利用展示纖維素酶的釀酒酵母菌群發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用展示纖維素酶的釀酒酵母 菌群發(fā)酵纖維素生產(chǎn)己醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] W纖維素為原料生產(chǎn)燃料己醇具有重要的經(jīng)濟和社會價值，然而，纖維素酶的昂 貴成本W(wǎng)及在纖維素水解、發(fā)酵過程中存在的技術(shù)瓶頸嚴重阻礙了燃料己醇的發(fā)展進程。 己醇工業(yè)化生產(chǎn)的理想途徑是利用一種微生物在一種反應(yīng)器中完成纖維素酶生產(chǎn)、纖維素 水解W及己醇發(fā)酵，即統(tǒng)合生物加工過程（Consolidated Bioprocessing, CBF0。由于釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)具有較高的己醇產(chǎn)率和較高的己醇耐受性，從而成為理 想的CBP宿主，但它不能直接利用纖維素類物質(zhì)。大量研究致力于在S. cerevisiae細胞表 面展示纖維素酶W賦予其降解纖維素的能力，并成功構(gòu)建了一些功能性的全細胞催化劑。 但目前報道的重組酵母菌株并未能取得理想的效果，生產(chǎn)成本并未有效降低，性能良好的 酵母菌株構(gòu)建及應(yīng)用仍舊是個亟待解決的難題。
[0003] S. cerevisiae Y5是近年來篩選到的具有良好己醇發(fā)酵性能的二倍體絮凝菌株。 其己醇生產(chǎn)的優(yōu)勢在于；絮凝性使得酵母在發(fā)酵過程中能更容易分離；相對于實驗室菌株 而言，二倍體酵母具有更高的細胞生長速率W及較高的抑制劑耐受性，更有利于工業(yè)化己 醇生產(chǎn)。在前期的研究中，我們報道了基于S. cerevisiae Y5構(gòu)建a-凝集素展示系統(tǒng)及 目-葡糖巧酶1的固定化。重組菌株能有效表達BGLI，同時能在W纖維二糖為唯一碳源的 培養(yǎng)基中生長。然而，纖維素的完全降解至少需要在EG、CBH和B化的協(xié)同作用下完成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種利用展示纖維素酶 (內(nèi)切葡聚糖酶II、纖維二糖水解酶IIW及目-葡糖巧酶I)的釀酒酵母菌群發(fā)酵纖維素生 產(chǎn)己醇的方法。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種釀酒酵母混合菌群，所述混合菌群包 含展示有內(nèi)切葡聚糖酶II (EGII)的釀酒酵母重組菌Y5/EGII、展示有纖維二糖水解酶II (CBHII)的釀酒酵母重組菌Y5/CBHII W及展示有目-葡糖巧酶I (B化I)的釀酒酵母重組 菌Y5/B化I。
[0006] 其中，所述內(nèi)切葡聚糖酶II和纖維二糖水解酶II來自絲狀真菌里氏木霉 (Trichoderma reesei),所述目-葡糖巧酶 I 來自棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)。
[0007] 本發(fā)明還提供所述釀酒酵母混合菌群的制備方法，W釀酒酵母Y5為受體，利用a 凝集素作為銷定蛋白，分別將內(nèi)切葡聚糖酶II、纖維二糖水解酶II W及目-葡糖巧酶I展 示在釀酒酵母Y5的表面，將構(gòu)建得到重組菌Y5/EGII、Y5/CBHn和Y5/BGLI按一定比例混 合即得。通過調(diào)控H種重組菌之間的混合比例來實現(xiàn)纖維素酶間協(xié)同作用的優(yōu)化。
[0008] 所述重組菌的構(gòu)建包括如下步驟：
[0009] 1)纖維素酶基因的擴增：所述纖維素酶基因包括內(nèi)切葡聚糖酶II基因、纖維二糖 水解酶II基因W及目-葡糖巧酶I基因；
[0010] 2)展示載體的構(gòu)建；W pYDl作為出發(fā)載體，分別構(gòu)建整合有內(nèi)切葡聚糖酶II基 因、纖維二糖水解酶II基因W及目-葡糖巧酶I基因的展示載體；
[0011] 3)釀酒酵母的轉(zhuǎn)化：整合載體pAGAl經(jīng)線性化，分別與步驟2)構(gòu)建得到的展示載 體(例如，通過醋酸裡轉(zhuǎn)化法）共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母Y5中構(gòu)建相應(yīng)的重組菌。
[0012] 本發(fā)明還提供利用所述釀酒酵母混合菌群降解纖維素發(fā)酵生產(chǎn)己醇的方法。
[0013] 其中，混合菌群W無定形纖維素（PASC)為唯一碳源進行纖維素生物降解，發(fā)酵生 產(chǎn)己醇。
[0014] 優(yōu)選地，重組菌 Y5/EGII、Y5/CBHn 和 Y5/BGLI 經(jīng) YPG 誘導(dǎo) 4她后，按 1-2:1-2:1 的初始接種細胞濕重比混合。
[0015] 更優(yōu)選地，重組菌Y5/EGII、Y5/CBHn和Y5/BGLI按2:1:1的初始接種細胞濕重比 混合。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述釀酒酵母混合菌群在纖維素統(tǒng)合生物加工中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[001引本發(fā)明基于酵母a -凝集素銷定技術(shù)，將T. reesei的EGII和CBHII W及 A. aculeatus的BGLI分別展示在S. cerevisiae Y5表面，構(gòu)建新型的酵母混合菌群系統(tǒng)，并 利用該菌群系統(tǒng)W無定形纖維素（PASC)為底物進行己醇發(fā)酵生產(chǎn)。通過進一步優(yōu)化系統(tǒng) 中展示不同酶組分的重組菌的比例W期提高纖維素的降解效率，進而提高己醇產(chǎn)率。
【附圖說明】
[001引圖1為本發(fā)明克隆得到的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，A為bgll 基因，B為egl2基因，C為cbh2基因，D為MAT終止子，E為ADH啟動子及kanr編碼區(qū)，F(xiàn)為 ADH終止子，分子量標準為D2000。
[0020] 圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果；其中，A為Not I單酶切地GL，B為Apa I 單酶切祀GII (邸NA)，C 為 EcoR I/Apa I 雙酶切 pCBHII (邸NA)。
[0021] 圖3為本發(fā)明中涉及的展示載體的構(gòu)建示意圖。
[0022] 圖4為本發(fā)明重組菌株的PCR鑒定結(jié)果；其中，A中泳道1-4分別為Y5、Y5/ EGII、Y5/CBHII、Y5/BGL1 基因組 PCR 鑒定結(jié)果（2790bp) ;B 中泳道 1-3 分別為 Y5、Y5/EGII (1194bp)、Y5/CBHII (1344bp)質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；C中泳道1為Y5/B化1 (252化P)質(zhì)粒 PCR鑒定結(jié)果。
[0023] 圖5為本發(fā)明不同酵母菌群在發(fā)酵過程中纖維素酶活性穩(wěn)定性分析結(jié)果。
[0024] 圖6為本發(fā)明不同酵母菌群W PASC為唯一碳源的己醇發(fā)酵結(jié)果；其中，A為總糖 濃度，B為己醇濃度；重組菌Y5/EGII、Y5/CBHn和Y5/BGLI的初始接種細胞濕重比依次為 和 1:2:1。
【具體實施方式】
[0025] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a 1油oratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0026] W下實施例中涉及的材料及試劑如下：
[0027] 1、菌株和質(zhì)粒
[0028] S.cerevisiae Y5(參見化200810222897. 7,保藏編號；CGMCC No. 260)作為纖維 素酶展示的宿主菌；Escherichia coli ToplO購自天根生化科技有限公司；T.reesei及 A. aculeatus購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，作為纖維素酶基因的來源。
[0029] 酵母表面展示載體pYDl購自Invitrogen ;酵母整合載體YIP5-KanR購自美國 ATCC菌種保藏中也，本發(fā)明相關(guān)展示載體及重組菌的特性見表1。
[0030] 表1重組菌及展示載體特征
[0031]
【主權(quán)項】
1. 一種釀酒酵母混合菌群，其特征在于，所述混合菌群包含展示有內(nèi)切葡聚糖酶II的 釀酒酵母重組菌Y5/EGII、展示有纖維二糖水解酶II的釀酒酵母重組菌Y5/CBHII以及展示 有@ -葡糖苷酶I的釀酒酵母重組菌Y5/BGLI。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合菌群，其特征在于，所述內(nèi)切葡聚糖酶II和纖維二 糖水解酶II來自里氏木霉（Trichoderma reesei)，所述葡糖苷酶I來自棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)。
3. 權(quán)利要求1或2所述混合菌群的制備方法，其特征在于，以釀酒酵母Y5為受體，利用 a凝集素作為錨定蛋白，分別將內(nèi)切葡聚糖酶II、纖維二糖水解酶II以及葡糖苷酶I 展示在釀酒酵母Y5的表面，將構(gòu)建得到重組菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按一定比例 混合即得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述重組菌的構(gòu)建包括如下步驟： 1) 纖維素酶基因的擴增：所述纖維素酶基因包括內(nèi)切葡聚糖酶II基因、纖維二糖水解 酶II基因以及葡糖苷酶I基因； 2) 展示載體的構(gòu)建：以pYDl作為出發(fā)載體，分別構(gòu)建整合有內(nèi)切葡聚糖酶II基因、纖 維二糖水解酶II基因以及0 -葡糖苷酶I基因的展示載體； 3) 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化：整合載體pAGAl經(jīng)線性化，分別與步驟2)構(gòu)建得到的展示載體共 轉(zhuǎn)化至釀酒酵母Y5中構(gòu)建相應(yīng)的重組菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將整合 載體與展示載體共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母Y5中。
6. 利用權(quán)利要求1或2所述的混合菌群降解纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，混合菌群以無定形纖維素為唯一碳源進 行纖維素生物降解，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，重組菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI經(jīng) YPG誘導(dǎo)48h后，按1-2:1-2:1的初始接種細胞濕重比混合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，重組菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按 2:1:1的初始接種細胞濕重比混合。
10. 權(quán)利要求1或2所述的混合菌群在纖維素統(tǒng)合生物加工中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種表面展示纖維素酶類的釀酒酵母Y5菌群，實現(xiàn)以PACS為底物進行纖維素乙醇統(tǒng)合加工的方法。該菌群可通過靈活調(diào)控與優(yōu)化其各組分間（分別單展示內(nèi)切葡聚糖酶II、纖維二糖水解酶II和β-葡糖苷酶I的酵母組分）的比例，提高其纖維素降解能力，提升乙醇產(chǎn)量。此外，二倍體工業(yè)釀酒酵母Y5具有較強的抑制劑耐受性、高濃度乙醇耐受性及自絮凝等優(yōu)良特性，以其作為出發(fā)菌種所構(gòu)建的表面展示復(fù)合菌群更適用于纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C12P7-10, C12R1-865, C12N1-19
【公開號】CN104673689
【申請?zhí)枴緾N201310618222
【發(fā)明人】田沈, 楊秀山
【申請人】首都師范大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年11月27日