專利名稱：：一種普魯蘭酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)生的耐熱普魯蘭酶及編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開了一種普魯蘭酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)生的耐熱普魯蘭酶。
背景技術(shù)：
：自上世紀(jì)70年代起，酶制劑工業(yè)逐漸成為一個(gè)重要的產(chǎn)業(yè)，目前世界酶制劑總產(chǎn)值達(dá)100億美元，我國的產(chǎn)值約為100億人民幣。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大和新酶種的開發(fā)，酶制劑市場迅速發(fā)展。淀粉水解酶作為第二大類酶制劑，在我國乃至世界上都擁有巨大的應(yīng)用價(jià)值，尤其是近年來隨著生物質(zhì)能源開發(fā)的興起，淀粉已成為生產(chǎn)乙醇的重要原料，淀粉水解相關(guān)的酶類顯示出更加巨大的市場前景(AranoffSL,PearsonDR,OkunDT,LaneCR,WilliamsonIAandPinkertDA.Industrialbiotechnology:DevelopmentandadoptionbytheU.S.Chemicalandbiofuelindustries.U.S.InternationalTradeCommission.Washington,DC.)淀粉酶的研究已經(jīng)有很長的歷史，開發(fā)相對(duì)也比較完善，在淀粉加工中扮演了重要的角色，但是常用的淀粉酶難作用于淀粉中的α-1，6分支，限制了淀粉的水解效率[3]。普魯蘭酶(Pullulanase,EC.3.2.1.41)，又稱去分枝酶，可以特異地水解普魯蘭糖、枝鏈淀粉等各種分枝多糖分子內(nèi)的α-1，6-糖苷鍵，生成相應(yīng)的麥芽三糖和直鏈多糖，與糖化酶協(xié)同使用，能夠顯著提高淀粉的水解程度和利用率。在淀粉加工中，普魯蘭酶與糖化酶合用，不僅降低糖化酶的用量一半以上，而且可提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，大大降低了生產(chǎn)成本(Deweer,Philippe，Amory,Antoine·Pullulanaseproducingmicroorganisms.(Oct.6，1998)USPatent,5817498)ο與淀粉酶相比，國際上有關(guān)普魯蘭酶的研究較少，從1961年Bender和Wallenfels率先從Klebsiellapneumoniae發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶(Hustedt，H.，K.H.Kroner，W.Stach&M.R.Kula,(1978)Procedureforthesimultaneouslarge-scaleisolationofpullulanaseandl,4-alpha-glucanphosphorylasefromKlebsiellapneumoniaeinvolvingliquid-liquidseparations.BiotechnolBioeng20:1989-2005)，一直到1979年，普魯蘭酶的研究一直停留在產(chǎn)酶微生物的發(fā)現(xiàn)和酶學(xué)^^±(Mercier,C.,B.M.Frantz&W.J.Whelan,(1972)Animprovedpurificationofeel1-boundpullulanasefromAerobacteraerogenes.EurJBiochem26:1—9;Nakamura,N.,K.Watanabe&K.Horikoshi,(1975)PurificationandsomepropertiesofalkalinepullulanasefromastrainofBacillusno.202-1,analkalophilicmicroorganism.BiochimBiophysActa397:188—193)。上世鄉(xiāng)己乂V十年代初，丹麥Novo公司分離到可分解普魯蘭多糖的嗜酸性芽抱桿菌(Bacillusacidopullulyticus)，其產(chǎn)生的普魯蘭酶具有耐熱耐酸(60°C，pH4.5)的性質(zhì)，比較適合淀粉工業(yè)生產(chǎn)的需要(Stefanova,Μ.Ε.，R.Schwerdtfeger,G.Antranikian&R.Scandurra，(1999)Heat-stablepullulanasefromBacillusacidopullulyticus:characterizationandrefoldingafterguanidiniumchloride-inducedunfolding.Extremophiles3147-152)。經(jīng)過投入巨資幵發(fā)研究，1983年在日本和歐洲市場同時(shí)商業(yè)化銷售，商品名為ftOmozyme，是如今產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的普魯蘭酶。1995年杰能科公司利用地衣芽孢桿菌異源表達(dá)Bacillusderamificans的普魯蘭酶，并申請了相關(guān)專利(Modderman，J.P.&H.H.Foley,(1995)SafetyevaluationofpullulanaseenzymepreparationderivedfromBacilluslicheniformiscontainingthepullulanasegenefromBacillusderamificans.RegulToxicolPharmacol21:375-381)，其酶學(xué)特性與Novo公司相似，從而成為普魯蘭酶第二大生產(chǎn)商。由于淀粉工業(yè)需要更高的溫度來降低底物粘度、提高反應(yīng)速率和減少污染，相應(yīng)地需要具有更高的熱穩(wěn)定性和在高溫條件下的高活力的普魯蘭酶，因此近年來的研究幾乎全部集中在耐熱普魯蘭酶的發(fā)現(xiàn)和高效表達(dá)。2008年Gomes等人報(bào)道的來自GeobacillusthermoIeovorans的普魯蘭酶由于在85°C半衰期達(dá)到3小時(shí)，成為淀粉工業(yè)關(guān)注的一個(gè)新熱點(diǎn)(ZouariAyadi，D.，M.BenAli,S.Jemli，S.BenMabrouk,M.Mezghani,E.BenMessaoud&S.Bejar,(2008)Heterologousexpression,secretionandcharacterizationoftheGeobacillusthermoleovoransUS105typeIpullulanase.ApplMicrobiolBiotechnol78:473-481)。同時(shí)近年來也涌現(xiàn)了一些相關(guān)專利(PhilippeDandAntoineA.Pullulanase.(Jun.1,1995).USpatent5721127；BrianS.M.andJayaramaK.S.Truncatedformsofpullulanase.(Nov.11,2008).USI^tent7449320)，但是總體上由于研究相對(duì)較少，研究菌種單一，獲得的普魯蘭酶在熱穩(wěn)定性和酶活力上仍然不能滿足淀粉糖化工藝的各項(xiàng)要求。目前，我國在普魯蘭酶的研究上距離歐美國家有很大的差距，工業(yè)用普魯蘭酶完全依賴進(jìn)口，定價(jià)權(quán)掌握在少數(shù)外國公司手中，近乎壟斷的市場供應(yīng)導(dǎo)致了國內(nèi)普魯蘭酶高昂的銷售價(jià)格，極大的限制了國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開發(fā)并大量生產(chǎn)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的耐熱普魯蘭酶對(duì)我國淀粉工業(yè)以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，擺脫普魯蘭酶對(duì)進(jìn)口的依賴，具有重要的經(jīng)濟(jì)和戰(zhàn)略意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種普魯蘭酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)生的普魯蘭酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的普魯蘭酶產(chǎn)生菌是分離自云南騰沖地區(qū)的棲熱菌，為厭氧芽孢桿菌屬的一個(gè)新菌株(Anoxybacillussp.LM18—11)。本發(fā)明所提供的普魯蘭酶是具有下述氨基酸序列特征之一的蛋白質(zhì)1)具有序列表中的SEQIDNo.2所標(biāo)示的氨基酸序列。2)將上述氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基插入和/或缺失和/或取代等方式所產(chǎn)生的新序列。序列表SEQIDNo.2所述的蛋白質(zhì)由707氨基酸殘基組成，位于96688位的氨基酸殘基序列為典型的I型普魯蘭酶結(jié)構(gòu)域，其中108204位的氨基酸序列為普魯蘭酶N-terminus結(jié)構(gòu)域，263572位的氨基酸序列為α-淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域。上述的蛋白質(zhì)特異水解α-1，6_糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶。本發(fā)明提供了編碼上述普魯蘭酶的基因，是具有下列特征之一的核苷酸序列1)具有序列表SEQIDNo.3所示的DNA序列2)可編碼序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的DNA序列3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，可與序列表SEQIDNo.3所限定的DNA序列雜交，且編碼上述氨基酸序列的核苷酸序列。上述的高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在5XSSC，5XDenhardt，S溶液，0.05mg/ml鮭魚精DNA，50%去離子甲酰胺溶液中，65°C下雜交，然后在室溫2XSSC,0.1%SDS，在60V下0.5XSSC，0.1%SDS的溶液中，洗膜15分鐘，各兩次。本發(fā)明提供的普魯蘭酶可有效水解普魯蘭糖、枝鏈淀粉等分子內(nèi)的α-1，6_糖苷鍵，在食品、醫(yī)藥、造紙、洗滌等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。圖1質(zhì)粒pET28a::apulA物理圖譜圖2普魯蘭糖水解產(chǎn)物液相色譜圖A葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖，保留時(shí)間約為4.2分鐘B麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖，保留時(shí)間約為5.8分鐘C麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖，保留時(shí)間約為8.1分鐘D普魯蘭糖經(jīng)ApulA水解30分鐘后，水解產(chǎn)物的液相色譜3=ApulA的最適反應(yīng)溫度圖4=ApulA的最適pH具體實(shí)施辦法除非有特殊說明，本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，具體可參見“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(SambrookandRussell，ed.2001)。DNA片段回收采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按說明書方法操作；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，按說明書方法操作；限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；寡核苷酸引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DNA序列測定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。25μ1常規(guī)PCR反應(yīng)體系為0.1μg模板DNA、1.5mMMgCl2,20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKC1、0.2mMdNTP混合物、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物，以及IUpfu高保真DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf，德國)中進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)。1.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的分離及鑒定樣品采自中國云南騰沖地區(qū)輪馬溫泉下游的淤泥，采樣點(diǎn)位于北緯25°25.357、東經(jīng)98°16.442。實(shí)驗(yàn)中，稱取Ig土樣加入IOOml無菌水，經(jīng)充分混勻靜置30分鐘后，取上清液1ml，做適當(dāng)?shù)奶荻认♂?，涂布于Thermus固體平板，置于恒溫培養(yǎng)箱60°C培養(yǎng)4872小時(shí)。待長出Imm左右大小的菌落后，再分別接種至普魯蘭酶篩選培養(yǎng)基，60°C培養(yǎng)48小時(shí)后，在平板表面滴加魯格式碘液，挑選出其中一株有明顯普魯蘭水解圈的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分析、鑒定。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取該水解普魯蘭糖菌株的基因組DNA。合成16SrRNA擴(kuò)增引物5'-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3‘和5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3‘，以上述菌株基因組DNA為模板，按照下列方案進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C預(yù)變性4分鐘后，再94°C變性30秒、55°C復(fù)性45秒、72°C延伸1分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72°C10分鐘。擴(kuò)增得到一個(gè)約1.4kb的DNA片段，對(duì)該DNA片段進(jìn)行序列測定(SEQIDNo.1)，序列分析的結(jié)果表明該序列5為16SrRNA片段，經(jīng)16SrRNA比對(duì)分析，結(jié)果顯示該菌株為厭氧芽孢桿菌屬菌株，將其命名為Anoxybacillussp.LM18-11，該菌株現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(登記號(hào)CGMCCNo.4320，保藏日期2010年11月10日)，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所。上述實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基及試劑組成1)Thermus培養(yǎng)基(1000ml):lgtryptone,Igyeastextract,IOOmgNitrilotriaceticacid,60mgCaSO4‘2H20,IOOmgMg2SO4‘7H20,8mgNaCl,103mgKNO3,689mgNaNO3,140mgNa2HPO4‘2H20,0.47mgFeCl3·6H20，2.2mgMnSO4‘H2O,0.5mgZnSO4·7H20,0.5mgH3BO3,25μgCuSO4·5H20,25μgNa2MoO4·2H20,46μgCoCl2·6H20,1.5%agar,pH7.8。2)普魯蘭酶篩選培養(yǎng)基(1000ml):5gtryptone,Igyeastextract,0.7gNaNO3,0.IgNa2HPO4,0.2gMgSO4·7H20，0.IgCaCl2,5gpullulan,1.5%agar。3)魯格式碘液(300ml):lgI2,2gKI2.厭氧芽孢桿菌普魯蘭酶基因的克隆通過在Genbank數(shù)據(jù)庫中檢索，獲知在厭氧芽孢桿菌屬中，菌株AnoxybacillusflavithermusWKl已完成了全基因組的測序(GenbankAccessionNo.CP000922)，基因組序列預(yù)測分析顯示，其中編碼一個(gè)I型的普魯蘭酶，該基因座位被命名為"Aflv_0438"。根據(jù)I型普魯蘭酶保守區(qū)進(jìn)行分析，同時(shí)參照該序列，合成普魯蘭酶的保守序列引物5，-AGAAGCGGTGGATCCTTAT-3，和5，-CATTTCCAACTCCTGTTCC-3，，以Anoxybacillussp.LM18-11基因組DNA為模板，按照下列方案進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C預(yù)變性4分鐘后，再94°C變性30秒、50°C復(fù)性45秒、72°C延伸1分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72°C10分鐘，擴(kuò)增得到0.6kb的DNA片段，并對(duì)插入片段進(jìn)行了測序分析(SEQIDNo.3的6731274bp)。以該片段為基礎(chǔ)，采用基因組步移技術(shù)(GenomeWalkingKit，寶生物工程(大連)有限公司)，最終擴(kuò)增得到包含一個(gè)完整閱讀框序列的DNA片段，并測序(SEQIDNo.3)，其中的1402263bp為編碼區(qū)，被命名為apulA。apulA編碼一個(gè)由707個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(SEQIDNo.2)，被命名為ApulA。功能分析的結(jié)果預(yù)測ApulA為一個(gè)可能的I型普魯蘭酶，位于96677位的氨基酸殘基序列為典型的I型普魯蘭酶結(jié)構(gòu)域，其中108204位的氨基酸序列為普魯蘭酶N-terminus結(jié)構(gòu)域，571位的氨基酸序列為α-淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域。3.ApulA的酶學(xué)功能及活性分析3.1普魯蘭酶ApulA表達(dá)載體的構(gòu)建以Anoxybacillussp.LM18-11基因組DNA為模板，合成如下引物5，-CCCCCAAAACAACAGTCGT和5，caactcgagACATTGAATTAATACCCACG，按照下列方案進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C預(yù)變性4分鐘后，再94°C變性30秒、60°C復(fù)性45秒、72°C延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72°C10分鐘，擴(kuò)增得到2.11Λ的DNA片段，將該片段經(jīng))(h0I()酶切回收后，插入到經(jīng)過NcoI-XhoKNcoI酶切端經(jīng)Klenow平滑化處理)的大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(Novagen公司)上，該重組質(zhì)粒被命名為pET-28a::apulA(圖1)，apulA的3，端融合了6XHis編碼序列，表達(dá)產(chǎn)物ApulA的3’端會(huì)帶有一個(gè)由6個(gè)組氨酸殘基組成的His-Tag，可方便用于ApulA的純化。3.2ApulA的表達(dá)及酶活分析將質(zhì)粒pET18a::apulA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)，獲得ApulA表達(dá)菌株BL21/apulA。挑取BL21/apulA單克隆至LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50mg/L)，經(jīng)370C，220rpm過夜培養(yǎng)，按1%的接菌量加入到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)23小時(shí)至0D_達(dá)到0.6后，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.8mmol/L，18°C,160rpm繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)后，4°C，4000rpm離心10分鐘收集菌體，菌體用等體積的0.02mol/LTris緩沖液(三羥甲基氨基甲烷，pH8.0)懸浮后，4°C，4000rpm離心10分鐘收集，用0.05體積的0.02mol/LTris緩沖液(pH8.0)懸浮，超聲破碎后，12000g離心5分鐘，上清液經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾，于4°C保存，即獲得含有ApulA的粗酶液。ApulA的活性分析是以0.5%普魯蘭糖為底物，加入適量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液，在不同的溫度和PH條件下酶解20分鐘，水解產(chǎn)物經(jīng)安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)鑒定，水解產(chǎn)物為麥芽三糖(圖幻，證明ApulA為I型普魯蘭酶；同時(shí)水解產(chǎn)生的還原糖經(jīng)DNS法測定，測定OD54tl光吸收；經(jīng)計(jì)算分析確定ApulA的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度，結(jié)果顯示ApulA的最適反應(yīng)溫度在5560°C之間(表1，圖3)，最適反應(yīng)pH為6.5(表2，圖4)，熱穩(wěn)定性分析的結(jié)果顯示，在PH6.5、60°C的條件下處理80小時(shí)，ApulA仍具有50%以上的活性(表3)。表IApulA的最適反應(yīng)溫度權(quán)利要求1.本發(fā)明提供了一個(gè)普魯蘭酶產(chǎn)生菌，在分類上屬于厭氧芽孢桿菌屬的一個(gè)種，其16SrRNA的序列特征為序列表SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.本發(fā)明提供了一個(gè)上述權(quán)利要求中提到的產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其序列特征為具有序列表SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，或者將該序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基插入和/或缺失和/或取代等方式所產(chǎn)生的氨基酸序列。3.本發(fā)明提供了一個(gè)可編碼上述權(quán)利要求中所述蛋白質(zhì)的核酸序列。4.在上述權(quán)利要求中提到的核酸序列，其序列特征具有下述核苷酸序列之一1)具有序列表SEQIDNo.3所示的DNA序列2)編碼序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的DNA序列3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，可與序列表SEQIDNo.3所限定的DNA序列雜交，且編碼上述權(quán)利要求中所限定的氨基酸序列的核苷酸序列。5.權(quán)利要求2中所述的蛋白質(zhì)可以特異水解普魯蘭糖、枝鏈淀粉等的α-1，6-糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶(Rillulanase)。全文摘要本發(fā)明描述了一個(gè)新分離的普魯蘭酶產(chǎn)生菌，16SrRNA(SEQIDNo.1)結(jié)果分析表明該菌為厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillussp.)，由該菌所分泌的一種蛋白質(zhì)，其序列特征為序列表所示的氨基酸序列，編碼該蛋白的核酸序列為序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，該蛋白質(zhì)特異水解普魯蘭糖分子內(nèi)的α-1，6-糖苷鍵，生成麥芽三糖，是一個(gè)I型普魯蘭酶(Pullulanase)，該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH6.5，在60℃、pH6.5條件下80小時(shí)，仍具有50％以上的活性。文檔編號(hào)C12N1/20GK102120971SQ20101057683公開日2011年7月13日申請日期2010年12月2日優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日發(fā)明者宋詼,徐健勇,李麗,譚明,鄭雯申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所