一種淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的制備方法
【專利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 三角帆鮮（辦俗稱河鮮、珍珠鮮、淡水珍珠鮮等，為淡水雙殼類 軟體動(dòng)物，是我國(guó)傳統(tǒng)的養(yǎng)殖貝類，屬于廣溫、廣鹽的一種貝類。和其他的無(wú)脊椎動(dòng)物相同， 三角帆蚌不具有與脊椎動(dòng)物相類似的"獲得性免疫"機(jī)制，而是主要依靠非特異性免疫來(lái)抵 抗各種外界病原的入侵，以此來(lái)維持生物體正常的生命活動(dòng)。溶菌酶為先天免疫中體液免 疫的重要參與因子，本發(fā)明從分子水平對(duì)三角帆蚌噬菌體型溶菌酶基因進(jìn)行了的研宄，也 是首次報(bào)道在淡水貝類生物體內(nèi)存在噬菌體型溶菌酶。通過(guò)對(duì)珍珠蚌的噬菌體型溶菌酶的 深入的研宄，可以為探索其抗病機(jī)制和研宄新型的抗菌藥，對(duì)珍珠蚌養(yǎng)殖的可持續(xù)性發(fā)展 和生態(tài)健康都是很有意義的。
[0004] 溶菌酶具有獨(dú)特的作用機(jī)制和廣泛的抗菌作用，在臨床上具有多種重要的應(yīng)用價(jià) 值。溶菌酶等天然、安全的抗菌物質(zhì)也越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物飼料中。隨著 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)制不斷深入的研宄、生物技術(shù)日以迅猛的發(fā)展以及國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)水產(chǎn)品 食用安全要求的步步提高，將重組溶菌酶作為綠色藥物應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中并培育轉(zhuǎn)溶菌酶 基因品種，或?qū)⒊蔀閷?shí)現(xiàn)水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖的一條新途徑。
[0005] 金屬螯合親和層析是一種有效的生物分子分離純化技術(shù)，它具有配基簡(jiǎn)單、吸附 量大、分離條件溫和、通用強(qiáng)等特點(diǎn)。影響蛋白純化效果有很多，但其中洗脫條件是主要因 素，包括洗脫液PH、組成及離子強(qiáng)度，這需要針對(duì)不同的蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速獲得表達(dá)量較高的淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重 組蛋白的制備方法。
[0007] 淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的技術(shù)方案是利用設(shè)計(jì)的含有酶切位點(diǎn) 引物將噬菌體型溶菌酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)酶切、轉(zhuǎn)化、篩選構(gòu)建原核表達(dá)載體 pET-30a(+)-LYZPh ;再將原核表達(dá)載體pET-30a(+)-LYZPh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)并用 IPTG進(jìn)行目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含溶菌酶重組蛋白的菌液。
[0008] 本發(fā)明所述步驟如下： (1) 設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)引物； (2) 利用設(shè)計(jì)的含有酶切位點(diǎn)引物將噬菌體型溶菌酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)酶切、 轉(zhuǎn)化、篩選構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a (+) -LYZPh ; (3) 再將原核表達(dá)載體pET-30a(+)-LYZPh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)并用IPTG進(jìn)行 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含溶菌酶重組蛋白的菌液； (4)通過(guò)鎳離子親和柱層析對(duì)上述菌液進(jìn)行純化，用聚乙二醇8000對(duì)重組蛋白進(jìn)行濃 縮后用15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的純化效果； 所述的酶切位點(diǎn)引物包括上游引物：GTGTGAATTCATGGCTGCATCTTCAAACTCA和下游引 CACACTCGAGTCAATCAGCCAAGTTTCTTATTCTCG，上游引物序列中 GAATTC 片段為 EcoRI 酶切位 點(diǎn)；下游引物序列中CTCGAG片段為XhoI酶切位點(diǎn)； 本發(fā)明的有益效果：獲得的噬菌體型溶菌酶重組蛋白效價(jià)高，達(dá)到0. 9mg/ml以上，可 以滿足噬菌體型溶菌酶蛋白的相關(guān)測(cè)定，彌補(bǔ)了淡水珍珠蚌類噬菌體型溶菌酶蛋白的研宄 空白，可為研宄噬菌體型溶菌酶蛋白和相關(guān)溶菌酶產(chǎn)品開發(fā)提供材料。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為三角帆蚌噬菌體型溶菌酶蛋白的擴(kuò)增結(jié)果示意圖，圖中M:DL2000 marker, I: PCR 產(chǎn)物； 圖2為SDS-PAGE鑒定三角帆蚌噬菌體型溶菌酶重組質(zhì)粒在E. coli BL21中的 表達(dá)，圖中 M:Premixed Protein marker(Low)，l :BL21/pET_30a(+)-LYZPh 誘導(dǎo) Oh， 2:BL21/pET-30a(+)-LYZPh 誘導(dǎo) 2h，3:BL21/pET-30a(+)-LYZPh 誘導(dǎo) 4h，4:BL21/ pET-30a (+) -LYZPh 誘導(dǎo) 6h，5 :BL21/pET-30a (+) -LYZPh 誘導(dǎo) 8h，6 :pET-30a (+) -LYZPhl 誘 導(dǎo)后重組質(zhì)粒的超聲上清、7 :pET-30a(+)-LYZPhl誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒的超聲沉淀； 圖3為三角帆蚌噬菌體型溶菌酶蛋白純化結(jié)果示意圖，圖中M :Premixed Protein marker(Low)，l :純化后重組蛋白； 圖4三角帆蚌噬菌體型溶菌酶氨基酸序列的多序列比對(duì)，圖中三角形標(biāo)記為保守的活 性位點(diǎn)； 圖5為三角帆蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白濃度測(cè)定結(jié)果； 注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)中記錄的吸光值得到的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0. 0166x-0. 0128，根據(jù)測(cè)定 得到的樣品0D595值計(jì)算蛋白含量，按照公式：蛋白的濃度=蛋白含量/所加的樣品體積計(jì) 算出重組蛋白濃度為〇· 917mg/ml。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[0011] 一種淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的實(shí)驗(yàn)制備如下： (DcDNA提?。哼x取健康的三角帆蚌，在水族箱中持續(xù)充氧暫養(yǎng)1周。從三角帆蚌血淋 巴中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0012] (2)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前獲得的三角帆蚌噬菌體溶菌酶（以下 簡(jiǎn)稱：CpLYZPh) cDNA的部分全長(zhǎng)，通過(guò)Prime 5. 0軟件設(shè)計(jì)表達(dá)引物：上游引物 GTGTGAATTCATGGCTGCATCTTCAAACTCA，下劃線所標(biāo)為 EcoRI 酶切位點(diǎn)；下游引物 CACACTCGA CTCAATCAGCCAAGTTTCTTATTCTCG，下劃線所標(biāo)為XhoI酶切位點(diǎn)，該引物的退火溫度為58°C。
[0013] (3) CpLYZPh基因的克?。喊凑辗崔D(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，CpLYZPh基 因的PCR擴(kuò)增，以SMART cDNA為模板，擴(kuò)增體系為（25 μ L) :dH2018. 4 μ 1，IOXE Taq Buffer2.5yl，dNTP Mixture(2.5mmol /L each)2yl，上游引物0·6μ1，下游引物 0·6μ1 ，cDNA模板0. 6 μ I，E TaqDNA聚合酶（5u/ μ I) 0. 3 μ 1。PCR擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C 變性 30s，58°C 退火 30s，72°C延伸 lmin，35 循環(huán)，72°C延伸 lOmin。1% 瓊脂糖 凝膠電泳回收CpLYZPh基因片段； (4)原核表達(dá)載體的構(gòu)建：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，按DNA凝膠回收試劑盒回收，用 EcoRI和XhoI分別對(duì)回收產(chǎn)物和pET-30載體進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物回收純化，再用 T4-DNA連接酶4°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，均勻接種于卡那霉素的 LB瓊脂糖平板中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取含有Kana+抗性的克隆，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR 鑒定、EcoRI/XhoI雙酶切鑒定以及送上海生工測(cè)序分析；將測(cè)序驗(yàn)證正確的載體命名為： pET-30a(+)-LYZPh。將含有重組質(zhì)粒的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，用普通質(zhì)粒小提試劑盒抽提重組質(zhì) 粒。
[0014] (5)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL12(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含 Kana+抗性的固體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌落，PCR檢測(cè)，將篩選到的含 陽(yáng)性克隆的BL21 (DE3)菌株接種到含有Kana+抗性的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在37°C，200 rpm/ min條件下培養(yǎng)至006。。為0. 5~0. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，以相同條件繼 續(xù)振蕩培養(yǎng)8h，最后離心收集菌體； (6)重組蛋白的純化：將收集得到的菌體重懸于裂解緩沖液（20mmol/L磷酸鹽， 0. 5mol/L氯化鈉 ，pH 7. 4)緩沖液重懸，超聲裂菌（功率70W，破2s停2 s，超聲15 min， 冰浴）后收集上清。將上清流過(guò)已經(jīng)平衡好的（His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，第一步： 10 倍柱體積的 I XBinding buffer (300mmol/L Nad, 50mmol/L NaH2PO4, lOmmol/L 咪 挫）洗絳柱子；第二步：6 倍柱體積的 I X Washing buffer (300mmol/L Nad, 50mmol/L NaH2P04,50mmol/L咪唑）洗脫雜蛋白；第三步：6倍柱體積的I XElute buffer (300mmol/ L Nacl，50mmol/L NaH2PO4, 300mM咪唑）洗脫目的蛋白；第四步：按上述步驟先后順序 收集目的蛋白，每1ml左右收集一管；第五步：用6倍柱體積的IXStrip buffeKO. 5mmol/ L Nacl, 100 mmol/LEDTA, 20mmol/L Tris-Hcl)最終洗滌。第六步：用 SDS-PAGE 電泳分 析各管收集液，將含有目的蛋白的收集液合并在一起置于透析袋，用聚乙二醇8000濃縮， 得到純化的噬菌體型溶菌酶重組蛋白，檢測(cè)重組蛋白濃度達(dá)到0. 9mg/ml。
[0015] (7)從多序列比對(duì)分析結(jié)果看出，該基因具有噬菌體溶菌酶基因家族的一些保守 功能位點(diǎn)，Glu61和Asp72(圖4)，與已知的噬菌體溶菌酶基因序列同源性較高28~44%， 推斷該序列屬于噬菌體溶菌酶基因。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的制備方法，包括以下步驟： 設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)引物； 利用設(shè)計(jì)的含有酶切位點(diǎn)引物將噬菌體型溶菌酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)酶切、轉(zhuǎn) 化、篩選構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a(+)-LYZPh; 再將原核表達(dá)載體pET-30a(+) -LYZPh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)并用IPTG進(jìn)行目的 基因的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含溶菌酶重組蛋白的菌液； 通過(guò)鎳離子親和柱層析對(duì)上述菌液進(jìn)行純化，用聚乙二醇8000對(duì)重組蛋白進(jìn)行濃縮 后用15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的純化效果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的制備方法，其特 征是，所述的酶切位點(diǎn)引物包括上游引物：GTGTGAATTCATGGCTGCATCTTCAAACTCA和下游引 物：CACACTCGAGTCAATCAGCCAAGITTCTTATTCTCG，上游引物序列中GAAITC片段為EcoRI酶切 位點(diǎn)；下游引物序列中CTCGAG片段為XhoI酶切位點(diǎn)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶重組蛋白的制備方法，該方法通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物，提取三角帆蚌的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)對(duì)噬菌體型溶菌酶基因進(jìn)行克隆測(cè)序，再進(jìn)行原核表達(dá)載體pET-30a(+)-LYZPh的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），得到重組工程菌。將工程菌在LB培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)后重組基因得到大量表達(dá)。產(chǎn)物經(jīng)親和層析柱，得到純化的噬菌體型溶菌酶。本發(fā)明能夠快速獲得表達(dá)量較高的噬菌體型溶菌酶的重組蛋白，彌補(bǔ)了淡水珍珠蚌噬菌體型溶菌酶蛋白的研究空白，可為研究噬菌體型溶菌酶蛋白和相關(guān)溶菌酶產(chǎn)品開發(fā)提供材料。<b/>
【IPC分類】C12N9/36
【公開號(hào)】CN104894085
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510281938
【發(fā)明人】文春根, 胡寶慶, 簡(jiǎn)少卿, 戴文娟
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月28日