專利名稱：重組大腸桿菌表達酮還原酶生物制備 (s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種表達酮還原酶的重組大腸桿菌的應用，尤其是由導入全基因序列合成的酮還原酶酮還原酶的重組菌，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物不對稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法。
背景技術：
4_ 氯 _3_ 輕基丁酸乙酯(ethyl 4-chloro-3_hydroxyrate，CHBE)是一種重要的有機中間體，其最主要的用途是合成降膽固醇藥物阿托伐他汀的前體化合物。其手性單一對映體S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((S)-CHBE)可用于很多活性藥物的合成，如羥甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)還原酶抑制劑和1，4-二氫吡啶類P -阻滯劑等。潛手性物質4_ 氯乙酸乙酸乙酯(ethyl 4-chloro-3_oxobutanoate，COBE)具有易于合成且價格低廉的優(yōu)點，以其作為反應原料進行不對稱制備手性CHBE是非常經濟有效的途徑。而且在反應過程中微生物不會利用反應的產物(S)-CHBE，因此可以利用微生物全細胞進行制備反應，反應進行更為簡便。目前，以COBE不對稱還原制備手性CHBE的研究已經有很多的報道。主要制備方法有化學法和生物法?；瘜W催化不對稱還原主要是利用銠、釕等金屬作為催化劑，在高溫高壓等條件下進行催化合成?；瘜W催化法不僅耗費了昂貴的催化劑，且反應條件苛刻、耗能高、廢棄的重金屬催化劑對環(huán)境污染大，反應產物的光學純度也不夠高。生物催化法由于其反應迅速，反應條件溫和，副產物較少，產物的處理簡單等優(yōu)點，越來越受到關注，其主要可分為酶催化和微生物催化。酶催化法是指利用從微生物細胞中分離純化的酶(或商品酶)用為反應的催化劑來進行反應，其過程操作繁瑣且酶容易失活，反應過程還需要額外添加輔酶(一般為NAD (P)H)，成本較高。微生物催化即利用完整的微生物細胞內專一酶系的立體選擇性，在細胞體內選擇性的催化底物轉化成產物。但由于細胞中存在的酶體系復雜，往往催化產物的光學純度也不高，需要篩選優(yōu)良的微生物菌株或通過克隆重組基因來實現(xiàn)改良。同時也需要輔酶的加入來提供反應的還原力。因此，在目前利用生物法不對稱還原COBE來制備(S) -CHBE的技術中，底物轉化率低，產物光學純度低和輔酶循環(huán)再生(控制成本)等問題有待進一步研究解決。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是一種重組大腸桿菌表達酮還原酶在COBE不對稱還原制備(S)-CHBE中的方法。為解決上述技術問題，設計技術方案如下:用于不對稱制備(S)-CHBE的重組大腸桿菌，是導入了酮還原酶(酮還原酶)基因的大腸桿菌。用于提供還原力NAD (P) H的重組大腸桿菌為導入了葡萄糖脫氫酶GDH的大腸桿菌。
上述酮還原酶(酮還原酶)基因，是通過密碼子優(yōu)化全基因合成的，其含有852bp堿基，其在Genbank中的收錄號KC426948，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。由該基因編碼的酮還原酶包含283個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。上述葡萄糖脫氫酶⑶H基因含有786bp堿基，其在Genbank中的收錄號為KC426949，其基因序列如SEQ ID NO: 3所示。由該基因編碼的酮還原酶包含261個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。本發(fā)明即通過密碼子優(yōu)化全基因克隆了酮還原酶酮還原酶基因，將其構建在載體pET28a上并在大腸桿菌中表達。hkBaciIlus克隆葡萄糖脫氫酶(O)H)基因，將構建到載體pET28a上并在大腸桿菌中表達。表達所用的大腸桿菌菌株為BL21( DE3)，為本
實驗室保藏。構建上述重組大腸桿菌的方法如下:全基因合成酮還原酶酮還原酶序列和克隆葡萄糖脫氫酶GDH基因，將其構建在pET28a上并分別在大腸桿菌中表達，獲得不對稱制備
(S)-CHBE的重組大腸桿菌。構建的表達酮還原酶酮還原酶的大腸桿菌能不對稱的制備(S)-CHBE，而所構建的葡萄糖脫氫酶GDH又能夠以葡萄糖為輔助底物，使得NADH再生循環(huán)，因而加入少量的NAD (P) +或者利用細 胞中原有的輔因子就能現(xiàn)實反應中NAD (P) H的高效循環(huán)利用。利用上述重組大腸桿菌不對稱制備(S)-CHBE的方法如下:
以COBE為底物，以葡萄糖為輔助底物，以NAD (P) +為輔因子，由導入酮還原酶基因酮還原酶和葡萄糖脫氫酶GDH基因的重組大腸桿菌進行轉化反應不對稱制備(S)-CHBE。其中，底物COBE的初始反應濃度為12.1 96.8g/L，葡萄糖初始反應濃度為10 100g/L、輔因子NAD(P)+的初始濃度為(Tl.5mmol/L，重組大腸桿菌的用量以濕細胞計為1(T100 g/L，雙菌體質量比為0.25 4。其中，所述的反應溫度為15 40° C，反應轉速為5(T200rpm，反應時間2 16h。其中，所述的轉化水相轉系統(tǒng)，所用是水相反應系統(tǒng)為濕重大腸桿菌細胞在pH4.(Tl0.的緩沖溶液中進行轉化。有益效果:本發(fā)明的不對稱制備(S)-CHBE的重組大腸桿菌可以在不添加輔因子的情況下(即添加的NAD⑵+為0)，高效的催化COBE生成⑶-CHBE，光學純度e.e值達到100%，對底物轉化率超過92%，降低了生產成本。對比其他水相中的催化反應，其產物的光學
純度高。


圖1、圖2分別為酮還原酶酮還原酶基因和葡萄糖脫氫酶⑶H基因與載體pET28a的構件圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1酮還原酶基因的獲取根據magnoliae的酮還原酶氨基酸序列,利用萬.coli密碼子偏嗜性進行優(yōu)化獲得新的基因序列(Genbank:KC426948)，送上海生工合成，基因兩端分別添加Ncol、BamHI酶切位點。NcoI酶切位點:CCATGG，BamHI酶切位點:GGATCC。實施例2葡萄糖脫氫酶基因的獲取
枯草芽孢桿菌(Bacillus subti I is ) LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%, pH7.00將枯草芽孢桿菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中37° C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa公司產品)提取基因組。構建表達載體所用的引物加設酶切位點，引物序列如下:
⑶H-Fl:5’ -CGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’ EcoRI 酶切位點 GDH-Rl:5’ -GAAGCTTTTATGTTTAACCGCGGCCTG -3’ HindIII 酶切位點 引物由上海生物工程有限公司合成?；騊CR (50ul反應體系)條件如下:
94° C預變性5min ;94° C變性45s，52° C退火45s，68° C延伸lmin，30個循環(huán)；再68° C延伸IOmin ;冷卻至16° C，結束反應。實施例3酮還原酶基因的表達
用EcoRI及HindIII分別酶切pET-28a (pET_28a購于Novagen(默克中國))及所合成含有兩個酶切位點的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達載體，將已雙酶切的表達載體pET-28a與目的基因用T4連接酶進行連接過夜，將IOML的連接產物pET-28a-酮還原酶加入100ML的BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，冰上放置30min，42° C熱激90 S。冰上放置2min。加入預熱的0.45mL培養(yǎng)基。200rpm 37° C培養(yǎng)lh。將200ML菌液加入分別含有50 u g/mL的卡那霉素和氯霉素的LB平板上，37° C過夜培養(yǎng)12_16h。構建圖譜見圖1。實施例4葡萄糖脫氫酶基因的表達
用EcoRI及HindIII分別酶切pET-28a(pET-22a購于Novagen (默克中國)及所擴增到的含有兩個酶切位點的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達載體，將已雙酶切的表達載體pET-28a與目的基因用T4連接酶進行連接過夜，將10 y L的連接產物pET-28a-GDH加入100 y L的BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，冰上放置30min，42° C熱激90 S。冰上放置2min。加入預熱的0.45mL培養(yǎng)基。200rpm 37° C培養(yǎng)lh。將200 y L菌液加入分別含有50iig/mL的卡那霉素和氯霉素的LB平板上，37° C過夜培養(yǎng)12_16h。構建圖譜見圖2。實施例5酶活的測定
挑取重組菌BL21 (DE3)-pET28a-酮還原酶和BL21 (DE3)-pET28a_GDD及出發(fā)大腸桿菌BL21(DE3)至含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37° C培養(yǎng)至0D600約為0.8時，加入IPTG至終濃度Immol L—1，于30。C, 200rpm,誘導表達IOh后，離心(4。C, 4000rpm, 15min),菌泥用IOOmM磷酸鉀緩沖(PH7.0)重懸，超聲破碎細胞(功率300W，超聲5s，間歇5s，共5min)，離心(4° C，12000rpm, IOmin),測定 上清中的酶活。還原酶酮還原酶活性測定:反應體系為3mL 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中含有0.3mM NAD (P) H，5mM底物4-氯乙酰乙酸乙酯和適量粗酶液。加入酶液后立即開始掃描反應體系在340nm處吸光度的變化。脫氫酶⑶H活性測定體系:反應為3mL 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中含有0.3mM NAD(P)H, 0.2M底物葡萄糖和適量粗酶液。加入酶液后立即開始掃描反應體系在340nm處吸光度的變化。酶活定義為每分鐘內氧化liimol NAD(P)H所需要的酶量為一個酶活單位(U)。同時，采用Bradford方法測定該無細胞粗酶液中蛋白質含量。結果顯示，出發(fā)大腸桿菌BL21(DE3)的比酶活為0.0099 U/mg，而重組菌BL21 (DE3) /pET28a-GDH的比酶活為8.2U/mg,重組菌BL21 (DE3)/pET28a_酮還原酶比酶活為 4.8U/mg。實施例6 重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET28a_ 酮還原酶及 BL21 (DE3) /pET28a_GDH的發(fā)酵挑取重組菌至含抗生素的LB培養(yǎng)液，37° C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37° C培養(yǎng)至0D600約為0.8時，加入IPTG至終濃度lmmol/L，于30° C, 200rpm,誘導表達IOh后,8000rpm, 4° C離心IOmin,棄上清，收集菌體備用。實施例7取實施例6的菌體用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH7.0)洗滌兩次，固定稱取0.5g (濕重)的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-酮還原酶菌泥，分別加入0.25 4倍質量比的大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-GDH菌體，懸浮于IOmL的pH7.0磷酸鉀緩沖中。加入葡萄糖 10g/L，C0BE24.2g/L,NAD (P) +0.5mmol/L，30° C，150rpm 下反應 18h 結束，測定其產物含量與對映體過量值，結果如表I。表I雙菌質量比例對轉化的影響
權利要求
1.一種重組大腸桿菌表達酮還原酶生物制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反應濃度為12.r96.8g/L，葡萄糖初始反應濃度為10 100g/L、輔因子NA(P)D+的初始濃度為0 1.5mmOl/L，重組大腸桿菌的用量以濕細胞計為1(T100 g/L，反應溫度為15 40 ° C，反應轉速為5(T200rpm，所用水相反應系統(tǒng)為pH4.(Tl0.0的緩沖溶液中進行轉化反應，反應時間為2 16h。
2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌表達酮還原酶生物制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于導入了酮還原酶基因的重組大腸桿菌不對稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
3.根據權利要求2重組大腸桿菌表達酮還原酶生物制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征是所述的不對稱制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重組大腸桿菌，所述的酮還原酶的基因序列為: atggcaaaga attttagcaa tgtagagtat cccgcacccc cccccgcaca tacaaagaat gagagcttac aagtattaga tttatttaag ttaaatggaa aagtagcaag cataacagga agcagcagcg gaataggata tgcattagca gaggcttttg cacaagtcgg agcagatgta gcaatatggt ataatagcca tgatgcaaca ggaaaagcag aggcattagc aaagaagtat ggagtaaagg taaaggcata taaagcaaat gtaagcagca gcgatgcagt caagcaaaca atagagcaac aaataaagga ttttggacat ttagatatag tagtagcaaa tgcaggaata ccctggacaa agggagcata tatagatcaa gatgatgaca agcattttga ccaagtagta gatgtagact taaagggagt aggatacgta gcaaagcatg caggaaggca ttttagggaa aggtttgaga aagagggaaa aaagggagca ttagtattta cagcaagcat gagcggacat atagtaaatg tcccccaatt ccaagcaaca tataatgcag caaaggcagg agtaaggcat tttgcaaaga gcttagcagt cgagtttgca ccctttgcaa gggtaaatag cgtaagcccc ggatatataa atacagaga aagcgatttc gtcccccaag agacacaaaa taagtggtgg agcttagtcc ccttaggaag gggaggagag acagcagagt tagtaggagc atatttattc ttagcaagcg atg caggaag ctatgcaaca ggaacagata taatagtaga tggaggatatBC&tt&CCCt BB o
4.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌表達酮還原酶生物制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于以表達酮還原酶重組大腸桿菌為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以葡萄糖作為輔助底物，以表達葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌提供還原力NAD(P)H，不對稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組大腸桿菌表達酮還原酶生物制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，及其在4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應用。以表達該酮還原酶(KRED)基因的重組大腸桿菌耦合葡萄糖脫氫酶(GDH)重組大腸桿菌細胞為催化劑，在添加或不添加輔酶NAD(P)H的條件下，在單一水相中均實現(xiàn)了4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原高效制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，摩爾轉化率高于92%，產物的對映體過量值(e.e.)為100%。
文檔編號C12R1/19GK103173503SQ20131012228
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權日2013年4月10日
發(fā)明者張志斌, 吳小芳, 朱篤, 顏日明, 汪涯 申請人:江西師范大學, 江西蘇克爾新材料有限公司