專利名稱：一種從大腸桿菌中制備多核苷酸磷酸化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種從大腸桿菌中制備多核苷酸磷酸化酶的方法，特別是涉及一種用溶菌酶破碎細(xì)胞的方法從大腸桿菌中大規(guī)模提取多核苷酸磷酸化酶。
現(xiàn)代科學(xué)發(fā)現(xiàn)，多核苷酸磷酸化酶在多種生物體中都廣泛的存在著，目前要想得到大量的此酶都要從細(xì)菌中提取，但是，不同的菌中多核苷酸磷酸化酶的含量差別很大，而且用不同的破碎方法提取的酶量差別也很大。現(xiàn)有的技術(shù)中，如用超聲波、玻璃砂細(xì)菌磨、細(xì)胞破碎器等，一般每100克菌體只能得到100-3000單位的多核苷酸磷酸化酶，產(chǎn)量低，且不穩(wěn)定，有時(shí)甚至沒有什么活力。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為不能單獨(dú)的用溶菌酶破碎方法提取可合用的酶，他們認(rèn)為溶菌酶含有大量的裂解酶而不適宜用做制備多核苷酸磷酸化酶。
本發(fā)明的目的是提供一種利用含有豐富的多聚核酸酶的大腸桿菌，采用單獨(dú)使用溶菌酶破碎細(xì)菌的工藝制備大量的多核苷酸磷酸化酶的方法。
本發(fā)明的方法是將經(jīng)培養(yǎng)的100克菌體溶于含有10-2-10-4EDTA的0.01-0.1MTris-Hcl(PH6-8)的緩沖液中攪拌下，加入0.25-1g溶菌酶，在0-39℃恒溫水浴下溫育30-60分鐘，在冷凍離心機(jī)中，離心20-60分鐘，8000-12000轉(zhuǎn)/分，上清液經(jīng)純化可得到2-3萬(wàn)單位的多核苷酸磷酸化酶。
本發(fā)明的方法中所述的純化可以包括加入硫酸鏈霉素，冰浴放置，離心去沉淀;加入硫酸銨，冰浴放置、離心去沉淀;加入硫酸銨，冰浴放置，離心、收集沉淀;用DEAE-纖維素柱層析用不同濃度的NaclTris緩沖液洗脫分離，得到高濃度的多核苷酸磷酸化酶洗脫液。
所述方法中的菌體選用的是大腸桿菌B型菌種，它含有豐富的多聚核酸酶，且多核苷酸磷酸化酶的含量高，適合做生產(chǎn)此酶的菌株，與其它菌種比較，多核苷酸磷酸化酶的產(chǎn)量明顯有大幅度提高。
如表1 所述方法中的溶菌酶是由上海東風(fēng)試劑廠提供的，從雞蛋蛋白中提取的。
本發(fā)明用溶菌酶破碎細(xì)菌的方法，每100克菌體可得到2-3萬(wàn)單位的多核苷酸磷酸化酶，重復(fù)性很好，層析分析中，活力峰與蛋白峰吻合，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例將100克大腸桿菌菌體溶于含有10-3EDTA的0.02M Tris-Hcl(PH8.0)緩沖液中，攪拌下加入1g溶菌酶(25000單位/1g)，在37℃恒溫水浴溫育50分鐘，在冷凍離心機(jī)中離心30分鐘(9000轉(zhuǎn)/分)去除碎片;取出清液加入10%的硫酸鏈霉素(按5%體積)，冰浴中放置10分鐘，離心30分鐘(9000轉(zhuǎn)/分)除去沉淀;取上清液加入硫酸銨，至35%的飽和度，于冰浴中靜置30分鐘，離心30分鐘(9000轉(zhuǎn)/分);取上清液再加入硫酸銨，至60%的飽和度，于4℃的冰箱中放置過夜后離心30分鐘(9000轉(zhuǎn)/分);將得到的酶蛋白沉淀物在4℃攪拌下溶于前面所述的緩沖液中，對(duì)相同緩沖液進(jìn)行透析，直到無(wú)硫酸根離子;將透析好的粗酶液上到用含0.001M EDTA的0.02M Tris-Hcl(PH8)緩沖液平衡好的DEAE-Callulase-32柱子上，分別用0.1M Nacl，0.2M Nacl，0.35M Nacl的0.001M EDTA，0.02M Tris-Hcl(PH8)的緩沖液洗脫，從0.35M Nacl濃度的洗脫液中可得到2.8萬(wàn)單位的多核苷酸磷酸化酶。
權(quán)利要求
1.一種從大腸桿菌中制備多核苷酸磷酸化酶的方法，其特征在于將經(jīng)培養(yǎng)的每100克大腸桿菌菌體溶于含有10-2-10-4EDTA的0.01-0.1MTris-Hcl(PH7-8)的緩沖液中，攪拌下加入0.25-1g溶菌酶，在0-39℃恒溫水浴下溫育30-60分鐘，在冷凍離心機(jī)中，以8000-12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心20-60分鐘，上清液經(jīng)純化可得到2-3萬(wàn)單位的多核苷酸磷酸化酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的純化步驟是加入硫酸鏈霉素;冰溶放置離心去沉淀;加入硫酸銨，冰浴放置，離心收集沉淀;經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到高濃度的多核苷酸磷酸化酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中大腸桿菌菌株為大腸桿菌B型菌株。
全文摘要
本發(fā)明為一種單獨(dú)使用溶菌酶從自選大腸桿菌中提取多核苷酸磷酸化酶的方法，主要過程是將大腸桿菌、溶菌酶溶于緩沖溶液中，水浴溫育一定時(shí)間后離心分離，上清液經(jīng)多次提純分離，得到大量的多核苷酸磷酸化酶。此方法，每100克菌體可得到1—3萬(wàn)單位的多核苷酸磷酸化酶，重復(fù)性好，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1106861SQ9410100
公開日1995年8月16日 申請(qǐng)日期1994年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月7日
發(fā)明者陸傳宗, 宋蘭芝, 徐秀璋, 嚴(yán)敏官, 候桂珍, 房月華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所