用于檢測哈維弧菌群的基因芯片及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測海洋致病菌的基因芯片,尤其是涉及用于檢測哈維弧菌群的基因 芯片及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 哈維弧菌群是弧菌屬的核心類群,是引起海水養(yǎng)殖魚蝦貝類病害發(fā)生的最常見病 原菌,包括溶藻弧菌(mio 坎氏弧菌(K 哈維弧菌(K AarKeja·)、需鈉弧菌(Kirie供、副溶血弧菌(K 和輪蟲弧菌(K roii/kriafflAs·)。哈維弧菌群不但能經(jīng)常引起水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的暴發(fā),給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大 經(jīng)濟(jì)損失;同時(shí)也能通過接觸海水、生食海鮮或進(jìn)食被該菌污染的食物而引起人類疾病。哈 維弧菌群具有高度相似的表型和基因型,無法在種水平上進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。因此,在種 水平上快速鑒定弧菌病原菌對于及早采取針對性防治措施,減輕病害損失具有重要意義。 細(xì)菌16SrRNA基因常被用于細(xì)菌的種屬鑒定,但哈維弧菌群各種的基因組內(nèi)16SrRNA基 因是多拷貝的,通常在8-14個(gè)之間;而且,基因組內(nèi)不同拷貝16SrRNA基因的差別會(huì)大于 種間差別,給種的鑒定帶來極大混亂。
[0003] 基因芯片技術(shù)基本原理是在固相支持物上固定核酸,通過雜交過程來檢測樣品中 靶基因序列的存在,并通過檢測熒光信號達(dá)到半定量的目的。該技術(shù)具有高度的并行性、多 樣性和特異性等特點(diǎn),是高效、快速、大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段。利用該技術(shù)可 以在數(shù)分鐘至幾小時(shí)內(nèi)完成傳統(tǒng)生物學(xué)方法(包括分子生物學(xué)方法)數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年才 能完成的工作量。
[0004] 現(xiàn)有的基因芯片及其專利技術(shù)報(bào)道中,如"一種可并行檢測多種弧菌的基因芯片 及其監(jiān)測方法"(發(fā)明專利,CN103451310A,2013)和"一種用于檢測海產(chǎn)品中九種致病性弧 菌的基因芯片"(發(fā)明專利,CN103820558A,2014),雖然也報(bào)道了利用基因芯片技術(shù)檢測弧 菌,但是這類發(fā)明專利中所設(shè)計(jì)的探針多是針對16SrRNA基因和hsp60基因,而這類探針 并不能有效用于表型和基因型都高度相似,且無法在種水平上進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的哈維弧 菌群。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能并行性的快速高效檢測病原哈維弧菌 群的6種致病弧菌,且準(zhǔn)確性和靈敏度高、特異性強(qiáng)的用于檢測海水中哈維弧菌群的基因 芯片及其使用方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種用于檢測哈維弧菌群的基因 芯片,包括芯片載體,其特征在于:所述的芯片載體上固載有用于檢測溶藻弧菌、坎氏弧菌、 哈維氏弧菌、需鈉弧菌、副溶血弧菌和輪蟲弧菌的核苷酸探針,所述的用于檢測溶藻弧菌的 探針、所述的用于檢測坎氏弧菌的探針、所述的用于檢測哈維氏弧菌的探針、所述的用于檢 測需鈉弧菌的探針、所述的用于檢測副溶血弧菌的探針和所述的用于檢測輪蟲弧菌的探針 均使用基因?yàn)榘谢?,其中,溶藻弧菌?條探針覆蓋整個(gè)種,分別用2條探針覆蓋種 內(nèi)2個(gè)明顯差異的聚類分支。各探針的基因序列如下:
[0007] -種用于檢測哈維弧菌群的基因芯片的使用方法,包括待測哈維弧菌群待測樣品 DNA提取步驟;樣品PCR擴(kuò)增步驟;PCR產(chǎn)物與芯片雜交步驟,芯片雜交后的處理,雜交芯片 的掃描及結(jié)果判讀的步驟,其特征在于:所述的樣品PCR擴(kuò)增步驟中針對哈維弧菌群不同 菌種的基因所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增的正向引物和帶地高辛標(biāo)記的反向引物的基因序列如 下:
[0008] 所述的樣品PCR擴(kuò)增步驟中擴(kuò)增體系為:無菌水5. 3yL;10XPCR緩沖液1.5 yL;2. 5mMdNTP混合物1yL;10μΜ正向引物各0. 5yL;10μΜ反向引物各0. 5 yL;樣品DNA1yL;5U/yLrTaq酶 0· 2yL;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C4min;94°C30s; 56°C30s;72°C30s;35 個(gè)循環(huán);72°C4min。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明利用哈維群弧菌細(xì)胞內(nèi)的單拷貝保 守基因tox對故為靶標(biāo),通過設(shè)計(jì)針對溶藻弧菌、坎氏弧菌、哈維弧菌、需鈉弧菌、副溶血弧 菌和輪蟲弧菌的探針,制作可用于哈維菌群快速鑒定的基因芯片,采用多重PCR技術(shù)同時(shí) 擴(kuò)增6個(gè)弧菌的基因,在基因芯片上平行、快速地鑒定哈維弧菌群。所設(shè)計(jì)的基因芯片 能并行性的快速高效檢測病原哈維弧菌群的6種致病弧菌,并且具有更加特異和靈敏的特 點(diǎn)。此外,基因芯片的探針設(shè)計(jì)通過分析數(shù)據(jù)庫中所有的哈維弧菌群基因序列,設(shè)計(jì) 哈維弧菌群種特異性探針,顯著提高了檢測的特異性。本發(fā)明不但填補(bǔ)了利用基因芯片同 時(shí)檢測哈維弧菌群6個(gè)相似種的技術(shù)空白,更提高了這種海水養(yǎng)殖致病菌群的鑒別能力, 極大縮短了檢測的時(shí)間。
[0010] 綜上所述,本發(fā)明用于檢測哈維弧菌群的基因芯片可達(dá)到檢測哈維弧菌群的目 的,具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便和重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),成果的應(yīng)用可指導(dǎo)海水養(yǎng)殖病害機(jī)理的 研究以及相應(yīng)防治手段的快速應(yīng)用,降低病害損失。
【附圖說明】
[0011] 圖1為基因芯片上各探針位置; 圖2為溶藻弧菌ATCC17749τ特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖3為溶藻弧菌NBV00022特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖4為坎氏弧菌MCCC1Η0050Τ特異性引物基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖5為哈維弧菌MCCC1Η0031Τ特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖6為是需鈉弧菌MCCC1Η0025Τ特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖7為副溶血弧菌MCCC1Α02609Τ特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖8為輪蟲弧菌CA頂577τ特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖; 圖9為溶藻弧菌(ATCC17749τ)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖10為溶藻弧菌(NBV00022)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖11為坎氏弧菌(MCCC1Η0050Τ)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖12為哈維弧菌(MCCC1Η0031Τ)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖13為需鈉弧菌(MCCC1Η0025Τ)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖14為副溶血弧菌(MCCC1Α02609Τ)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖15為輪蟲弧菌(CA頂577τ)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖16為溶藻弧菌(ATCC17749τ)、溶藻弧菌(NBV00022)、坎氏弧菌(MCCC1Η0050Τ)、哈 維弧菌(MCCC1Η0031Τ)、需鈉弧菌(MCCC1Η0025Τ)、副溶血弧菌(MCCC1Α02609Τ)和輪蟲弧 菌(CA頂577τ)混合模版基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖17為溶藻弧菌(ATCC17749τ )、坎氏弧菌(MCCC1Η0050Τ)、哈維弧菌(MCCC1H0031T)、需鈉弧菌(MCCC1H0025T)、副溶血弧菌(MCCC1A02609T)和輪蟲弧菌(CAIM577τ) 混合模版檢測結(jié)果; 圖18為溶藻弧菌(ATCC17749τ)、溶藻弧菌(NBV00022)、坎氏弧菌(MCCC1Η0050Τ)、哈 維弧菌(MCCC1Η0031Τ)、需鈉弧菌(MCCC1Η0025Τ)和輪蟲弧菌(CA頂577Τ)混合模版基因 芯片檢測結(jié)果圖; 圖19為病原菌(XBF1001)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖20為病原菌(XBF1002)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖21為病原菌(XBF0906)的基因芯片檢測結(jié)果圖; 圖22為病原菌(XBF1004)的基因芯片檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0013] 具體實(shí)施例一 探針的制備 1、目標(biāo)檢測菌種及靶基因 本發(fā)明選擇海水養(yǎng)殖動(dòng)物中重要的常見病原菌-哈維弧菌群作為檢測對象,包括溶藻 弧菌、坎氏弧菌、哈維氏弧菌、需鈉弧菌、副溶血弧菌、輪蟲弧菌,各菌種均使用基因?yàn)?靶基因。
[0014] 2、探針設(shè)計(jì) 本發(fā)明采用18 - 30bp的寡核苷酸探針。探針參數(shù)基本要求是特異性和高效的雜交, 探針TJ直保持相近,在上下10°C范圍內(nèi)浮動(dòng);形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的連續(xù)互補(bǔ)堿基數(shù)少 于4個(gè)(值小于4. 5kcal/mol);探針與非目標(biāo)基因序列的連續(xù)匹配堿基數(shù)少于7個(gè)堿基; 探針與目標(biāo)基因的錯(cuò)配堿基數(shù)少于4個(gè)堿基。驗(yàn)證后的探針在5'端上加上16個(gè)T尾巴, 以減少DNA雜交時(shí)的空間位阻,提高雜交效率。同時(shí)在探針5'端進(jìn)行氨基修飾,與玻片上 的醛基交聯(lián),將探針固定在玻片上。
[0015] 本發(fā)明針對不同菌種的如冰基因共設(shè)計(jì)14條探針,在探針的5'端帶有16個(gè) P〇ly-T和氨基修飾(見表1所示)。每一種菌至少設(shè)計(jì)2條不同的探針,而溶藻弧菌有4條 探針分別檢測溶藻弧菌在進(jìn)化樹上的兩個(gè)不同亞種,每個(gè)亞種有2條不同的探針。
[0016] 表1探針信息表
[0017] 具體實(shí)施例二 利用上述具體實(shí)施例一設(shè)計(jì)的探針制備用于檢測哈維弧菌群的基因芯片,具體步驟如 下: 1、 探針母液的配制 將探針凍干粉用RNAase-free水(即DEPC處理水)配制成100μπι/L的母液,振蕩混勻 后,于4 °C、5000rpm/min離心lmin,得到探針母液,-20 °C保存; 2、 點(diǎn)樣前準(zhǔn)備 取0.2mL微量離心管,依次加入10μL的探針母液、10μL的點(diǎn)樣緩沖液(SSC),振蕩 混勻后,于4 °C、5000rpm/min離心1min,取上清加樣到384孔板中; 3、 點(diǎn)樣 確認(rèn)要點(diǎn)片的矩陣,并控制點(diǎn)樣儀的濕度(75%)和溫度(23°C),采用高精度機(jī)械手點(diǎn) 樣技術(shù),將探針點(diǎn)到醛基修飾的玻璃片上,每條探針重復(fù)4次; 4、點(diǎn)樣后處理 將點(diǎn)好的玻璃片放在裝有飽和氯化鈉溶液盒子中,于溫度30 °C、濕度75%的條件下放 置72時(shí);3天后,將點(diǎn)樣好的玻璃片放入雙蒸水中,于100 °C煮30s,即得到用于檢測哈維 弧菌群的基因芯片,取出該基因芯片自然晾干后,放入芯片盒內(nèi),4 °C保存。基因芯片上各 組探針的位置如圖1所示,采用高精度機(jī)械手點(diǎn)樣技術(shù),按照探針檢測陣列的設(shè)計(jì),將對應(yīng) 探針固定到醛基基片上。
[0018] 具體實(shí)施例三 上述具體實(shí)施例二制備得到的用于檢測哈維弧菌群的基因芯片的使用方法,具體步驟 如下: 1、樣品選取: 采用模式菌株:溶藻弧菌(ATCC17749τ)、坎氏弧菌(MCCC1H0050T)、哈維弧菌(MCCC1H0031T)、需鈉弧菌(MCCC1H0025T)、副溶血弧菌(MCCC1A02609T)和輪蟲弧菌(CAIM 577τ);環(huán)境菌株:溶藻弧菌(NBV00022);七種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)