黑曲霉及其在黃曲霉毒素生物防控中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種黑曲霉及其在黃曲霉毒素生物防控中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是一類由黃曲霉（Aspergillus flavus)、寄生曲霉（Aspergillus parasiti州S)及特曲霉（Aspergillus nomius)等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。研究表明黃 曲霉毒素能夠引起中毒性肝炎、肝細胞壞死、免疫抑制和肝癌，其中W黃曲霉毒素Bi的毒性 和致癌性最強，已被國際癌癥研究機構(gòu)定為人類I類致癌物。糧食等農(nóng)作物在種植、收獲、 貶藏和加工過程中極易受到黃曲霉毒素的污染，因此黃曲霉毒素給人類動物的健康W及經(jīng) 濟發(fā)展都具有嚴(yán)重的負面影響。
[0003] 傳統(tǒng)的黃曲霉毒素去毒方法主要包括物理脫毒法和化學(xué)處理法。但通常都存在一 些問題，比如去毒不完全、易降低飼料的營養(yǎng)價值、成本高、應(yīng)用性差等缺點，而且過度使用 化學(xué)物質(zhì)會對人類健康帶來副作用，引起環(huán)境污染。因此，生物防控黃曲霉毒素污染成為近 來研究的熱點，近年來已發(fā)現(xiàn)許多細菌和真菌都具有抑制產(chǎn)毒霉菌生長、產(chǎn)毒或者降解黃 曲霉毒素的作用，如乳酸菌、鏈霉菌、鏈球菌、枯草芽抱桿菌、紅串紅球菌、黑曲霉、非產(chǎn)毒黃 曲霉和寄生曲霉、黑根霉、釀酒酵母、青霉菌、綠色木霉等。但是相關(guān)的研究大都局限在實驗 室研究階段，工業(yè)化應(yīng)用的研究并不多。
[0004] 黑曲霉可W分泌多種消化酶，因能促進飼料中的養(yǎng)分消化和吸收利用，成為美國 FAD批準(zhǔn)允許直接添加到飼料中的添加劑之一。目前關(guān)于黑曲霉生物防控黃曲霉毒素的 報道很少，Dan Xu等發(fā)現(xiàn)一種黑曲霉菌能有效地抑制黃曲霉菌的生長與產(chǎn)毒，發(fā)酵培養(yǎng)9d 后，其抑制率最高可W達到94. 5%。同時，該黑曲霉的發(fā)酵物還能降解黃曲霉毒素Bi，反應(yīng) 5d后，其降解率可W高達85. 8%。但是存在的問題是反應(yīng)時間太長，該對于飼料廠造成的 成本太高。至今為止，未見關(guān)于黑曲霉和茶葉提取物相互配伍來協(xié)同防控黃曲霉毒素的研 究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，提供一種黑曲霉。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的黑曲霉在黃曲霉毒素生物防控中的應(yīng)用方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種黑曲霉，該菌株為黑曲霉 (Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保藏編號為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC);保藏單位 地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（100101)。
[000引所述的黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株具有W下生物學(xué)特性：菌落表面 平坦，邊緣整齊，培養(yǎng)基背面呈乳白色，中間稍有乳黃色，基內(nèi)菌絲發(fā)達。在25°C的察氏平板 培養(yǎng)基上培養(yǎng)8山RAF106菌落直徑為51. 0 + 1. 53mm，邊緣有少量白色絨毛狀氣生菌絲，菌 落表面呈灰褐色，表面有小滴狀黑色滲透液（見圖1)。
[0009] 黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全長堿基序列如SEQ ID NO ;1所示。
[0010] 所述的黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基配方為；馬鈴馨200g，庶糖20g，瓊脂 20g，蒸饋水1000血，pH自然，121°C滅菌20min。黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基也可使 用市售的馬鈴馨庶糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基。
[0011] 所述的黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)條件為：茄子瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28~ 35°C，培養(yǎng)時間3~5d。
[0012] 所述的黑曲霉RAF106菌株的種子分生抱子的獲取方法為；采用無菌生理鹽水沖 洗長滿黑色黑曲霉分生抱子的茄子瓶，并W接種環(huán)輕輕刮取種子培養(yǎng)基表面，得到黑曲霉 分生抱子懸浮液。
[0013] 所述的黑曲霉在黃曲霉毒素生物防控中的應(yīng)用；
[0014] 所述的黑曲霉RAF106應(yīng)用于抑制黃曲霉的生長、抑制黃曲霉毒素的生物合成或 降解黃曲霉毒素。該菌株通過競爭性抑制產(chǎn)毒黃曲霉的生長并抑制其毒素的生物合成，并 且通過發(fā)酵的方式降解飼料或農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素。
[0015] 所述的黑曲霉RAF106與植物多酪應(yīng)用于抑制黃曲霉的生長和抑制黃曲霉毒素生 物合成具有協(xié)同增效作用。
[0016] 所述的植物多酪優(yōu)選為茶葉提取物、兒茶素單體及其組合物、茶多酪中的至少一 種。
[0017] 所述的茶葉提取物為茶葉通過水或己醇浸提然后經(jīng)濃縮、干燥后粉碎制作，或直 接購置市售的茶葉提取物。
[0018] 所述的兒茶素單體及其組合物、茶多酪可直接從市場購得。
[0019] 所述的黑曲霉RAF106應(yīng)用于茶葉的發(fā)酵生產(chǎn)過程、農(nóng)產(chǎn)品的貶藏過程、飼料的生 產(chǎn)和貶運中。
[0020] 所述的農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)選為玉米或花生。
[0021] 所述的黑曲霉RAF106應(yīng)用于普巧茶或黑茶生產(chǎn)過程，包括如下步驟：將黑曲霉 RAF106菌株抱子采用蒸饋水配制成10 8CFU/ml的抱子懸浮液，噴灑至茶葉表面并混合均勻， 每千克茶葉中的抱子數(shù)量為1〇5~10 9個，然后再按照其發(fā)酵工藝進行渥堆發(fā)酵。
[0022] 所述的黑曲霉RAF106應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的貶藏過程、飼料的生產(chǎn)和貶運中的方法，包 括如下步驟；將茶葉提取物溶于蒸饋水制成茶水，然后將黑曲霉RAF106菌株抱子加入茶水 中，配制成l〇 8CFU/ml的抱子懸浮液，噴灑至農(nóng)產(chǎn)品表面或與飼料混合均勻，茶葉提取物添 加量為0. 02~0. 5%，每千克農(nóng)產(chǎn)品或飼料中的抱子數(shù)量為105~10 9個。
[0023] 所述的黑曲霉RAF106降解黃曲霉毒素的方法；將污染有黃曲霉毒素的農(nóng)產(chǎn)品或 飼料進行高溫殺菌，然后將黑曲霉RAF106菌株抱子加入茶水中，配制成10 8CFU/ml的黑曲 霉RAF106菌株抱子懸浮液，噴灑至農(nóng)產(chǎn)品表面或與飼料混合均勻，加水調(diào)節(jié)其含水量為 30~80%，茶葉提取物添加量為0. 05~1%，每千克農(nóng)產(chǎn)品或飼料中的抱子數(shù)量為1〇6~ l〇w個；在25~42°C發(fā)酵，每隔1化翻拌一次，48~7化后結(jié)束發(fā)酵。
[0024] 所述的黃曲霉素優(yōu)選為黃曲霉毒素Bi。
[0025] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0026] (1)本發(fā)明所篩選到的黑曲霉菌株，在植物多酪的協(xié)同作用下，會大大增強其競爭 抑制作用。該菌株不僅顯著抑制黃曲霉生長和產(chǎn)毒，還可w通過發(fā)酵方式降解飼料中已有 的黃曲霉毒素，降解黃曲霉毒素的效率高、特異性強，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價值。
[0027] (2)本發(fā)明的黑曲霉RAF106與茶葉提取物具有明顯的互作效應(yīng)，茶葉提取物可大 大提高RAF106菌株的競爭性，抑制黃曲霉生長和產(chǎn)毒的效率高。本發(fā)明黑曲霉RAF106生 物防控黃曲霉毒素的方法操作簡單，對飼料和環(huán)境無污染，不破壞飼料的營養(yǎng)物質(zhì)，黑曲霉 生長過程中產(chǎn)生的纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等，可W促進農(nóng)產(chǎn)品中的纖維素和淀粉有限 降解，提高其營養(yǎng)價值。
【附圖說明】
[002引圖1為黑曲霉RAF106菌株菌落形態(tài)圖；
[0029] 圖2為黑曲霉RAF106與茶葉提取物協(xié)同增效在對時培養(yǎng)中對黃曲霉生長的抑制 效果圖，其中；a為不添加茶葉提取物；b為添加茶葉提取物；
[0030] 圖3為茶葉提取物對黃曲霉產(chǎn)抱的影響結(jié)果，其中：組間比較，不同小寫字母表示 差異顯著（P< 0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著（P> 0.05);
[0031] 圖4為黑曲霉RAF106對黃曲霉產(chǎn)抱的影響結(jié)果，其中：組間比較，不同小寫字母表 示差異顯著（P< 0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著（P> 0.05);
[0032] 圖5為黑曲霉RAF106與茶葉提取物在玉米粉發(fā)酵中對黃曲霉產(chǎn)抱的影響，其中； 組間比較，不同小寫字母表示差異顯著（P< 0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著（P> 0. 05);
[0033] 圖6為黑曲霉RAF106與茶葉提取物在抑制黃曲霉毒素Bi的協(xié)同增效作用，其中： 組間比較，不同小寫字母表示差異顯著（P < 0. 05)，相同小寫字母表示差異不顯著（P > 0. 05);
[0034] 圖7為黑曲霉RAF106在玉米粉發(fā)酵中對黃曲霉毒素Bi的降解結(jié)果，其中；組間比 較，不同小寫字母表示差異顯著（P< 0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著（P> 0.05)。
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0036] 實施例1
[0037] 黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保 藏編號為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC);保藏單位地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（100101)。
[003引黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基的配方為；馬鈴馨200g，庶糖20g，瓊脂20g，蒸 饋水lOOOmL，抑自然，121°C滅菌15min。也可使用市售的馬鈴馨庶糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基。
[0039] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)條件為；茄子瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時 間4d。
[0040] 在PDA培養(yǎng)基添加0. 5%的茶葉提取物按加入培養(yǎng)基，制作PAD平板，在上述培養(yǎng) 基平板中央點接RAF106,在相隔2cm的地方點接黃曲霉As3. 4408, 28°C恒溫培養(yǎng)4山通過菌 落直徑觀察抑菌效果。
[0041] 結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，黑曲霉RAF106菌落明顯增大，而黃曲霉菌落顯著 變小，可見，黑曲霉抑制黃曲霉的生長與茶葉提取物具有顯著的協(xié)同增效作用。
[0042] 實施例2
[0043] 黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保 藏編號為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC);保藏單位地址為中國北京