾液即為噬菌體富集液，用于噬菌體的分離；
(3)雙層平板法分離低溫噬菌體
采用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為培養(yǎng)皿，先在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中倒入改良的PYGV底層培養(yǎng)基，凝固后待用；
上層半固體培養(yǎng)基采用4g/L的瓊脂糖作為凝固劑，其余成分同改良的PYGV底層培養(yǎng)
基;
分離噬菌體:將100 μ I噬菌體濾液(滴度107PFU/ml)分別與200 μ I不同宿主菌菌液(濃度108CFU/ml)混合，15°C靜置lOmin，然后加入2mL左右加熱融化并冷卻至30°C上層半固體培養(yǎng)基，混勻，倒入改良的PYGV底層培養(yǎng)基上，形成雙層平板，15°C培養(yǎng)2-3d，觀察噬菌斑產(chǎn)生情況；
(4)噬菌體純化
用牙簽挑取單個(gè)噬菌斑，浸泡于改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，經(jīng)稀釋后重復(fù)噬菌斑實(shí)驗(yàn)，直至噬菌斑的大小和形態(tài)特征保持均勻和一致，即得到純化的噬菌體；
其中改良的PYGV培養(yǎng)基為除瓊脂外組分含量為常規(guī)PYGV培養(yǎng)基組分含量1/10的培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基瓊脂的使用量為15g/L，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂。
[0018]分離到的低溫噬菌體種類結(jié)果見表1和表5，從表1和表5可以看到采用改良后的培養(yǎng)基分離效果優(yōu)于完全培養(yǎng) 基，篩選得到16種低溫曬菌體,大多為肌尾科曬菌體，也分離到少量的長(zhǎng)尾、復(fù)層及短尾科噬菌體；其宿主菌分別屬于假單胞菌屬、黃桿菌屬、微小桿菌屬、芽孢桿菌屬及節(jié)桿菌屬的菌株。
[0019]表1:改良的PYGV培養(yǎng)基I分離到的低溫細(xì)菌及低溫噬菌體
【權(quán)利要求】
1.一種高效篩選低溫噬菌體的方法，其特征在于具體操作步驟如下: (1)低溫宿主菌的分離 將采集的土樣或水樣，通過常規(guī)稀釋平板法在改良的PYGV培養(yǎng)基上、15-28°C條件下分離純化得到不同種類的低溫宿主菌，將分離得到的低溫宿主菌分別接種到改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，10-28°C下150rpm培養(yǎng)10_18h，直到宿主菌的濃度達(dá)到107_109CFU/ml ； (2)噬菌體富集液的制備 將采集的土樣或水樣加入到改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，置于4-15°C靜置培養(yǎng)1-2周，吸取富集液，離心去除菌體，然后通過0.22 μ m的濾膜過濾，濾液即為噬菌體富集液，用于噬菌體的分離，其中樣品和液體培養(yǎng)基混合的比例為5-10g 土樣或5-10ml水樣加入到IOOml培養(yǎng)基； (3)雙層平板法分離低溫噬菌體 采用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為培養(yǎng)皿，先在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中倒入改良的PYGV底層培養(yǎng)基，凝固后待用； 上層半固體培養(yǎng)基采用3-5 g/L的瓊脂糖作為凝固劑，其余成分同改良的PYGV底層培養(yǎng)基; 分離低溫噬菌體:將100-300 μ I噬菌體富集液分別與200-400 μ I不同宿主菌菌液混合，10-28°C靜置10-30 min，然后加入2-3mL加熱融化并冷卻至20-30°C上層半固體培養(yǎng)基，混勻，倒入改良的PYGV底層培養(yǎng)基上，形成雙層平板，10-28°C培養(yǎng)2-3d，觀察噬菌斑產(chǎn)生情況；. (4)低溫噬菌體純化 挑取單個(gè)噬菌斑，接種于改良的液體PYGV培養(yǎng)基中，經(jīng)稀釋后重復(fù)噬菌斑實(shí)驗(yàn)，直至噬菌斑的大小和形態(tài)特征保持均勻和一致，即得到純化的低溫噬菌體； 其中所述改良的PYGV底層培養(yǎng)基為組分含量為常規(guī)PYGV培養(yǎng)基組分含量1/10的培養(yǎng)基或者為缺少2X維生素和/或25% D-葡萄糖的1/10PYGV培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效篩選低溫噬菌體的方法，其特征在于:噬菌體富集液的滴度為 105-107PFU/ml。
【文檔編號(hào)】C12R1/92GK103468646SQ201310393024
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】崔尹贍, 季秀玲, 魏云林, 林連兵, 張琦 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)