一株哈茨木霉及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物保護領域，具體設及一株哈茨木霉在抗桑権菌核病病害中的應 用。
【背景技術】
[0002] 桑権菌核病是危害桑権的主要真菌病害。其發(fā)病種類主要有3種，分別是桑 権肥大性菌核病、桑権縮小性菌核病、桑権小粒性菌核病。其對應的病原菌分別為桑 實杯盤菌（Ciboria shiraiana)，肉阜狀杯盤菌（Ciboriacarunculoides)，核地杖菌 (Sclerom;Uulashiraiana)。桑権菌核病傳染性強，發(fā)病范圍廣，在全國各地區(qū)均有發(fā)生。 一般地勢低珪，通氣透光性差、濕度大的桑園發(fā)病較嚴重，發(fā)病率高達30%~90%，甚至絕 收，給果桑產業(yè)造成毀滅性危害。
[0003] 目前我國大多都是采用農藝防控、化學手段來防治桑権菌核病。農藝防控措施主 要有；摘除病枝病果，深翻±壤，覆蓋地膜等，需要消耗大量人力、物力、財力?；瘜W藥劑防 治是主要措施，如；果農普遍使用的50%多菌靈可濕性粉劑、70%甲基托布津可濕性粉劑、 40%菌核凈可濕性粉劑等，都對桑権菌核病的發(fā)生有一定預防作用。雖然該些藥劑對人、畜 低毒性且高效、方便，但是長期使用仍易對環(huán)境產生危害，而且使用農藥易留有殘留，給人、 畜帶來一定的安全隱患。同時，農藥的長期使用容易使病原菌對農藥產生抗性，產生對環(huán) 境、食品的累積性污染等問題，所W對生物源農藥，特別是從天然植物、動物及微生物中尋 找和開發(fā)新型殺菌劑的開發(fā)研究是當前的研究熱點。專利號200910103552. 4的發(fā)明專利 《一種抗肥大型菌核病菌的中藥提取物》提供了一種用中草藥提取物制成的抗桑権肥大型 菌核病的殺菌劑；劉華才等研究了一種綜合性生物藥肥對桑権菌核病的防控效果，發(fā)現(xiàn)該 生物藥肥AS300倍液和500倍液可有效抑制桑権菌核病發(fā)生，可代替其他殺菌劑在果桑上 使用。該2種方法與W往的防治手段相比，安全系數(shù)相對增加。
[0004] 木霉是±壤中普遍存在，具有很大應用潛力的一類真菌，其生防效果已在很多應 用實驗中得到證實。迄今為止，已有50多種木霉制劑注冊上市，如美國的Topshield(哈茨 T-22)和W色列的Trichodex(哈茨木霉T-39)已經(jīng)商品化生產。據(jù)不完全統(tǒng)計，木霉至少 對18個屬29種病原真菌有括抗作用，其中一半是±傳病原真菌。針對病原菌產生的一些 如菌核、厚垣抱子、卵飽子等特殊的組織結構，木霉能在其周圍大量定殖，形成較大群體，并 隨根的生長擴大其分布范圍。木霉對主要±傳病害病原真菌鑲刀菌、疫霉、腐霉、立枯絲核 菌等都有很好的防治效果。
[0005] 本發(fā)明嘗試在桑権菌核病病害發(fā)生前期對病原菌施用木霉菌劑，不僅具有對動 物、環(huán)境無污染的特點，同時使病害在發(fā)生前期即可得到控制，降低桑権菌核病的發(fā)病率。

【發(fā)明內容】

[0006] 解決的技術問題；本發(fā)明的目的是提供一株哈茨木霉（Trichoderm址arzianum) 及其應用，該木霉菌株具有防治桑権菌核病的功能。
[0007] 技術方案；哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6,該菌株已保藏在中國普通微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國 科學院微生物研究所，保藏日期；2014年10月16日，保藏號為；CGMCCNo. 9772。
[000引 所述哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6在抗桑権菌核病中應用。
[0009] 上述應用的具體方法為；在桑樹萌芽期、始花期、盛花期前后3~4d，于桑樹根圍 ±壤及桑樹枝條上及時噴灑木霉制劑，每個時期噴灑1~2次。
[0010] 上述應用中，哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6發(fā)酵產物，與水W 1:10體積 比混合，有效抱子濃度為1 X 106個抱子/mL。
[0011] 哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6在制備抗桑権菌核病藥物中應用。
[0012] 抗桑権菌核病藥物，有效成分含有哈茨木霉（Trichoderm址arzianum)Trl6。本發(fā) 明的木霉Tr 16菌株具有W下生物學特性：
[0013] 菌落生長迅速，3~4d即可布滿整個平板。氣生菌絲先為白色，后產生綠色的分生 抱子，菌落背面無色。產抱區(qū)平展，呈同屯、輪紋狀排列。在顯微鏡下觀察，分生抱子梗透明， 壁光滑，瓶梗呈安肅瓶型，多數(shù)為3~7 X 1. 2~3 y m ;分生抱子梗初級分支幾乎成直角，或 稍微朝頂方向彎曲；分生抱子為亞球形至球形，多數(shù)為2~2. 9 X 1. 9~2. 5 y m。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種抗桑権菌核病的木霉菌劑，為哈茨木霉Trl6的發(fā)酵物，即 將Trl6接種于馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基，28~30°C震蕩培養(yǎng)5~6山并調節(jié)抱子濃度為 1 X 1〇6個/血，即得本發(fā)明的哈茨木霉菌劑。
[0015] 本發(fā)明還提供木霉Trl6菌劑的施用方法：將木霉菌劑與水W 1:10體積比混合，在 萌芽期、始花期、盛花期前后3~4山將木霉菌劑均勻噴灑于桑樹根圍±壤及桑樹枝條上， W達到控制桑権菌核病的目的。
[0016] 有益效果；1、平板對時法表明Trl6具有較好的空間競爭能力，其代謝物質抑菌作 用較穩(wěn)定，14化后抑菌率仍達82. 25%。
[0017] 2、將Trl6菌劑于桑権萌芽期、始花期、盛花期前后3~4d噴施，發(fā)現(xiàn)對桑権菌核 病具有較好的防治效果，防治效果達82. 53 %，且能減少農藥及其廢棄物造成的污染，有助 于保護農業(yè)生態(tài)環(huán)境。
【附圖說明】
[0018] 圖 1 為哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6 在 PDA 平板 28°C生長 6d 形態(tài)圖；
[0019] 圖2為哈茨木霉（Trichoderm址arzianum)Trl6在顯微鏡下的瓶梗和抱子形態(tài) 圖；
[0020] 圖3為哈茨木霉（Trichoderm址arzianum)Trl6與病原菌的括抗效果圖，其中A為 病原菌生長2d后在另一側接種木霉，28°C生長4d后括抗情況巧為病原菌生長2d后在另 一側接種木霉，28 °C生長8d后括抗情況。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，該些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人 員可W對本發(fā)明作各種改動或修改，該些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0022] 實施例1 ;
[0023] 1.木霉的分離篩選與鑒定
[0024] 采用稀釋涂布法對取自宜賓一發(fā)病桑園的±壤進行分離，篩選得到Trl6木霉菌 株。分離培養(yǎng)基為馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)和TSB培養(yǎng)基。
[002引所述的PDA培養(yǎng)基組成為馮鈴馨200g、葡萄糖20g、瓊脂18g、蒸饋水lOOOmL，自 然抑；
[0026] 所述的 TSB 培養(yǎng)基組成為；饑挪〇31徑；皿2口〇4〇. 9g;M拆〇4.7&0 0. 2g;KCl 0. 15g; 玫瑰紅0. 15g ;氯霉素0. 25g ;鏈霉素0. 05g ;PCNB 0. 15g ;甲霜靈0. 08g ;苯菌靈0. 0005g ; Triton X-100 lml;Water IL;調抑至 5-5. 5。121°C滅菌 20min。
[0027] 2.形態(tài)學鑒定
[0028] 將純化培養(yǎng)的Trl6菌株接種到PDA平板中央，28°C培養(yǎng)3~5d，觀察木霉的生長 情況。木霉菌落生長迅速，菌絲白色，呈卷毛狀；3d后菌落半徑達8cm ;3~4d即可產生綠 色的分生抱子，分生抱子豐富；菌落反面無色。
[0029] 挑取適量菌絲在顯微鏡下觀察，菌絲透明，壁光滑。分生抱子梗透明，壁光滑；較 直，粗大且剛硬；初級分枝近直角，二次分枝復雜，2~4個呈縱禍狀排列，整個結構類似金 字塔形狀。瓶梗為安肅形，基部明顯鎌縮，中部顯著膨大，多數(shù)為3. 39~6. 55X 1. 26~ 2. 9 ym。分生抱子大多為亞球形，壁光滑，半透明至淺綠色，多數(shù)為2. 02~2. 89X 1. 99~ 2. 46 y m。
[0030] 3.分子生物學鑒定
[0031] 接種適量Tr 16木霉菌絲到液體PDA培養(yǎng)基中，28°C搖瓶培養(yǎng)5d后抽濾收集菌絲 體，然后提取其基因組DNA作為PCR反應的模板。PCR反應所用通用引物分別為口S1和 ITS4。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶進行純化回收測序。將測得的菌的 基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，用Blast進行相關序列捜索，與GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有 的近緣菌株的ITS序列進行比對，并從數(shù)據(jù)庫中獲得相關序列。
[0032] 實施例2 ;
[0033] 保藏號為；CGMCC No. 9772 的哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6 的括抗效果 研究。
[0034] 在無菌PDA培養(yǎng)基兩側分別接種已純化培養(yǎng)的病原菌菌塊和木霉菌塊（d = 8mm)， 28°C培養(yǎng)4d、8d后觀察化16對病原菌的括抗效果。木霉對桑権菌核病病原菌有抑制作用， 表現(xiàn)為生存空間的競爭。兩者接觸后，病原菌無法再向著木霉方向生長，而Trl6則能繼續(xù) 接觸、纏繞病原菌生長，逐漸覆蓋于病原菌的菌落上。
[0035] 然后采用玻璃紙法研究Trl6木霉次生代謝物質對桑権菌核病病原菌的抑菌作 用；在無菌PDA平板上鋪上無菌雙層玻璃紙，在平板中央接種d = 8mm的木霉菌塊，28°C培 養(yǎng)7化后移去玻璃紙。然后接種d = 8mm的病原菌菌塊，28°C培養(yǎng)48~14化后采用十字 交叉法測定菌絲塊直徑，計算抑菌率。接種4她后，抑菌率為91. 01%，9化后為91. 32%， 14化后為82. 25%。W只接種病原菌菌塊的PDA平板為對照。每個處理3個重復。
[0036] 抑菌率（％ ) = ((對照生長直徑-處理組生長直徑）/對照生長直徑）X 100
[0037] 表1木霉非揮發(fā)性物質對Sclerotiniasclerotiorum的抑菌率
[00%]
【主權項】
1. 哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6,該菌株已保藏在中國普通微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年10月16日，保藏號為：CGMCC No. 9772。
2. 權利要求1所述哈茨木霉（Trichodermaharzianum)T;rl6在抗桑椹菌核病中應用。
3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于在桑樹萌芽期、始花期、盛花期前后3~ 4d，于桑樹根圍土壤及桑樹枝條上及時噴灑木霉制劑，每個時期噴灑1~2次。
4. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6發(fā) 酵產物，與水以1:10體積比混合，有效孢子濃度為1 X 106個孢子/mL。
5. 權利要求1所述哈茨木霉（Trichodermaharzianum)T;rl6在制備抗桑椹菌核病藥物 中應用。
6. 抗桑椹菌核病藥物，其特征在于有效成分含有哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6〇
【專利摘要】一株哈茨木霉(Trichodermaharzianum)及其應用，該菌株已保藏在中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年10月16日，保藏號為：CGMCC No.9772。平板對峙法表明Tr16具有較好的空間競爭能力，其代謝物質抑菌作用較穩(wěn)定，144h后抑菌率仍達82.25％。將Tr16菌劑于桑椹萌芽期、始花期、盛花期前后3～4d噴施，發(fā)現(xiàn)對桑椹菌核病具有較好的防治效果，防治效果達82.53％，且能減少農藥及其廢棄物造成的污染，有助于保護農業(yè)生態(tài)環(huán)境。CGMCC No.977220141016
【IPC分類】C12N1-14, A01N63-04, A01P3-00, C12R1-885
【公開號】CN104673686
【申請?zhí)枴緾N201510130322
【發(fā)明人】張健, 馬佳慧, 韓蓓蓓, 吳福安, 王俊
【申請人】江蘇科技大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月24日