一種聚球藻的無菌收集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藻類收集領(lǐng)域，特別涉及一種用于食品、藥品領(lǐng)域的聚球藻的無菌收集方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻，作為生物質(zhì)能源已經(jīng)存在很多種收集方法，工業(yè)上采用的方法主要有離心法、超濾法、氣浮法與絮凝法。微藻在食品藥品生產(chǎn)工藝上尚不存在實(shí)用的收集方法，特別是針對于GMP無菌車間內(nèi)的連續(xù)培養(yǎng)工藝，缺少一種連續(xù)的收集方法。
[0003]離心法即利用高速離心機(jī)對微藻細(xì)胞進(jìn)行離心濃縮，是實(shí)驗室普遍采用的收集藍(lán)藻的方法。但其能源消耗大，操作繁瑣，且離心過程中易導(dǎo)致細(xì)胞破碎，造成損失；超濾法投資大、操作費(fèi)用高，必須選擇合適的操作壓力。如果壓力過小，則操作時間長，生產(chǎn)效率不高，而壓力太大，又會影響細(xì)胞的活性同時也可能使超濾膜損壞；氣浮法由于添加了一定量的絮凝劑使藻細(xì)胞絮凝聚團(tuán)或表面活性劑改良?xì)馀荩粌H加重了后續(xù)工藝負(fù)擔(dān)，且易污染產(chǎn)品，也不利于培養(yǎng)液的循環(huán)利用。絮凝劑法，不能用于食品藥品領(lǐng)域，因為絮凝劑本身有毒害作用，而且難以降解，為后續(xù)處理造成很大不便。
[0004]聚球藻是超微型光合自養(yǎng)原核生物，也是海洋藍(lán)細(xì)菌最主要的代表性類群之一。目前，尚不存在針對聚球藻的收集方法。傳統(tǒng)的離心法成本過高；絮凝法損害藻細(xì)胞，造成蛋白大量流失。
[0005]專利CN103266063A的方法專為能源微藻的收集而設(shè)計，成本較低，但需要加入硝酸、硫酸等酸液，對于真核藻細(xì)胞膜破壞較小，但經(jīng)試驗證明對于原核藻細(xì)胞膜破壞較大，會直接造成細(xì)胞破裂，造成蛋白大量流失，也不適用于GMP車間。
[0006]專利CN103184158A通過通入空氣或惰性氣體減少藻液0)2的濃度，降低光合作用，通過提高藻液PH使微藻產(chǎn)生自動絮凝沉淀。但是該法需要較長的處理時間，包括預(yù)先通氣5個小時，再靜置2個小時，只適合那些降低光合作用會升高pH的藻類，并且長時間的堿性條件會造成細(xì)胞蛋白組分的改變，不適用于對蛋白成分要求較高的食品藥品領(lǐng)域。
[0007]專利CN103484373A已聲明適用于培養(yǎng)液中鈣鎂離子較高的藻類，如杜氏海藻(Dunaliella salina)等真核藻，而經(jīng)試驗證明難以用于培養(yǎng)液中鈣鎂離子不高的藍(lán)藻等原核藻。并且收集過程中還需通入廢氣來實(shí)現(xiàn)，而對于廢氣的來源及廢氣有毒有害成分未做分析，用于能源微藻收集尚可，但絕對不能用于食品藥品領(lǐng)域，更不能用于GMP車間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種聚球藻的無菌收集方法，該方法無菌操作，適合聚球藻用于食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用，并滿足GMP(良好作業(yè)規(guī)范)標(biāo)準(zhǔn)，而且聚球藻中的蛋白細(xì)胞不易遭到破壞，蛋白析出量低，收率高。
[0009]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0010]一種聚球藻的無菌循環(huán)收集方法，其步驟包括:
[0011](I)、將初始聚球藻液從光生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移至聚球藻無菌收集裝置中避光、密封保存，溫度從降至6-8°C。優(yōu)選的，平均降溫速率為1.50C /分鐘；藻液溫度迅速達(dá)到6-8°C時，并不破壞聚球藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而聚球藻生理活性降低，光合作用與呼吸作用基本停止，細(xì)胞會自然下沉，利于收集。
[0012]避光時，由于聚球藻具有趨光性，光照條件下細(xì)胞運(yùn)動活躍，避光可有效減少細(xì)胞運(yùn)動，利于凝聚。藻液轉(zhuǎn)移量為10-20%，未轉(zhuǎn)移的藻液加入新培養(yǎng)劑稀釋后，聚球藻密度更容易恢復(fù)到0.8-1.2g/L。
[0013](2)、在聚球藻液中加入pH調(diào)節(jié)劑并以150-200rpm的速度攪拌，將聚球藻液的pH值調(diào)節(jié)至10-10.5 ;將藻液再次降溫至6-8°C，保存8-15分鐘。優(yōu)選的，平均降溫速率為1.5°C / 分鐘。
[0014]pH調(diào)節(jié)為10-10.5時，聚球藻細(xì)胞表面會分泌黏性膠狀物質(zhì)(糖蛋白與小分子蛋白)，屬于聚球藻的獨(dú)有現(xiàn)象，膠狀物質(zhì)促使細(xì)胞凝聚成團(tuán)，同時阻止了大分子蛋白的析出。
[0015](3)、從聚球藻無菌收集裝置的出樣口收集聚球藻濃縮液；
[0016](4)、排出聚球藻上清液，并在上清液中加入培養(yǎng)劑，用質(zhì)量濃度為10%的鹽酸將其pH值調(diào)節(jié)至7-7.5，加入光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，密度達(dá)到0.8-1.2g/L后，從光生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移10-20%的藻液，轉(zhuǎn)入聚球藻無菌收集裝置中循環(huán)收集10-30小時。
[0017](5)、重復(fù)步驟(I)-⑷。
[0018]所述步驟(I)中，初始聚球藻液的密度為0.8-1.2g/Lo該密度下，聚球藻的生長達(dá)到對數(shù)期后期，蛋白表達(dá)率相對較高，有害次級代謝產(chǎn)物相對較少，是理想的收獲期，同時光反應(yīng)器中剩余仍處于對數(shù)期的聚球藻可用于連續(xù)培養(yǎng)，生長速率較高。
[0019]所述步驟⑵中，將濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液作為pH調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)聚球藻液的pH值。
[0020]所述步驟(4)中，培養(yǎng)劑由NaN03、K2HPO4.3H20、Na2CO3> CaCl2.2H20、Na2CO3>MgSO4.7H20、ZnSO4.7H20、MnCl2.4H20、Na2MoO4.2H20、H3BO3' Ca (NO3) 2.6H20、CuSO4.5H20 和檸檬酸鐵銨組成。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)劑中的NaN03、K2HPO4.3H20、Na2C03、CaCl2.2H20、Na2CO3及檸檬酸鐵銨的重量比為1:0.02:0.2:0.018:0.001:0.03:0.006 ;所述培養(yǎng)劑中的NaNO3、MgSO4.7H20、ZnSO4.7H20、MnCl2.4H20、Na2MoO4.2H20、H3BO3, Ca (NO3) 2.6H20、CuSO4.5H20的加入量比為 Ig:0.03mg:0.1mg:0.9mg:0.15mg: 1.5mg:0.025mg:0.04mg。
[0021]所述培養(yǎng)劑中的NaNO3和上清液的加入量配比為lg/L。相對于普通藻類培養(yǎng)劑來說，本方法的培養(yǎng)劑中氮、鐵、鎂元素含量較高，適合聚球藻快速生長。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0023]1、所述聚球藻的無菌收集方法可減少聚球藻細(xì)胞的蛋白析出，析出的少量蛋白經(jīng)檢驗均為15kda以下的小分子蛋白，不導(dǎo)致高價值蛋白析出，提高了聚球藻的利用價值。
[0024]2、所述聚球藻無菌收集過程中添加的助劑極少，而且無毒無污染，不生成有害物質(zhì)，可循環(huán)利用。
[0025]3、所述聚球藻無菌收集方法中的上清液可循環(huán)培養(yǎng)利用，整個收集和培養(yǎng)過程都在密封、遮光的條件下進(jìn)行，提高了聚球藻的收集質(zhì)量。
[0026]4、本發(fā)明的收集方法，根據(jù)光生物反應(yīng)器的生產(chǎn)規(guī)模，任意調(diào)控收集頻率以滿足生產(chǎn)需要，適應(yīng)性強(qiáng)，而且收率高。
【附圖說明】
[0027]圖1是實(shí)施例2中的進(jìn)入聚球藻無菌收集箱后10、20、30、40、50分鐘后的聚球藻藻液，稀釋10倍后置于顯微鏡后的照片。
[0028]圖2是實(shí)施例2中的上清液用Braford法蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0029]圖3是實(shí)施例2中的上清液的電泳圖。
[0030]圖4是實(shí)施例1中的上清液與濃縮液的占比圖。
[0031 ] 圖5是實(shí)施例1中的上清液的OD值變化圖。
[0032]圖6是實(shí)施例1中單次收集體積與密度恢復(fù)時間的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0034]實(shí)施例1
[0035]100L光生物反應(yīng)器的收集工藝，所用藻種為聚球藻(Synechococcus sp.PCC7002)
[0036]1、將密度為0.8g/L的聚球藻藻液從光生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至聚球藻無菌收集裝置中，然后放入冷柜中降溫至8°C，取出降溫速率為1.5°C /分鐘；
[0037]2、在藻液中加入2mol/L的氫氧化鈉溶液，以攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm迅速攪拌，調(diào)節(jié)藻液的PH值至10 ；
[0038]3、