一種木質(zhì)纖維素高溫酶解發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物質(zhì)能源領(lǐng)域，具體涉及一種木質(zhì)纖維素高溫酶解與發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁醇是一種重要的有機化工原料，在化工、醫(yī)藥和石油等工業(yè)部門有廣泛的用途。而且由于比乙醇多兩個亞甲基，丁醇具有更高的疏水性，較低的揮發(fā)性，可與汽油以任意比例混合，并具有與汽油相當(dāng)?shù)臒嶂?。作為一種有潛力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越來越受到世界各國的關(guān)注。
[0003]隨著石油資源的日益枯竭，降低礦物能源的使用比重，加強可再生能源開發(fā)已成為人類今后能源利用的重要趨勢。而且采用以石油為原料的丙烯羰基合成法生產(chǎn)丁醇由于技術(shù)落后，裝置偏小導(dǎo)致產(chǎn)能不夠，致使中國丁醇市場長期供應(yīng)不足，不能滿足國內(nèi)市場的需求。生物發(fā)酵法制備丁醇有其獨到的優(yōu)勢，發(fā)展生物丁醇將極大地緩解丁醇供應(yīng)不足的現(xiàn)狀。
[0004]由于我國人口眾多，用傳統(tǒng)的原料(玉米和甘蔗)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇勢必會造成與人爭糧的問題，造成糧食短缺，因此開展以可再生的生物質(zhì)材料為原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物丁醇是符合國情的研究方向。木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，蘊含大量的纖維素和半纖維素，例如玉米秸桿干物質(zhì)中纖維素占34-42%，半纖維素占22-28%(岳國君，纖維素丁醇工程概論[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2014)。纖維素的水解產(chǎn)物為葡萄糖，而半纖維素的水解產(chǎn)物主要為木糖，還有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)生的混合糖中，半纖維素糖(主要為木糖)占30%-40%，因此半纖維素糖的發(fā)酵顯得至關(guān)重要。我國政府十分重視能源多元化和環(huán)境污染問題，采取財政補貼和稅收減免等鼓勵措施，大力推進(jìn)多元化替代石油能源的技術(shù)和產(chǎn)業(yè)開發(fā)?！犊稍偕茉捶ā泛汀秶抑虚L期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要》的出臺，極大地推進(jìn)了生物柴油和燃料丁醇等生物液體燃料的開發(fā)進(jìn)程。我國規(guī)劃到2020年，生物燃料消費量占到全部交通燃料的15%左右，建立起具有國際競爭力的生物燃料產(chǎn)業(yè)，這給我國燃料丁醇產(chǎn)業(yè)帶來了良好的發(fā)展機遇。
[0005]纖維素水解過程中纖維素酶的成本和丁醇分離能耗等一直是纖維丁醇工業(yè)化的制約因素。中國專利CN200910098877.8公開了一種纖維素酶產(chǎn)生菌及其制備和應(yīng)用，該菌株具有耐高溫的能力，其分泌的纖維素酶具有耐高溫的特點。中國專利CN201110025776.5公開了一種高溫酸性纖維素酶EgG5及其基因和應(yīng)用，該發(fā)明的纖維素酶具有以下性質(zhì):最適pH3.5?5.0，最適溫度70°C，比活為60.3U/mg;良好的穩(wěn)定性，在極端酸性范圍內(nèi)依然保持較高酶活。
[0006]傳統(tǒng)的纖維素酶工藝采用的纖維素酶較優(yōu)化的酶解溫度為45_50°C，研究表明更高的溫度酶解可以提高酶解效率，減少纖維素酶的使用量，現(xiàn)有耐高溫纖維素酶可以用于高溫酶解制糖，然后發(fā)酵產(chǎn)丁醇，但耐溫纖維素酶產(chǎn)業(yè)還不成熟，遠(yuǎn)未到工業(yè)化的程度。開發(fā)一種能夠使常規(guī)市售纖維素酶提高酶解溫度的方法對纖維素丁醇工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種木質(zhì)纖維素高溫酶解發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法。本發(fā)明方法可以提高酶的活性和利用率，增加發(fā)酵產(chǎn)物得率，可降低了酶解和發(fā)酵成本。
[0008]本發(fā)明木質(zhì)纖維素高溫酶解與發(fā)酵產(chǎn)丁醇方法，包括如下步驟:
(1)對木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，獲得預(yù)處理原料；
(2)將預(yù)處理原料、纖維素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中進(jìn)行預(yù)酶解，控制酶解體系的干物質(zhì)濃度為5wt%-15wt%;控制酶解時間為8-48h;預(yù)酶解的pH為4.5-5.5;預(yù)酶解的溫度為 54-62 °C;
(3)預(yù)酶解后料液打入到發(fā)酵罐中，加入丁醇發(fā)酵菌株進(jìn)行同步糖化發(fā)酵；
(4)發(fā)酵液打入到精餾裝置分離丁醇，及丙酮和乙醇副產(chǎn)物。
[0009]步驟(I)中，木質(zhì)纖維素原料優(yōu)選為玉米秸桿;所述預(yù)處理方式優(yōu)選采用稀酸蒸汽爆破組合預(yù)處理。
[0010]步驟(2)中，木糖醇加入量為0.05-0.30 g/L。
[0011 ] 步驟(2)中，控制酶解時間優(yōu)選為12-24h；預(yù)酶解的pH優(yōu)選為4.8-5.2；預(yù)酶解的溫度優(yōu)選為56-60 °C。
[0012]步驟(2)中，所述的纖維素酶的加入量使得纖維素酶與預(yù)處理原料中纖維素的比例為5-25IU/g纖維素。
[0013]步驟(3)中，同步糖化發(fā)酵是指預(yù)酶解后殘余纖維素在發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)丁醇的同時繼續(xù)被水解的過程。
[0014]步驟(3)中，所述的丁醇發(fā)酵菌種包括:丙酮丁醇羧菌ATCC824和拜氏羧菌NCIMB8052，培養(yǎng)溫度優(yōu)選36-42°C;丁醇發(fā)酵菌種子液的接種量為I v%_5 v%，預(yù)酶解后加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH為6-8，丁醇發(fā)酵菌種利用預(yù)處理和預(yù)酶解階段產(chǎn)生的自由糖生長，同時pH開始下降，最后穩(wěn)定在4.5-5.0，進(jìn)入到同步糖化發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為36-42°C，發(fā)酵時間為48-96h0
[0015]步驟(3)中，同步糖化發(fā)酵體系中加入氮源，氮源可選自酵母膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、酸解豆柏或尿素等中的一種或幾種，加入量為體系總質(zhì)量的0.02 wt%-0.2 wt%0
[0016]步驟(3)中，氮源優(yōu)選酸解豆柏。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
1、在酶解體系中加入木糖醇，提尚纖維素酶的耐受尚溫的能力，提尚酶解的溫度，有利于提高纖維素酶的活性，降低纖維素酶的使用量，提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，提高經(jīng)濟性。
[0018]2、利用丁醇發(fā)酵菌株的耐溫性和生長過程中pH變化特性，對預(yù)酶解后殘余的纖維素進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，可以降低葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制，進(jìn)一步提高纖維素的酶解效率，降低酶成本。
[0019]3、玉米秸桿預(yù)處理過程中可能產(chǎn)生一些對丁醇發(fā)酵菌種具有毒性的化合物，例如甲酸、乙酸、糠醛、羥甲基糠醛和酚類物質(zhì)，利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH還可起到水解液脫毒的作用。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的工藝流程圖；
其中，1-酶解罐，2同步糖化發(fā)酵罐，3-產(chǎn)品分離單元。
【具體實施方式】
[0021]下面通過實施例對本發(fā)明方法作進(jìn)一步說明。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，v%為體積分?jǐn)?shù)。
[0022]實施例1
本發(fā)明實施例使用的木質(zhì)纖維素原料為玉米干秸桿，其中纖維素38.2 wt%，半纖維素22.1 *丨％，木質(zhì)素20.2 *丨％，灰分3.9 wt%，用粉碎機粉碎至顆粒大小為l_5mm。采用稀酸蒸汽爆破進(jìn)行預(yù)處理，反應(yīng)溫度為1900C，反應(yīng)時間5min，固液比為1:2，稀硫酸濃度為2.0wt%。從蒸汽爆破裝置出來后用NaOH調(diào)節(jié)pH為5.0，其中干物質(zhì)濃度為32wt%，干物質(zhì)中纖維素含量為40 wt%，干物質(zhì)中木糖含量20.8%，預(yù)處理干物質(zhì)回收率為96 wt%0
[0023]種子液培養(yǎng)基為丁醇發(fā)酵菌種的常規(guī)培養(yǎng)基，如P2和RCM等，115°C滅菌30min備用。種子液的制備共分3級培養(yǎng):第一級利用接種針從固體培養(yǎng)基中接入到置于10 mL厭氧管中的3 mL種子培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24 h;第二級培養(yǎng)從第一級培養(yǎng)液接種到I L發(fā)酵罐中的500 mL種子培養(yǎng)基中，37°C，100r/m，通入犯厭氧培養(yǎng)24h;第三級培養(yǎng)把第二級培養(yǎng)液全部接種到50 L發(fā)酵罐中的25 L種子培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min，通入N2厭氧培養(yǎng)24
ho
[0024]按圖1所示的流程，采用立式酶解罐的有效容積為240L，同步糖化發(fā)酵罐的有效容積為240 L。將預(yù)處理好的玉米秸桿、纖維素酶(購自諾維信生物技術(shù)有限公司，型號為Ctec2，濾紙酶活135 IU/g)和水按比例連續(xù)加入到酶解罐中進(jìn)行預(yù)酶解，其中預(yù)處理玉米秸桿的加入量為75 kg，纖維素酶加入量0.432 kg加入后相當(dāng)于6.075 I U/g纖維素)，木糖醇加入量0.048 kg，自來水加入量164.52 kg，酶解體系中干物質(zhì)濃度為10 wt%，酶解罐中溫度為58°C，pH 5.0，攪拌速率50 r/min，預(yù)酶解時間為24 h。然后從酶解罐栗入到同步糖化發(fā)酵罐中，利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH為7.5，之后連續(xù)通入犯除去培養(yǎng)基質(zhì)中的氧氣，再接入ATCC824種子液24 L。氮源采用酸解豆柏，加入量0.24 kg，豆柏酸解方法為:0.24 kg豆柏加入到I L 2%的硫酸中，95°C酸解24 h。發(fā)酵罐中溫度為37°C，攪拌速率為100 r/min，N2在整個發(fā)酵過程中一直保持通入，通氣量為0.05 ￥糧<^了0:824生長過程中？!1從7.5下降，最后控制在4.5，同步糖化發(fā)酵時間為96 ho
[0025]通過液相色譜檢測，最終發(fā)酵液中產(chǎn)生的溶劑濃度為22.1g/L，其中丁醇濃度為12.8 8/1，丙酮濃度7.1 8/1，乙醇濃度2.2 g/L。經(jīng)過計算葡萄糖得率為89%，溶劑得率為33%。
[0026]比較例I
處理流程和工藝條件與實施例1相同，不同之處在于:酶解罐中不加入木糖醇，預(yù)酶解溫度為50 °C。
[0027]通過液相色譜檢測，最終發(fā)酵液中產(chǎn)生的溶劑濃度為20.2 g/L，其中丁醇濃度為11.3 8/1，丙酮濃度6.5 8/1，乙醇濃度2.4 g/L。經(jīng)過計算葡萄糖得率為81%，溶劑得率為32%。
[0028]比較例2
處理流程和工藝條件與實施例1相同，不同之處在于:酶解罐中不加入木糖醇，預(yù)酶解溫度為58 °C。
[0029]通過液相色譜檢測，最終發(fā)酵液中產(chǎn)生的溶劑濃度為16.7g/L，其中丁醇濃度為9.4 g/L，丙酮濃度5.3 g/L，乙醇濃度2.0 g/L。經(jīng)過計算葡萄糖得率為66%，溶劑得率為30%。
[0030]實施例2
本發(fā)明木質(zhì)纖維素高溫酶解與發(fā)酵產(chǎn)丁醇方法，