貝類中大田軟海綿酸類毒素的快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種貝類中大田軟海綿酸類毒素的快速檢測(cè)試劑盒，屬于食品檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，它包括:(1)蛋白磷酸酶2A凍干粉；(2)大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)緩沖溶液；(4)蛋白磷酸酶2A稀釋溶液；(5)底物顯色溶液；(6)高濃度加標(biāo)溶液。本發(fā)明技術(shù)方案繼承了小鼠生物法能建立劑量-效應(yīng)關(guān)系的優(yōu)勢(shì)，直接反映毒素的相對(duì)毒性大小，但與小鼠生物法相比，可在更短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大批量樣品(84個(gè)樣品<4h)。本發(fā)明方法的檢出限為50μg?OA?eq./kg貝組織，與傳統(tǒng)的小鼠生物法的檢出限200μg?OA?eq./kg貝組織相比，大幅度降低。同時(shí)避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問題。本發(fā)明試劑盒成本低廉，操作簡便。
【專利說明】貝類中大田軟海綿酸類毒素的快速檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種貝類中大田軟海綿酸類毒素的快 速檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 貝類以其鮮美的口味和豐富的營養(yǎng)，深受廣大消費(fèi)者喜愛，成為我國漁業(yè)產(chǎn)業(yè)的 主導(dǎo)品種，但貝體內(nèi)毒素的富集多年來一直困擾我國貝類產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近年來對(duì)我國 部分海域貝類產(chǎn)區(qū)的調(diào)查顯示，在遼東灣、萊州灣、秦皇島、福建等海域均發(fā)現(xiàn)了貝毒素，并 以大田軟海綿酸（okadaic acid，0A)類毒素比較普遍。0A類毒素屬多環(huán)聚醚類脂溶性貝毒 素，具熱穩(wěn)定性，可在貝類組織中殘留較長時(shí)間；且加熱、微波等常規(guī)加工方式因降低水產(chǎn) 品中的水分含量而導(dǎo)致毒素濃度更高，所以此類毒素給消費(fèi)者帶來的潛在危害更難預(yù)防， 已成為發(fā)達(dá)國家制定監(jiān)控計(jì)劃和貿(mào)易壁壘的主要目標(biāo)。研究證實(shí)，0A類毒素的組分為0A及 其多種衍生物鰭藻毒素（dinophysistoxins，DTXs)，且0A及DTXs能夠抑制蛋白磷酸酶的 活性，是一類潛在的腫瘤促進(jìn)因子。歐盟、德國和英國等多個(gè)國家規(guī)定雙殼貝類可食性組織 中0A類毒素不大于160 μ g/kg (以0A計(jì)），我國GB/T18406. 4-2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公 害水產(chǎn)品安全要求》規(guī)定的限量值為600 μ g/kg。
[0003] 現(xiàn)有0A類毒素的檢測(cè)技術(shù)包括小鼠生物法、儀器分析法、免疫分析法以及蛋白磷 酸酶抑制分析法（protein phosphatase inhibition assay，PPIA)。其中小鼠生物法作為 目前使用最為廣泛的檢測(cè)方法，其毒素總量的測(cè)定可較直接和準(zhǔn)確反映目標(biāo)毒素的毒性大 小，多年來世界范圍內(nèi)均未出現(xiàn)因方法本身問題而出現(xiàn)的中毒事件，但由于存在毒素提取 過程繁瑣、需時(shí)較長，檢出限偏高（200 μ gOA eq./kg貝組織）等局限性及動(dòng)物福利的原因， 歐盟指令（EC)N〇15/2011規(guī)定該方法作為官方標(biāo)準(zhǔn)方法僅限于在2014年12月31日前使 用，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS)作為取代的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，并鼓勵(lì)建立功能性檢 測(cè)方法（PPIA法）等作為LC-MS/MS的補(bǔ)充。LC-MS/MS法準(zhǔn)確、靈敏，但需要價(jià)格昂貴的儀器 和專業(yè)的人員操作，不能實(shí)現(xiàn)快速和現(xiàn)場檢測(cè)；PPIA法繼承了小鼠生物法能建立劑量-效 應(yīng)關(guān)系的優(yōu)勢(shì)，直接反映毒素的相對(duì)毒性大小，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，且降低了檢出 限和成本，避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問題，具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?br>

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種貝類中大田軟海綿酸類毒素快速檢測(cè)試劑盒， 以克服現(xiàn)有檢測(cè)方法繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)、儀器昂貴，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場、快速檢測(cè)等缺陷。本發(fā)明基 于大田軟海綿酸及其衍生物鰭藻毒素能抑制蛋白磷酸酶活性的特點(diǎn)而研制了一種利用蛋 白磷酸酶活性變化檢測(cè)0A類毒素總毒性當(dāng)量的檢測(cè)試劑盒（以0A濃度計(jì)），樣品前處理過 程簡單，檢測(cè)快速、費(fèi)用低廉，可同時(shí)檢測(cè)大批量樣品。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種貝類中大田軟海綿酸類毒素的快速檢測(cè)試劑盒，包括：
[0007] (1)蛋白磷酸酶2A凍干粉；（2)大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)緩沖溶 液；(4)蛋白磷酸酶2A稀釋溶液；（5)底物顯色溶液；(6)高濃度加標(biāo)溶液；
[0008] 進(jìn)一步，所述的大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為：0,0. 8,1.2， 1. 5,2· 0 和 2· 5μ g/L。
[0009] 進(jìn)一步，所述的緩沖溶液具體是指pH8. 4并包含以下終濃度成份：30mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,20mmol/L MgCl2〇
[0010] 進(jìn)一步，所述的蛋白磷酸酶2A稀釋溶液為用所述緩沖溶液配制的0. 2mg/mL牛血 清白蛋白溶液，并含終濃度為2mmol/Ll，4-二巰基蘇糖醇。
[0011] 進(jìn)一步，所述的底物顯色溶液為濃度為25mmol/L對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液，用所述 的蛋白磷酸酶2A稀釋溶液配制對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液。
[0012] 進(jìn)一步，所述的高濃度加標(biāo)溶液為1. 6?5. 0 μ g/mL大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0013] 本發(fā)明提供一種采用所述的試劑盒檢測(cè)樣品中的大田軟海綿酸類毒素的方法，具 體步驟如下：（1)制備樣品溶液；(2)加入大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶 液；（3)加入蛋白磷酸酶2A，振蕩混合，孵育；(4)加入底物顯色溶液，振蕩混合，避光孵育顯 色；（5)測(cè)定顯色后溶液的吸光度值；(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中大田軟海綿酸類毒素 的濃度。
[0014] 進(jìn)一步，所述的制備樣品溶液的方法為：稱取勻漿的貝樣，加入甲醇，均質(zhì)提取，離 心，再移取甲醇提取液至離心管，先加入NaOH，渦旋，水浴中恒溫加熱，再加入HC1中和，最 后，將溶液氮吹近干，加入緩沖溶液定容。
[0015] 進(jìn)一步，所述的制備樣品溶液的基質(zhì)濃度為10mg/mL。
[0016] 進(jìn)一步，所述的步驟（3)的孵育溫度為30±2°C，孵育時(shí)間20±0. 5min。
[0017] 進(jìn)一步，所述的步驟（4)的孵育溫度為30±2°C，孵育時(shí)間30±0. 5min。
[0018] 進(jìn)一步，所述的步驟（5)的測(cè)定吸光度值的波長為405nm。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
[0020] (1)本發(fā)明技術(shù)方案與高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等儀器檢測(cè)技術(shù)相 t匕，本試劑盒成本低廉，操作簡便，不需專業(yè)技術(shù)人員即可完成檢測(cè)，可滿足不同層次人員 需要。
[0021] (2)本發(fā)明技術(shù)方案繼承了小鼠生物法能建立劑量-效應(yīng)關(guān)系的優(yōu)勢(shì)，直接反映 毒素的相對(duì)毒性大小，但與小鼠生物法相比，可在更短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大批量樣品（84個(gè)樣品 <4h)。本發(fā)明方法的檢出限為50 μ g 0A eq./kg貝組織，與傳統(tǒng)的小鼠生物法的檢出限 200yg 0A eq./kg貝組織相比，檢出限大幅度降低。同時(shí)避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問題。
[0022] (3)本發(fā)明的快速檢測(cè)試劑盒，簡化了樣品前處理和檢測(cè)步驟，準(zhǔn)確率高，經(jīng)濟(jì)、便 攜，適合現(xiàn)場快速篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為不同基質(zhì)濃度對(duì)PP2A酶活性抑制率的影響。
[0024] 圖2為大田軟海綿酸對(duì)PP2A酶的抑制曲線圖。
[0025] 圖3為大田軟海綿酸類毒素快速檢測(cè)試劑盒測(cè)定0A的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí) 施例任何形式上的限制。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] -種貝類中大田軟海綿酸類毒素的快速檢測(cè)試劑盒，具體包括：
[0029] (1)96孔微孔板（美國Corning公司）；可拆卸成12條微孔條，可以一次測(cè)試多個(gè) 樣品，也可以拆開分次測(cè)試，剩余的微孔條可以儲(chǔ)存在自封袋內(nèi)，下次使用。
[0030] (2)蛋白磷酸酶2A凍干粉（西班牙宙斯生物技術(shù)公司），2.5U/支，共5支；使用 前每支酶凍干粉以2mL蛋白磷酸酶2A稀釋溶液配制，配制時(shí)在室溫（22 ±2 °C)下酶標(biāo)振蕩 器上輕微振蕩（轉(zhuǎn)速< 60rpm)60±5min使其充分水解，配制后應(yīng)立即使用。
[0031] (3)大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 共 6 瓶，濃度分別為：0,0· 8,1. 2,1. 5, 2. 0 和 2. 5 μ g/L。
[0032] (4)緩沖溶液：ρΗ8·4并包含以下終濃度的成份30mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，20mmol/L MgCl2 緩沖溶液。
[0033] (5)蛋白磷酸酶2A稀釋溶液：用所述的緩沖溶液配制終濃度為0· 2mg/mL牛血清 白蛋白溶液，并含有終濃度為2mmol/Ll，4-二巰基蘇糖醇作為稀釋溶液。
[0034] (6)底物顯色溶液：用所述蛋白磷酸酶2A稀釋溶液配制的終濃度為25mmol/L對(duì) 硝基苯磷酸二鈉溶液作為底物顯色溶液。
[0035] (7)高濃度加標(biāo)溶液：終濃度為3. 2 μ g/mL大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為高濃度加 標(biāo)溶液，測(cè)試時(shí)加入1〇〇 μ L于貝樣中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。
[0036] 實(shí)施例2
[0037] 應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒測(cè)定0Α類毒素的總毒性當(dāng)量的方法，包括以下步驟：
[0038] (1)樣品溶液的制備：稱取2.00g勻漿的貝樣，加入10mL甲醇，10000r/min均 質(zhì)提取2min，于4000r/min離心10min，再移取lmL甲醇提取液至5mL離心管，先加入 125μ L2. 5mol/L NaOH，渦旋 10s，于 76±2°C水浴中恒溫加熱 40min，再加入 125μ L2. 5mol/ L HC1中和。最后，將溶液氮吹近干，加入緩沖溶液（pH8.4)定容至20mL，待測(cè)。
[0039] (2)蛋白磷酸酶2A(PP2A酶）溶液的配制：根據(jù)樣品的數(shù)量，選擇酶的用量。每 支酶凍干粉加入2mL酶稀釋溶液，在室溫（22±2°C )下酶標(biāo)振蕩器上輕微振蕩（轉(zhuǎn)速 < 60rpm)60±5min使其充分水解。
[0040] (3)加入大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液：以50 μ L/孔的加入量 向96孔微孔板中分別加入大田軟海綿酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和制備好的樣品溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液和 樣品溶液測(cè)試各做2個(gè)平行。
[0041] (4)加入蛋白磷酸酶2Α溶液：以100 μ L/孔的加入量向相應(yīng)的檢測(cè)小孔中加入配 制好的ΡΡ2Α酶溶液，封上封板膜，輕微振蕩混合，在30±2°C下孵育20±0. 5min。
[0042] (5)加底物顯色溶液：掀開封板膜，以50 μ L/孔的加入量向相應(yīng)的檢測(cè)小孔中加 入底物顯色溶液，輕微振蕩混合，在30±2°C下避光孵育30±0. 5min。
[0043] (6)測(cè)定顯色后溶液的吸光度值：使用酶標(biāo)儀測(cè)試405nm處的吸光度。
[0044] (7)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以所測(cè)得的大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)的 吸光度值，除以第一個(gè)0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，按照fl-〇100 (A為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度 值，&為第一個(gè)0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值）計(jì)算得到酶抑制率，以酶抑制率為縱坐標(biāo)，以各大田軟 海綿酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品溶液所對(duì)應(yīng)的孔的吸光度 值和所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品溶液的濃度。
[0045] 圖1為不同基質(zhì)濃度對(duì)PP2A酶活性抑制率的影響圖。選取陰性的扇貝、牡蠣和 貽貝樣品作為測(cè)試基質(zhì)，重點(diǎn)考察不同基質(zhì)濃度（基質(zhì)濃度點(diǎn)分別為1，2, 5,10, 20, 30, 50， 100,200mg/mL)對(duì)酶活性抑制率的影響。由圖中所示，當(dāng)基質(zhì)濃度在1?10mg/mL范圍內(nèi)變 化時(shí)，酶活性抑制率在10%以內(nèi)，且其變化不存在明顯差異，而基質(zhì)濃度大于10mg/mL時(shí)酶 活性抑制率隨基質(zhì)濃度的增大而升高，三種基質(zhì)對(duì)酶活性抑制率的影響為貽貝〉牡蠣〉扇 貝。根據(jù)PPIA法中抑制率10%作為閾值的規(guī)定，低于10%抑制率認(rèn)為對(duì)酶活性無顯著影 響，該試劑盒將10mg/mL作為測(cè)試時(shí)的基質(zhì)濃度以適用于不同貝類基質(zhì)。
[0046] 圖2為大田軟海綿酸對(duì)PP2A酶的抑制曲線。依據(jù)不同濃度的0A對(duì)PP2A酶的抑制 情況，由四元參數(shù)Logistic擬合得出0A抑制酶活性曲線。當(dāng)0A濃度低于0. 50 μ g/L (酶 活性抑制率低于10% )時(shí)，酶相對(duì)活性沒有顯著變化，且樣品測(cè)試的重復(fù)性降低，重復(fù)3次 的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，因此在此范圍內(nèi)的測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性不高。當(dāng)0A濃度在0. 5?3. 0 μ g/L 時(shí)，酶活性抑制率從10. 06%升到90. 05%，相對(duì)酶活性對(duì)0A濃度的變化響應(yīng)非常明顯。當(dāng) 0A濃度高于3. 0 μ g/L時(shí)，酶活性抑制率也沒有明顯變化，對(duì)0A濃度的響應(yīng)靈敏度降低。因 此，利用該抑制曲線計(jì)算出0A的有效濃度范圍在0. 50?3. 0 μ g/L之間。以10% PP2A酶 活性抑制率對(duì)應(yīng)的0A濃度為檢出限（L0D)，得出試劑盒的檢出限為0. 50 μ g/L，由優(yōu)化的基 質(zhì)濃度為10mg/mL，計(jì)算得檢出限為50yg OA eq./kg貝組織。該檢出限低于小鼠生物法 (200yg OA eq./kg貝組織）和目前許多國家采用的DSP食用安全標(biāo)準(zhǔn)（160yg OA eq. / kg貝組織），且遠(yuǎn)低于我國《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害水產(chǎn)品安全要求》的規(guī)定限量（600 μ g OA eq. /kg 貝組織）。
[0047] 圖3為本實(shí)施例測(cè)定0A含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0. 50?3. 0 μ g/L濃度范圍內(nèi)配制 0A標(biāo)準(zhǔn)濃度序列溶液，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)上將0A濃度的對(duì)數(shù)值設(shè)為X軸，標(biāo)準(zhǔn)溶液的酶活性抑制 率設(shè)為Y軸，得出0A的線性范圍為0. 8?2. 5 μ g/L，準(zhǔn)確定量0A的最低濃度為0. 80 μ g/ L，計(jì)算出試劑盒的定量限為80μ g 0A eq. /kg貝組織，線性方程為x = EXP(y_b)/a(a為斜 率，b為y軸上的截距），相關(guān)系數(shù)為0. 99。
[0048] (7)選取三份陰性貝類樣品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)比，結(jié) 果見表1。
[0049] 表1貝類中大田軟海綿酸的對(duì)比測(cè)定結(jié)果（η = 6)
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種貝類中大田軟海綿酸類毒素的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于它包括： (1)蛋白磷酸酶2A凍干粉；（2)大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；（3)緩沖溶液； (4)蛋白磷酸酶2A稀釋溶液；(5)底物顯色溶液；(6)高濃度加標(biāo)溶液；
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的大田軟海綿酸濃度梯度系列標(biāo)準(zhǔn) 溶液，濃度分別為：〇,〇. 8,1. 2,1. 5, 2. 0 和 2. 5 μ g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的緩沖溶液具體是指pH8. 4并包含 以下終濃度成份：30mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA, 20mmol/L MgCl2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的蛋白磷酸酶2A稀釋溶液為用所述 緩沖溶液配制的〇. 2mg/mL牛血清白蛋白溶液，并含終濃度為2mmol/Ll，4-二巰基蘇糖醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的底物顯色溶液為濃度為25mmol/L 對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液，用所述的蛋白磷酸酶2A稀釋溶液配制對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的高濃度加標(biāo)溶液為1.6? 5. 0 μ g/mL大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7. -種采用權(quán)利要求1-6任何一種所述的試劑盒檢測(cè)樣品中的大田軟海綿酸類毒素 的方法，其特征在于具體步驟如下：（1)制備樣品溶液；（2)加入大田軟海綿酸濃度梯度系 列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液；（3)加入蛋白磷酸酶2A，振蕩混合，孵育；(4)加入底物顯色溶液， 振蕩混合，避光孵育顯色；（5)測(cè)定顯色后溶液的吸光度值；(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中 大田軟海綿酸類毒素的濃度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的制備樣品溶液的方法為：稱取勻 漿的貝樣，加入甲醇，均質(zhì)提取，離心，再移取甲醇提取液至離心管，先加入NaOH，渦旋，水浴 中恒溫加熱，再加入HC1中和，最后，將溶液氮吹近干，加入緩沖溶液定容。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的制備樣品溶液的基質(zhì)濃度為 10mg/mL〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的步驟（3)的孵育溫度為 30±2°C，孵育時(shí)間20±0. 5min ;所述的步驟⑷的孵育溫度為30±2°C，孵育時(shí)間 30±0. 5min ;所述的步驟（5)的測(cè)定吸光度值的波長為405nm。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104089954SQ201410353824
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】郭萌萌, 譚志軍, 李兆新, 王智, 吳海燕, 趙春霞, 翟毓秀 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所