一種溶藻弧菌的快速檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)品生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種溶藻弧菌的快速檢測試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 弧菌（Vibrio)是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌，廣泛分 布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內(nèi)。目前弧菌有91種。主要魚貝類致菌為： 溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌等；有些弧菌也能引起人類疾病如：溶藻 弧菌、創(chuàng)傷弧菌等。
[0003] 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常見的致病菌，對水生動物包 括魚類、雙殼貝類、甲殼類和棘皮動物等的養(yǎng)殖造成了巨大的損失。近年研究證實(shí)溶藻弧菌 也是沿海地區(qū)腹瀉病和食物中毒的常見病原菌，可引起人類食物中毒、中耳炎和敗血癥等。
[0004] 在水產(chǎn)品的致病微生物檢測中，溶藻弧菌逐漸成為進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫的關(guān)注對象， 其快速檢測技術(shù)具有重要意義。近幾年有檢測溶藻弧菌的多種方法報(bào)道，如酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)（ELISA)、免疫組化、PCR方法等，然而傳統(tǒng)PCR檢測需要經(jīng)過變性一退火一延伸，加上 DNA提取整個(gè)過程大概需要2-4小時(shí)才能得出結(jié)果。這些方法在成本、靈敏度、操作方便性 上存有缺陷，一定程度上限制了它們在生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用，新的分子生物學(xué)技術(shù)如DNA指 紋技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和DNA微陣列技術(shù)逐漸被應(yīng)用于弧菌病原的檢測，但這些技術(shù)對 儀器設(shè)備要求高，且需要專業(yè)操作，在適用性上具有局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于以溶藻弧菌特異性靶基因中與其毒力作用呈線性相關(guān)的主要 致病因子-aspA基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異性引物，實(shí)現(xiàn)定向擴(kuò)增，從而提供一種溶藻弧菌的 快速檢測試劑盒，用于實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確的檢測溶藻弧菌。
[0006] LAMP技術(shù)是一種新興的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核 酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶。LAMP技術(shù)在保持PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一 步增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性和縮短了檢測時(shí)間，特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，在等溫條 件下就能完成反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測。
[0007] 本發(fā)明利用LAMP技術(shù)結(jié)合溶藻弧菌的特異性靶基因，實(shí)現(xiàn)快速檢測，其主要原理 為：①設(shè)計(jì)一組能特異識別靶DNA的六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)引物（上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引 物）和兩個(gè)外引物（上游外引物和下游外引物），內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；② 其中一個(gè)內(nèi)引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成，在具有高度鏈置換活性的DNA 聚合酶的參與下，由一個(gè)外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個(gè) 內(nèi)引物和一個(gè)外引物啟動的DNA合成的模板，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA ;③內(nèi)引物以原始的 莖環(huán)DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一個(gè)新的有兩倍莖長 度的莖環(huán)DNA ;④在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個(gè)含有靶DNA 反復(fù)重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到IO9拷貝，最后通過加 入熒光染料來觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0008] -種溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，包括優(yōu)化的LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和 LAMP顯色液；其中，所述優(yōu)化的LAMP反應(yīng)液中含有引物，是通過GenBank公布的溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)aspA基因序列（DQ097160)與其它同源序列比對后，選取特異性 保守序列，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的。
[0009] 本發(fā)明所述的溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，其中，所述的LAMP反應(yīng)液中的引物包 括兩對，上游內(nèi)引物、上游外引物、下游內(nèi)引物、下游外引物：
[0010] 上游內(nèi)引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示；
[0011] 下游內(nèi)引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
[0012] 上游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
[0013] 下游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0014] 本發(fā)明所述的溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，其中，所述優(yōu)化的LAMP反應(yīng)液由如下 物質(zhì)構(gòu)成：Thernopo 1反應(yīng)緩沖液、I OmM dNTPs溶液、20μΜ上游內(nèi)引物、20μΜ下游內(nèi)引物、 10 μ M上游外引物、10 μ M下游外引物、4Μ甜菜堿溶液、36mM MgSO4、滅菌去離子水。
[0015] 本發(fā)明所述的溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，其中，所述Thernopol反應(yīng)緩沖液含 有20mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、IOmM氯化鉀、IOmM硫酸銨、2mM硫酸鎂、 0. 1 % 曲拉通 X-100。
[0016] 本發(fā)明所述的溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，其中，每微升所述Bst DNA聚合酶中含 有8個(gè)活性單位；所述LAMP顯色液中含有10% SYBR Green I的熒光染料。
[0017] 本發(fā)明所述的溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，其中，每個(gè)獨(dú)立包裝的所述優(yōu)化的 LAMP反應(yīng)液的體積為23微升，其中包括2. 5微升ThermoPol反應(yīng)緩沖液、1微升dNTPs溶 液、0. 5微升上游內(nèi)引物、0. 5微升下游內(nèi)引物、0. 25微升上游外引物、0. 25微升下游外引 物、3. 75微升甜菜堿溶液、4微升MgSO4、和10. 25微升滅菌去離子水。
[0018] 采用本發(fā)明所述的溶藻弧菌的快速檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法，包括如下步驟：
[0019] (1)細(xì)菌DNA的提?。?br>[0020] 取ImL過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，室溫8000rpm離心Imin收集菌體，按Ezup柱式細(xì)菌 基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取細(xì)菌DNA ;
[0021] (2)溶藻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：
[0022] a.在裝有23微升LAMP反應(yīng)液中加入1微升待檢摸板DNA，于恒溫水浴槽中95攝 氏度放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；
[0023] b.在反應(yīng)管中加入1微升Bst DNA聚合酶；
[0024] c.于恒溫水浴槽浴中60-65攝氏度放置30-60分鐘；
[0025] d.將恒溫水浴調(diào)到80攝氏度保溫5分鐘后取出；
[0026] (3)電泳及顯色檢測：
[0027] 擴(kuò)增后的產(chǎn)物，通過電泳檢測確定其靈敏度，LAMP法的擴(kuò)增產(chǎn)物是各種不同長度 的莖一環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA，因此陽性反應(yīng)通過瓊脂糖電泳檢測呈梯形條帶，而陰性反應(yīng)則沒有梯 形擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，在反應(yīng)管中加入1微升顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，陽性反應(yīng)為熒 光綠色，說明待檢細(xì)菌樣品為溶藻弧菌，陰性反應(yīng)保持SYBR Green I染料的熒光橙色，說明 待檢細(xì)菌樣品不是溶藻弧菌。
[0028] 本發(fā)明溶藻弧菌的快速檢測試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：
[0029] 本發(fā)明中溶藻弧菌的快速檢測試劑盒采用的引物對是通過GenBank公布的溶藻 弧菌（Vibrio alginolyticus)aspA基因序列（DQ097160)與其它同源序列比對后，選取特 異性保守序列，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一套LAMP引物，包括內(nèi)外兩對引物，可以 保證檢測不同來源的溶藻弧菌菌株的可靠性。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，靈 敏度高、不需昂貴的PCR儀，只需普通的恒溫水浴槽即可，擴(kuò)增結(jié)果使用熒光染料來觀察即 可，檢測方法易行，操作簡便，且成本低廉，特異性強(qiáng)，所檢測的陰性對照菌株均無陽性結(jié)果 出來，與PCR檢測結(jié)果一致。本發(fā)明得最低檢測限為10 1Iig · uL \靈敏度比普通PCR反應(yīng) 高100倍。
[0030] 本發(fā)明特異性強(qiáng)，敏感性高，簡便快速，可用于實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確的檢測溶藻弧菌。
【附圖說明】
[0031] 圖1是本發(fā)明快速檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果中LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0032] 圖2是本發(fā)明快速檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果中是PCR反應(yīng)結(jié)果；
[0033] 圖3是本發(fā)明快速檢測試劑盒特異性檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)1-8分別為：1、哈氏弧菌； 2、河流弧菌；3、霍亂弧菌；4、英諾克李斯特氏菌；5、單增李斯特氏菌；6、副溶血弧菌；7、金 黃色葡萄球菌；8、溶藻弧菌。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。本 發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例 中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0035] -種溶藻弧菌的快速檢測試劑盒，包括優(yōu)化的LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和 LAMP顯色液；其中，所述優(yōu)化的LAMP反應(yīng)液中含有引物，是通過GenBank公布的溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)aspA基因序列（DQ097160)與其它同源序列比對后，選取特異性 保守序列，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的。
[0036] 所述的LAMP反應(yīng)液中的引物包括兩對，上游內(nèi)引物、上游外引物、下游內(nèi)引物、下 游外引物：