本發(fā)明屬于納米纖維領(lǐng)域，特別涉及一種重組蛛絲蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法。

背景技術(shù)：

蜘蛛絲是蜘蛛賴以生存的命繩，數(shù)十億年的大自然進化賦予蜘蛛絲優(yōu)異的機械強度和生物學品質(zhì)，綜合性能遠超蠶絲以及目前最好的人造纖維材，在現(xiàn)代科技生活中有著不可估量的潛在應(yīng)用價值。

蛛絲肉食性，領(lǐng)地意識強，養(yǎng)殖成本高，而且蜘蛛具有同類相食的個性，無法像家蠶一樣高密度養(yǎng)殖。天然蜘蛛絲主要來源于結(jié)網(wǎng)，產(chǎn)量非常低。所以要從天然蜘蛛中取得蛛絲，產(chǎn)量非常有限。因此，通過基因工程的手段實現(xiàn)蜘蛛絲蛋白的原核表達就成為可行的策略了。

周圍神經(jīng)損傷較常見，如何治療使神經(jīng)功能恢復(fù)到理想狀態(tài)仍是個難題。神經(jīng)導(dǎo)管的研制與開發(fā)一直是國際上近十年來的熱點，但是依然沒有出現(xiàn)保證能改善神經(jīng)再生的標準技術(shù)和首選材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重組蛛絲蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，該方法反應(yīng)條件溫和，成本低廉，工藝簡單，易于操作；制備出的神經(jīng)導(dǎo)管具有很好的力學性能及生物相容性。

本發(fā)明的一種重組蛛絲蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，包括：

(1)以大腹園蛛基因組為模板，通過pcr擴增得到梨狀腺絲pysp完整重復(fù)區(qū)的基因片段pysp-rp；將pysp-rp和plx質(zhì)粒分別進行雙酶切，純化回收后混合，再加入t4dna連接酶反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；

(2)將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，37℃過夜培養(yǎng)后，經(jīng)酶切鑒定得到重組質(zhì)粒plx-pysp-rp；再轉(zhuǎn)入bl21感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取重組質(zhì)粒單克隆接入lb培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接入lb培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，然后加入iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體；將菌體重懸于裂解緩沖液中，破菌后，離心、收集沉淀、純化、凍干，得到重組蛛絲蛋白pysp；

(3)將重組蛛絲蛋白pysp與plcl混合溶于溶劑中得到紡絲液，進行靜電紡絲，最后經(jīng)交聯(lián)得到重組蛛絲蛋白神經(jīng)導(dǎo)管。

所述步驟(1)中的pysp-rp的序列如seqidno.1所示。基因片段pysp-rp的基因大小為639bp，編碼213個氨基酸，蛋白分子量為22.9kda。

所述步驟(1)中的pcr擴增所用引物為：

正向引物atgcggatccgctccagcacctgcacctaga；

反向引物atgcctcgagttacggtgctgccagttgagatag。

pcr條件為：98℃預(yù)變性3min，變性5s，65℃退火15s，72℃延伸10s，循環(huán)30次。

所述步驟(1)中的plx質(zhì)粒上具有6個his標簽，用于蛋白鑒定和純化。

所述步驟(1)中的雙酶切具體為加入內(nèi)切酶bamhi和xhoi，37℃下反應(yīng)1-2h進行酶切；連接酶反應(yīng)的反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時間為12-14h。

所述步驟(2)中的連接產(chǎn)物和dh5α感受態(tài)細胞的體積比為1:10；重組質(zhì)粒和bl21感受態(tài)細胞的體積比為1:50；bl21感受態(tài)細胞為bl21(de3)感受態(tài)細胞。

所述步驟(2)中的lb培養(yǎng)基均含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素(即兩個lb培養(yǎng)基均含有氨芐青霉素)。

所述步驟(2)中的iptg的濃度為200μg/ml；誘導(dǎo)培養(yǎng)的工藝參數(shù)為：37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。

所述步驟(2)中的裂解緩沖液為lysisbuffer。lysisbuffer僅含有20mmtris緩沖液，ph8.0。

所述步驟(2)中的破菌的壓強為1100bar；離心的轉(zhuǎn)速為12000r/min。

所述步驟(2)中的純化具體為：將沉淀用含有4m尿素的lysisbuffer漂洗一次后，用含有8m尿素的lysisbuffer重旋沉淀，12000rpm離心后收集上清液，透析于超純水中。

所述步驟(3)中的溶劑為六氟異丙醇，紡絲溶質(zhì)的總質(zhì)量濃度為8％。

所述步驟(3)中的靜電紡絲的工藝參數(shù)為：紡絲電壓14kv，給液速率0.8ml/h，紡絲距離15cm。

所述步驟(3)中的交聯(lián)采用濃度為75％的乙醇溶液。

本發(fā)明首先采用大腹園蛛基因組為模板，采用融合pcr技術(shù)進行拼接，然后構(gòu)建plx-pysp-rp重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行表達，用變性純化方法進行純化，獲得pysp重組蛛絲蛋白溶液，并凍干保存。實驗證明，該重組蛛絲蛋白在大腸桿菌中可以大量表達。經(jīng)過靜電紡，獲得的神經(jīng)導(dǎo)管，在特征上符合神經(jīng)導(dǎo)管的定義，具有神經(jīng)導(dǎo)管的優(yōu)良性能。

本發(fā)明操作簡單易行，原材料成本較低，蛛絲蛋白具有良好的生物相容性，穩(wěn)定性高并對環(huán)境無污染。制備得到的重組蛛絲蛋白表現(xiàn)出良好的形態(tài)特征和生物相容性。得到的靜電紡神經(jīng)導(dǎo)管具有相對較好的力學性能和生物相容性。本發(fā)明使用snapgene軟件，pcr擴增，westernblot與sds-page，變性純化，透析，冷凍干燥等技術(shù)構(gòu)建和純化該蛛絲蛋白，westernblot與sds-page用來對該蛋白進行鑒定，并通過atr-ftir(衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜法)分析該重組蛛絲蛋白與plcl共混的納米纖維膜的二級構(gòu)象特征、掃描電子顯微鏡(sem)觀察與神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜的形貌特征以及親疏水性。

有益效果

(1)本發(fā)明制備工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作純化，所用均為環(huán)境友好的材料；

(2)本發(fā)明制備的pysp-rp重組蛋白表達產(chǎn)量可觀，所制備的混合靜電紡神經(jīng)導(dǎo)管具有較好的力學性能和生物相容性，可以預(yù)見，本發(fā)明制備的神經(jīng)導(dǎo)管具有產(chǎn)業(yè)化實施的前景，是一種潛在的神經(jīng)導(dǎo)管材料。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的電子克隆構(gòu)建流程圖；

圖2是實施例1制備的重組蛛絲蛋白的sds-page鑒定結(jié)果圖；其中，m為蛋白marker，1為誘導(dǎo)前大腸桿菌中蛋白組成，2為誘導(dǎo)后蛋白組成，s為破菌離心后的上清液，p為破菌離心后的沉淀部分；

圖3是實施例1制備的重組蛛絲蛋白的westernblot鑒定結(jié)果圖；其中，m為蛋白marker，1為4m尿素漂洗后的沉淀部分，2為8m尿素溶解后的上清液，3為破菌后總蛋白的westernblot圖，4為8m尿素溶解后上清液，即純化后的蛋白；

圖4是實施例1制備的重組蛛絲蛋白與神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜的sem圖；其中，a-e分別為pysp和plcl的質(zhì)量比0:100、25:75、50:50、75:25和100:0；

圖5是實施例1制備的重組蛛絲蛋白與神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜的紅外分析圖；

圖6是實施例1制備的重組蛛絲蛋白與神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜的水接觸角測試圖；其中，其中，a為pysp和plcl的質(zhì)量比0:100制備的納米纖維膜的水接觸角，b1-b3為pysp和plcl的質(zhì)量比25:75制備的納米纖維膜在水接觸后2s、4s、6s后的圖，c1-c3為pysp和plcl的質(zhì)量比50:50制備的納米纖維膜在水接觸后2s、4s、6s后的圖，d1-d3為pysp和plcl的質(zhì)量比75:25制備的納米纖維膜在水接觸后2s、4s、6s后的圖，e1-e3為pysp和plcl的質(zhì)量比100:0制備的納米纖維膜在水接觸后2s、4s、6s后的圖；

圖7是實施例1制備的重組蛛絲蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的實物照片(pysp和plcl的質(zhì)量比50：50)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

取大腹園蛛基因組1μl，以pysp重復(fù)區(qū)序列設(shè)計的一對正反向引物各2.5μl，加入25μlq5mastermix酶，最后加入19μlddh2o混勻，進行pcr擴增，pcr條件為：98℃預(yù)變性3min，變性5s，65℃退火15s，72℃延伸10s，循環(huán)30次。正向引物為：

atgcggatccgctccagcacctgcacctaga，反向引物為：

atgcctcgagttacggtgctgccagttgagatag。使用1％的瓊脂糖凝膠電泳，切取片段大小為639bp左右，該片段即為pysp-rp。

使用膠回收試劑盒回收，用30μlddh2o洗脫，在洗脫液中分別加入bamhi和xhoi內(nèi)切酶各2μl，buffer5μl，最后加入11μlddh2o混勻后37℃反應(yīng)1小時，同時，吸取30μlplx質(zhì)粒分別加入bamhi和xhoi內(nèi)切酶各2μl，buffer5μl，最后加入11μlddh2o混勻后37℃反應(yīng)1小時后，對反應(yīng)液分別使用pcr產(chǎn)物純化試劑盒回收，都用20μlddh2o洗脫后，吸取片段pysp-rp6μl、酶切后的plx質(zhì)粒2μl、t4ligase酶1μl和酶連buffer1μl混勻后于室溫下連接反應(yīng)12小時，得到連接產(chǎn)物。

取5μl連接產(chǎn)物加入50μldh5α感受態(tài)細胞，進行轉(zhuǎn)化，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進行雙酶切檢查，將酶切正確的再進行送測序，將最終測序正確的重組質(zhì)粒plx-pysp-rp，轉(zhuǎn)入50μlbl21感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取重組質(zhì)粒單克隆接入10mllb培養(yǎng)基(含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入1llb培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至od600為0.8后加入iptg，37℃5h培養(yǎng)后，5000rpm離心收集菌體，同時分別對誘導(dǎo)前后制樣。重懸于50mllysisbuffer(只含有20mmtris緩沖液，ph8.0)中1100bar高壓破菌，12000rpm離心10min，收集沉淀，并對破菌后的沉淀和上清分別制樣，并同時進行sds-page鑒定與westernblottinganti-his鑒定。然后用含有4m尿素的lysisbuffer漂洗一次，用含有8m尿素的lysisbuffer重懸沉淀，分別制樣。12000rpm離心后收上清，透析于超純水中，使用凍干機凍干后，稱重獲得100mg蛋白粉末，即重組蛛絲蛋白pysp。

用hfip(六氟異丙醇)溶解pysp和plcl(聚乳酸:聚己內(nèi)酯＝50:50)，采用8％的總質(zhì)量濃度，以質(zhì)量比0:100、25:75、50:50、75:25和100:0在紡絲電壓14kv、給液速率0.8ml/h、紡絲距離15cm的條件下進行靜電紡絲，最后放入75％的乙醇蒸汽中過夜交聯(lián)，得到由靜電紡絲制備得到的神經(jīng)導(dǎo)管。

從圖2和圖3中可以看出，在sds-page膠圖中相比于誘導(dǎo)前的大腸桿菌中的蛋白分布，誘導(dǎo)后在35kda和25kda之間，明顯多了一條表達量較高的蛋白條帶，并經(jīng)westernblot抗his標簽的蛋白且與sds-page膠圖中多出的蛋白條帶位置重合。說明該重組蛛絲蛋白在大腸桿菌中獲得高表達。

由圖4可知，本實施例的神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜直徑分布相對集中，均勻，主要在500nm左右。

由圖5可知，含有重組蛛絲蛋白的與神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜中，吸收峰主要在1610cm^-1～1640cm^-1之間(酰胺ⅰ帶)，說明重組蛛絲蛋白的主要結(jié)構(gòu)是β-sheet。

由圖6可知，該重組蛛絲蛋白確實促進與神經(jīng)導(dǎo)管相對應(yīng)的納米纖維膜親水性的提高。

sequencelisting

<110>東華大學

<120>一種重組蛛絲蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法

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<212>dna

<213>人工序列

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gttcaggcaacttcttcctctcaagcctcggctcaacagagtgccttcgcacagtcccaa180

caatcttcagttgttcaatctcaacaaagttcaaacgcttattctgcagcatcaactgcc240

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