專利名稱：重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以及用于治療ed的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生化領域，具體而言，涉及一種重組^朱毒蛋白、其 制備方法和表達載體以及用于治療ED (男性勃起功能障礙)的藥 物。
背景技術：
陰莖勃起是神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)下勃起器官陰莖海綿體的血流動 力學變化過程。當受到性刺激后，非腎上腺素非膽堿能神經(jīng)元在一 氧化氮合酶(NOS)的催化下合成釋放一氧化氮(NO);副交感神經(jīng)末 梢釋放的已酰膽堿激活陰莖海綿體竇及血管內(nèi)皮細胞一氧化氮合 酶催化下促進NO合成和釋放。NO擴散到陰莖海綿體平滑肌細胞 內(nèi)，激活鳥苷酸環(huán)化酶，z使三磷酸鳥苦轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥香(cGMP)。 細胞內(nèi)cGMP濃度增加，使胞漿內(nèi)釣離子濃度降低，導致海綿體平 滑肌^>弛，陰莖海綿體竇膨脹，動脈血流增加而陰莖海綿體容積增 大。隨著陰莖海綿體體積增大，圍繞陰莖海綿體的白膜被動延伸拉 長，4吏引流海綿體血液的白膜下導靜脈受壓延伸變窄，靜脈回流阻 力增加，陰莖海綿體壓力增強而誘發(fā)陰莖勃起。隨著cGMP被平滑 肌細胞內(nèi)磷酸二酯酶V型(PDE-5)降解，喪失其活性以及射精后交 感神經(jīng)恢復緊張性，陰莖轉(zhuǎn)入疲軟狀態(tài)。在這個過程中，cGMP能 夠被磷酸二酯酶(PDE-5)所滅活，從而使陰莖轉(zhuǎn)入疲軟狀態(tài)。某些種類的蜘蛛毒素對男性生殖系統(tǒng)的影響早已有報道，在拉 美地區(qū)，被塔蘭圖拉蜘蛛咬傷的男性患者常常會經(jīng)歷幾個小時的強 制性陰莖勃起。在巴西、阿才艮廷和以色列的多個醫(yī)院，醫(yī)生已經(jīng)展 開多年的臨床應用，用蜘蛛毒素治療男性勃起障礙。蜘蛛毒蛋白種 類非常多，研究業(yè)已證明，對此功能起主要作用的活性物質(zhì)是只是 漏斗網(wǎng)蛛毒素中的 一個組分。我們用動物實-驗已經(jīng)-i正明重組蛛毒蛋 白對于勃起障礙也具有活性。
在實現(xiàn)本發(fā)明過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)自然界中蜘蛛毒蛋白資源有 限，且分離困難，其活性和穩(wěn)定性都很難得到保證。這種動物來源 的蛋白在人體使用，會引起不同程度的免疫排斥反應和潛在的病源 傳播的危險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以
及用于治療ED的藥物，以解決自然界中蜘蛛毒蛋白的問題。
在本發(fā)明的實施例中，提供了一種重組蛛毒蛋白，其由多肽鏈 構(gòu)成，多肽鏈包含由以下48個氨基酸構(gòu)成的序列ATCAGQDQPC
發(fā)明中，命名為PnTx2-6-13 )。
在上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-(3中，多肽鏈可以由48個氨 基酸構(gòu)成的序列所構(gòu)成。
在上述的重組蟲朱毒蛋白中，多肽鏈可以進一步包含以下34個 氨基&復構(gòu)成的序列MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVE ELGR，該34個氨基酸構(gòu)成的序列和的48個氨基酸構(gòu)成的序列共 同構(gòu)成82個氨基酸構(gòu)成的序列MKVAILFLSI LVLAVASESIEESRDDFAVE ELGR ATCAGQDQPC KETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAW YKLANCKK (在本發(fā)明中，命名為 PnTx2-6- a )。
在上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-a中，多肽鏈可以由82個氨 基酸構(gòu)成的序列所構(gòu)成。
在本發(fā)明的實施例中，還提供了 一種重組蛛毒蛋白的制備方 法，使用大腸桿菌進行表達制備上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6- (3 , 其包4舌以下步驟
步驟i.人工合成以下DNA片段，
1gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga 61 ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg 121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga
步驟ii.以該DNA片^殳為才莫片反，擴增出包含
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga
的核香酸序列，回收核香酸序列，在多克隆位點將其插入原核 表達載體中得到重組表達載體；
步驟iii.用氯化鈣法制備DH5cc感受態(tài)細胞后，用前述重組表 達載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)過培 養(yǎng)后抽^提得到質(zhì)粒；
步驟iv.將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta2大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化后 含有正確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種于含葡萄糖和抗 生素的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的 轉(zhuǎn)速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4。C2000g離心10分鐘，收集 得到的菌體；
步驟v.將菌體與100mMNaCl， 50mMTris pH8.0混合，采用細 胞石皮碎^支術將細胞進行石皮碎，以12000rpm離心，收集上清，然后 經(jīng)親和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進行層析純化，并經(jīng)過 無菌過濾后，在-30。C至7。C凍干，得到上述的重組蛛毒蛋白 PnTx2-6- p 。
在本發(fā)明的實施例中，還才是供了 一種重組蛛毒蛋白的制備方 法，使用大腸桿菌進行表達制備上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-a， 其包纟舌以下步驟
步驟i.人工合成以下DNA片段，
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttge gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaagge tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aaaaaaaaaa
步驟ii.以該DNA片^:為才莫X反，擴增出包含
tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttge gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tegcatggta taascttget肌ctgtaa犯aatga
的核苷酸序列，回收核苷酸序列，在多克隆位點將其插入原核 表達載體中得到重組表達載體；
步驟iii.用氯化4丐法制備DH5a感受態(tài)細胞后，用該重組表達 載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細力包，在抗性平^反中4兆取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng) 后抽4是得到質(zhì)粒；步驟iv.將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta2大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化后含 有正確表達質(zhì)粒的抗性平玲反中44取單菌落，4矣種于含葡萄糖和抗生 素的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn) 速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4。C2000g離心10分鐘，收集 得到的菌體；
步驟v.將菌體與lOOmMNaCl, 50mMTris pH8.0混合，采用細 月包石皮石 汰術將細月包進4亍石皮石年，以12000rpm離心，收集上清，然后 經(jīng)親和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進行層析純化，并經(jīng)過 無菌過濾后，在-3CTC至7。C凍干，得到上述的重組蛛毒蛋白 PnTx2-6- a 。
在本發(fā)明的實施例中，還提供了 一種重組蛛毒蛋白的制備方
法，^吏用畢赤酵母進^f亍表達制備上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-P,
其包4舌以下步艱《
步驟i.人工合成以下DNA片段， 1 gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga 61 ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg 121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga
步驟ii.以該DNA片革殳為才莫片反，擴增出包含
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tac加gga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga
的核苷酸序列，回收核普酸序列，在多克隆位點將其插入表達 載體pPIC9K中；
步驟iii.用氯化鈣法制備DH5a感受態(tài)細胞后，用該表達載體 轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，在抗性平板中4兆取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽 提得到質(zhì)粒；步艱《iv.才姿照5jug/80juL ^1夸質(zhì)沖立加入感受態(tài)尸/c/ /a pastors SMD1168轉(zhuǎn)入電擊杯中，電擊參數(shù)為電壓1300V,電容25juF,電 阻為200Q，均勻涂布MD平板，在30。C培養(yǎng)3-4天，將MD平板 上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL 濃度梯度G418的YPD培養(yǎng)基中，逐步篩選G418抗性菌抹，接種 菌株于BMGY培養(yǎng)基中，30°C ， 250rpm培養(yǎng)24小時至OD,為4， 室溫1500g離心IO分鐘，收集得到的菌體；
步驟v.將菌體用BMMY培養(yǎng)基懸浮，29。C250rpm誘導表達， 每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入曱醇至終濃度5mL/L培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 小時，培養(yǎng)液4'C離心，收集上清液，經(jīng)親和層析柱、離子交換柱 和凝月交排阻色"i普進行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-3(TC至7。C 凍干，得到上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-|3 。
在本發(fā)明的實施例中，還才是供了 一種重組蛛毒蛋白的制備方 法，使用畢赤酵母進行表達制備上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-cc， 其具體包括以下步驟
步驟i.人工合成以下DNA片段，
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tac加gga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aaaaaaaaaa aaa;
步驟ii.以該DNA片段為模版，擴增出包含
tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga
的核苷酸序列，回收核苷酸序列，在多克隆位點將其插入表達 載體pPIC9K中；步驟iii.用氯化鈣法制備DH5a感受態(tài)細胞后，用該表達載體 轉(zhuǎn)化DH5oc感受態(tài)細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽 提得到質(zhì)粒；
步驟iv.按照5jug/80juL將質(zhì)粒加入感受態(tài)尸,'c/z/a SMD1168轉(zhuǎn)入電擊杯中，電擊參數(shù)為電壓1300V,電容25jaF，電 阻為200Q，均勻涂布MD平4反，在3(TC培養(yǎng)3-4天，將MD平才反 上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL 濃度梯度G418的YPD培養(yǎng)基中，逐步篩選G418抗性菌林，接種 菌株于BMGY培養(yǎng)基中，30°C , 250卬m培養(yǎng)24小時至OD,為4， 室溫1500g離心IO分鐘，收集得到的菌體；
步驟v.將菌體用BMMY培養(yǎng)基懸浮，29。C250rpm誘導表達， 每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入甲醇至終濃度5mL/L培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 小時，培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液，經(jīng)親和層析柱、離子交換柱 和凝膠排阻色譜進4于層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30。C至7。C 凍干，4尋到上述的重纟且蟲朱毒蛋白PnTx2-6-a。
在本發(fā)明的實施例中，還4是供了 一種重組蛛毒蛋白的制備方 法，使用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、草生歐文菌、 谷氨酸棒狀菌、酵母或昆蟲細胞進行表達制備上述的重組蛛毒蛋 白，或使用化學合成法制備上述的重組蛛毒蛋白。
在本發(fā)明的實施例中，還提供了 一種用于治療男性勃起功能障 礙的藥物，其有效成分包含上述的重組蛛毒蛋白。
本發(fā)明提供了一類新的具有藥用價值的重組蛛毒蛋白，提供來 一種生物發(fā)酵制備重組蟲朱毒蛋白的方法，制備的重組蟲朱毒蛋白能夠 用于治療男性勃起功能障礙。


此處所i兌明的附圖用來4是供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本申 請的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其i兌明用于解釋本發(fā)明，并
不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中
圖1示出了^4居本發(fā)明實施例的PnTx2-6-a在大腸桿菌中的融 合表達實例；
圖2示出了才艮據(jù)本發(fā)明實施例的PnTx2-6- P在大腸桿菌中的融 合表達實例；
圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實施例的PnTx2-6- a在大腸桿菌中的融 合表達實例；
圖4示出了 #4居本發(fā)明實施例的PnTx2-6- (3在大腸桿菌中的融 合表達實例；
具體實施例方式
下面將參考附圖并結(jié)合實施例，來詳細i兌明本發(fā)明。
本發(fā)明人經(jīng)過活性篩選，確定了蛛毒蛋白的結(jié)構(gòu)組成，并利用 基因工程或化學合成法生產(chǎn)重組的該蛛毒蛋白。該重組蛛毒蛋白由 多肽鏈構(gòu)成，多肽鏈包含由以下48個氨基酸構(gòu)成的序列 ATCAGQDQPC KETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAW YKLANCKK (在本發(fā)明中，命名為PnTx2-6- P )。
在上述的重組蛛毒蛋白中，多肽鏈可以Y又由48個氨基酸構(gòu)成 的序列所構(gòu)成。在上述的重組蟲朱毒蛋白中，多肽鏈可以進一步包含以下34個 氨基酸構(gòu)成的序列MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVE ELGR,該34個氨基酸構(gòu)成的序列和的48個氨基酸構(gòu)成的序列共 同構(gòu)成82個氨基酸構(gòu)成的序列MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVE ELGR ATCAGQDQPC KETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAW YKLANCKK (在本發(fā)明中，命名為 PnTx2-6- a )。
在上述的重組蛛毒蛋白中，多肽鏈可以^f義由82個氨基酸構(gòu)成 的序列所構(gòu)成。
在本發(fā)明的實施例中，上述結(jié)構(gòu)的重組蛛毒蛋白，可以用常類L 的化學合成方法制備。例如以各種氨基酸為原料采用Fmoc和tBoc 的方法進行。
優(yōu)選的，使用生物發(fā)酵法制備上述的重組蛛毒蛋白。
在本發(fā)明的實施例中，提供了 一種重組蛛毒蛋白的制備方法， 使用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、草生歐文菌、谷氨 酸棒狀菌、酵母或昆蟲細胞進行表達制備上述的重組蛛毒蛋白制備 上述的重組蛛毒蛋白。
優(yōu)選的，包4舌以下幾個步驟
步-驟i.人工合成以下DNA片^殳，
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aaaa肌a肌a肌ai
ii.以該DNA片段為模版，PCR分別擴增出包含tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtg犯tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtaga卿at tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta
ta犯cttgct肌ctgtaa犯aatga (序歹'J a ,用于制備PnTx2-6- a ) 或者包4、
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta
taaacttgct aactgtaaaa aatga (序歹'J (3 ，用于制備PnTx2-6- P ) 的核苷酸序列。
將PCR產(chǎn)物回收，利用分子生物學技術，在多克隆位點將序 列cc和序列(3分別插入表達載體PSUMO-M、 pPIC9K、 pPIC9中， 得到PnTx2-6的表達載體PSUMO-M- PnTx2畫6-a 、 PSUMO-M-PnTx2-6- P 、 pPIC9K- PnTx2-6- a ， pPIC9K畫PnTx2-6- P 、 pPIC9-PnTx2-6- a 、 pPIC9- PnTx2-6- P 。
iii. 用氯4匕鈣法制備DH5 ot感受態(tài)細月包后，用表達載體 PSUMO-M- PnTx2-6a進行轉(zhuǎn)化，在抗性平板中才兆取單菌落，經(jīng)過 培養(yǎng)后抽，提質(zhì)粒。同樣的步驟可以應用于PSUMO-M- PnTx2-6- P 、 pPIC9K- PnTx2-6- a , pPIC9K- PnTx2-6- P 、 pPIC9- PnTx2-6- a 、 pPIC9- PnTx2-6- P 。
甲.用大腸桿菌表達
iv. 將表達質(zhì)粒PSUMO-M- PnTx2-6- a轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta 2 大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化后含有正確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落， 接種于含葡萄糖和抗生素的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件 下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600-1.2,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4。C2000g離心10 分鐘，收集菌體。
v.將收集的菌體與lOOmMNaCl, 50mMTris pH8.0混合，采用 細月包石皮石卒才支術將細月包進4亍石皮石爭，在12000rpm離心，收集上清，然 后經(jīng)親和層析柱，離子交換柱和凝膠排阻色語等進行層析純化，并 經(jīng)過無菌過濾后，在-30。C至7。C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6 (cc型)。
iv. ^!奪表達質(zhì)并立PSUMO-M- PnTx2-6- (3專爭4匕入感受態(tài)Rosetta 2 大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化后含有正確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落， 接種于含葡萄糖和抗生素的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件 下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600-1.2，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4。C2000g離心10 分鐘，收集菌體。
v. 將收集的菌體與lOOmMNaCl, 50mMTris pH8.0混合，采用 細胞石皮石卒技術將細胞進行破碎，在12000rpm離心，收集上清，然 后經(jīng)親和層析柱，離子交換柱和凝膠排阻色語等進行層析純化，并 經(jīng)過無菌過濾后，在-3(TC至7。C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6
((3型)。
乙.用畢赤酵母表達
iv.取5jugpPIC9K- PnTx2-6-a力口入80 ju L感受態(tài)尸/c/z/a / a^on^ SMD1168轉(zhuǎn)入電擊杯中。電擊參數(shù)為電壓1300V，電容25 juF，電阻為200Q。均勻涂布MD(13.4g/L酵母氮源、0.4mg/L 生物素、10g/L葡萄糖)平^反，在30。C培養(yǎng)3-4天。v. 將MD平板上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含 1.0、 2.0、 3.0、 4.0mg/mL濃度梯度G418的YPD(IO g/L酵母提取 物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖)培養(yǎng)基中，逐步篩選G418抗性 菌林即得到目的基因高拷貝菌林。命名為SMD1168/ pPIC9K隱 PnTx2畫6。
vi. 接種SMD1168/pPIC9K-PnTx2-6于BMGY ( 10g/L酵母 提取物，20 g/ L蛋白胨，13. 4 g/ L酵母氮源，0. 4mg/ L生物 素，10 mL/ L甘油，100 mmo1/ L磷酸鉀緩沖液，pH 6. O)培養(yǎng)基 中，30°C, 250rpm培養(yǎng)24小時至OD600為4，室溫1500g離心10
分鐘收集菌體。
vii. 將收獲的細胞用BMMY(10g/L酵母提取物，20 g/L蛋白 胨，13. 4 g/ L酵母氮源，0. 4 mg/ L生物素，5 mL/ L甲醇，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6. O)培養(yǎng)基懸浮，29。C250rpm誘導表達， 每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入曱醇至終濃度5mL/L培養(yǎng)基。培養(yǎng)96 小時。
viii. 培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液，經(jīng)親和層析柱，離子交換 柱和凝膠排阻色譜等進行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30。C至 7'C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6 ( a型)。
iv. 取5 n gpPIC9K- PnTx2-6- P力口入80 ju L感受態(tài)尸,c&a pastoni SMD1168專爭入電擊杯中。電擊參凄史為電壓1300V,電容25
juF,電阻為200D。均勻涂布MD平才反，在30。C;告養(yǎng)3-4天。
v. 將MD平板上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含 1.0、 2.0、 3.0、 4.0mg/mL濃度梯度G418的YPD培養(yǎng)基中，逐步 篩選G418抗性菌林即得到目的基因高拷貝菌林。命名為SMD1168/ pPIC9K- PnTx2-6。vi. 接種SMD1168/pPIC9K畫PnTx2-6于BMGY培養(yǎng)基中，30 °C , 250rpm培養(yǎng)24小時至OD600為4，室溫1500g離心10分鐘
收集菌體。
vii. 將收獲的細胞用BMMY培養(yǎng)基懸浮，29。C250rpm誘導表 達，每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入曱醇至終濃度5mL/L培養(yǎng)基。培 養(yǎng)96小時。
viii. 培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液，經(jīng)親和層析柱，離子交換 柱和凝膠排阻色譜等進行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30。C至 7。C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6 ( P型)。
下面具體描述四個實施例的制備方法。
實施例1.使用大腸桿菌進行表達制備包含PnTx2-6-a的重組 蛛毒蛋白，其包括以下步艱《
人工合成DNA片段
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg eaggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aasaaaaaaa aaaj
以該DNA片段為才莫版，PCR分別擴增出包含
tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga
的核香酸序歹'J。將PCR產(chǎn)物回收，在多克隆位點將該序列插入表達載體 PSUMO-M,得到重組PnTx2-6的表達載體。用該表達載體轉(zhuǎn)化DH5 oc感受態(tài)細胞，在抗性平板中4兆耳又單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒。 將抽纟是到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta2大腸4干菌，從轉(zhuǎn)化后含有正 確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種于含葡萄糖和抗生素的 TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或 水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼 續(xù)培養(yǎng)4小時。4'C2000g離心10分鐘，收集菌體。將收集的菌體 與100mMNaCl， 50mMTrispH8.0混合，在4。C采用超聲細胞破碎技 術將細胞進行破碎，在12000rpm離心，收集上清，然后經(jīng)親和層 析柱，離子交換柱和凝膠排阻色譜等進行層析純化，并經(jīng)過無菌過 濾后，在-30°C至7°C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6- a 。
實施例2.使用大腸桿菌進行表達制備包含PnTx2-6- |3的重組 蟲朱毒蛋白，其包括以下步驟
人工合成DNA片段
1 gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga 61 ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg 121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga
以該DNA片^殳為才莫X反，PCR分別擴增出包含
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta teaacttgct aactgtaa肌肌tga
的核苷酸序列。
將PCR產(chǎn)物回收，在多克隆位點將該序列插入表達載體 PSUMO-M,得到重組PnTx2-6的表達載體。用該表達載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒。 將抽提到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta2大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化后含有正 確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種于含葡萄糖和抗生素的TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或 水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼 續(xù)培養(yǎng)4小時。4。C2000g離心IO分鐘，收集菌體。將收集的菌體 與100mMNaCl， 50mMTris pH8.0混合，在4°C采用超聲細月包石皮碎^支 術將細胞進行石皮石爭，在12000rpm離心，收集上清，然后經(jīng)親和層 析柱，離子交換柱和凝膠排阻色譜等進行層析純化，并經(jīng)過無菌過 濾后，在-30。C至7'C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6- (3 。
實施例3.使用酵母進行表達制備包含PnTx2-6-a的重組蛛毒 蛋白，其包4舌以下步驟
人工合成DNA片段
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttg3 aaaaa肌3aa aaa
以該DNA片,殳為才莫版，PCR分別擴增出包含
tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta ta肌cttgct肌ctgta犯a aatga
的核苷酸序列。
將PCR產(chǎn)物回收，在多克隆位點將該序列插入酵母表達載體 pPIC9K，得到重組PnTx2-6的表達載體。用該表達載體轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒。取 5 ju才由提到的質(zhì)粒加入80 ju L感受態(tài)尸,'c/^" SMD1168轉(zhuǎn)入
電擊杯、中。電擊參凄t為電壓1300V,電容25/uF，電阻為200Q。 均勻涂布MD(13. 4 g/L酵母氮源、0. 4mg/L生物素、10g/L葡 萄糖)平板，在30。C培養(yǎng)3-4天。將MD平板上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含1.0、 2.0、 3.0、 4.0mg/mL濃度梯度G418的 YPD(IO g/ L酵母提取物，20 g/ L蛋白胨，20 g/ L葡萄糖)培養(yǎng)基 中，逐步篩選G418抗性菌林即得到目的基因高拷貝菌株。接種該 菌林于BMGY (10g/L酵母沖是取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵 母氮源，0. 4mg/L生物素，10mL/L甘油，100 mmo1/L磷酸鐘緩 沖液，pH 6. O)培養(yǎng)基中，30°C ， 250rpm培養(yǎng)24小時至OD600為4, 室溫1500g離心IO分鐘收集菌體。將收獲的細胞用BMMY(10g/L 酵母提取物，20 g/ L蛋白胨，13. 4 g/ L酵母氮源，0. 4 mg/ L生物 素，5 mL/ L曱醇，100 mmo1/ L石粦酸鉀纟爰沖液，pH 6. O)i咅養(yǎng)基懸 浮，29。C250rpm誘導表達，每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入曱醇至終 濃度5mL/L培養(yǎng)基。培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液， 經(jīng)親和層析柱，離子交換柱和凝月交排阻色譜等進4亍層析純化，并經(jīng) 過無菌過濾后，在-30。C至7。C凍干，得到重組蟲朱毒蛋白PnTx2-6-a 。
實施例4.使用大腸桿菌進行表達制備包含PnTx2-6- (3的重組 蛛毒蛋白，其包才舌以下步驟
人工合成DNA片段
1 gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga 61 ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggeaag gctacttttg gatagcatgg 121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga
以該DNA片段為模版，PCR分別擴增出包含
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tac加gga tagcatggta taascttgct a3ctgtaa33 aatga
的沖亥普酸序列。
將PCR產(chǎn)物回收，在多克隆位點將該序列插入酵母表達載體 pPIC9K,得到重組PnTx2-6的表達載體。用該表達載體轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒。取5 ju才由才是到的質(zhì)泮立力口入80 ju L感受態(tài)戶/c/n'a po^on、 SMD1168轉(zhuǎn)入 電擊杯中。電擊參數(shù)為電壓1300V，電容25nF,電阻為200Q。 均勻涂布MD(13.4g/L酵母氮源、0. 4mg/L生物素、10g/L葡 萄糖)平板，在30。C培養(yǎng)3-4天。將MD平板上長出的His+轉(zhuǎn)化子 用影印法依次接種到含1.0、 2.0、 3.0、 4.0mg/mL濃度梯度G418的 YPD(10 g/ L酵母沖是取物，20 g/ L蛋白胨，20 g/ L葡萄糖)培養(yǎng)基 中，逐步篩選G418抗性菌林即得到目的基因高拷貝菌株。接種該 菌4朱于BMGY (10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵 母氮源，0. 4mg/L生物素，10mL/L甘油，100 mmol/L磷酸鐘緩 沖液，pH6. O)培養(yǎng)基中，30°C, 250rpm培養(yǎng)24小時至OD600為4, 室溫1500g離心IO分鐘收集菌體。將收獲的細胞用BMMY(10g/L 酵母提取物，20 g/ L蛋白胨，13. 4 g/ L酵母氮源，0. 4 mg/ L生物 素，5 mL/ L曱醇，100 mmo1/ L磷酸鉀緩沖液，pH 6. O)培養(yǎng)基懸 浮，29。C250rpm誘導表達，每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入甲醇至終 濃度5mL/L培養(yǎng)基。培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液， 經(jīng)親和層析柱，離子交換柱和凝月交排阻色i普等進行層析純化，并經(jīng) 過無菌過濾后，在-3(TC至7。C凍干，得到重組蛛毒蛋白PnTx2-6-P。
下面結(jié)合附圖進一步闡述本發(fā)明的實施例。
實例一 PnTx2-6- a在大腸桿菌中的融合表達實例
人工合成DNA片段
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tac加gga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga a肌3aaaaaa肌aj
以該DNA片段為才莫版，擴增出包含tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tga加gct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 加acttgct aactgtaaaa肌tga
的核苦S臾序列，在KpnI和Xhol位點將其插入原核表達載體
pET32a中并進行測序驗證，測序結(jié)果如下
1 GGTACCGACG ACGACGACAA GATGAAAGTG GCGATTCTGT
TTCTGAGCAT TCTGGTGCTG
61 GCGGTGGCGA GCGAAAGCAT TGAAGAAAGC CGCGATGATT
TTGCGGTGGA AGAACTGGGC
121 CGCGCGACCT GCGCGGGCCA GGATCAGCCG TGCAAAGAAA CCTGCGATTG CTGCGGCGAA
181 CGCGGCGAAT GCGTGTGCGG CGGCCCGTGC ATTTGCCGCC
AGGGCTATTT TTGGATTGCG
241 TGGTATAAAC TGGCGAATTG CAAAAAATAA CTCGAG
將5 ng重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞DE3，從轉(zhuǎn)化后含有 正確表達質(zhì)粒的抗性平并反中才兆取單菌落，*接種于含葡萄#唐和抗生素 的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速 在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2,加入IPTG至終濃度為1 mmol /L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4。C2000g離心10分鐘，收集得到 的菌體；菌體破碎后用15。/。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖l所示，其中，
歹'J 1:未i秀導菌體石皮碎液
歹ll M: Marker
歹'J 2: 37。C誘導后的菌體破碎液
列3-5: 25。C誘導后的菌體破碎液
實例二 PnTx2-6- (3在大腸桿菌中的融合表達實例
人工合成DNA片卓史 1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aaaaaaaaaa
以該DNA片#史為才莫片反，擴增出包含
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga
的核普S臾序列，在KpnI和Xhol位點將其插入原核表達載體
pET32a中并進行測序驗證，測序結(jié)果如下
1 GGTACCGACG ACGACGACAA GGCGACCTGC GCGGGCCAGG
ATCAGCCGTG CAAAGAAACC
61 TGCGATTGCT GCGGCGAACG CGGCGAATGC GTGTGCGGCG
GCCCGTGCAT TTGCCGCCAG
121 GGCTATTTTT GGATTGCGTG GTATAAACTG GCGAATTGCA
AAAAATAACT CGAG
將5 ng重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞DE3，從轉(zhuǎn)化后含有 正確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種于含葡萄糖和抗生素 的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速 在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2，加入IPTG至終濃度為1 mmol /L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4。C2000g離心10分鐘，收集得到 的菌體；菌體石皮碎后用15% SDS-PAGE分沖斤結(jié)果如圖2所示，其中，
歹'J 1:未誘導菌體破碎液
歹寸M: Marker
歹'J 2: 37。C誘導后的菌體破碎液
列3-5: 25"C誘導后的菌體破碎液
實例三PnTx2-6- a在大腸桿菌中的融合表達實例
26人工合成DNA片革史
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatate 301 ttgcatttga aaaaaaaaaa
以該DNA片^殳為才莫片反，擴增出包含
tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta ta肌cttgct aactgt犯aa aatga
的核苦酸序列，在Stu I和Xho I位點將其插入原核表達載體 pSUMO-M中并進行測序驗證，測序結(jié)果如下
1 TATGAAAGTG GCGATTCTGT TTCTGAGCAT TCTGGTGCTG
GCGGTGGCGA GCGAAAGCAT
61 TGAAGAAAGC CGCGATGATT TTGCGGTGGA AGAACTGGGC
CGCGCGACCT GCGCGGGCCA
121 GGATCAGCCG TGCAAAGAAA CCTGCGATTG CTGCGGCGAA CGCGGCGAAT GCGTGTGCGG
181 CGGCCCGTGC ATTTGCCGCC AGGGCTATTT TTGGATTGCG
TGGTATAAAC TGGCGAATTG
241 CAAAAAATAA CTCGAG
將5 ng重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞DE3，從轉(zhuǎn)化后含有 正確表達質(zhì)粒的抗性平板中4兆取單菌落，接種于含葡萄糖和抗生素 的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速 在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2,加入IPTG至終濃度為1 mmol /L,繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4。C2000g離心10分鐘，收集得到 的菌體；菌體石皮石爭后用15% SDS-PAGE分神斤結(jié)果如圖3所示，其中，
歹'J 1:未i秀導菌體石皮碎液
歹寸M: Marker
歹'J 2: 37。C誘導后的菌體破碎液列3-5: 25。C誘導后的菌體破碎液
實例四PnTx2-6- P在大腸桿菌中的融合表達實例
人工合成DNA片段
1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg eaggca鄉(xiāng)c tac加gga tagcatggte 241 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aa犯a33肌3肌3;
以該DNA片段為模版，擴增出包含
gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga
的核苷酸序列，在Stu I和Xho I位點將其插入原核表達載體 pSUMO-M中并進行測序驗證，測序結(jié)果如下
1 TGCGACCTGC GCGGGCCAGG ATCAGCCGTG CAAAGAAACC
TGCGATTGCT GCGGCGAACG
61 CGGCGAATGC GTGTGCGGCG GCCCGTGCAT TTGCCGCCAG
GGCTATTTTT GGATTGCGTG
121 GTATAAACTG GCGAATTGCA AAAAATAACT CGAG
將5 ng重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞DE3， 乂人轉(zhuǎn)化后含有 正確表達質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種于含葡萄糖和抗生素 的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條件下以100-300ipm的轉(zhuǎn)速 在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600=1.2,加入IPTG至終濃度為1 mmol /L,繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4。C2000g離心10分鐘，收集得到 的菌體；菌體石皮石卒后用15% SDS-PAGE分析結(jié)果如圖4所示，其中，
歹'J 1:未i秀導菌體石皮碎液
歹ll M: Marker歹'J 2: 37。C誘導后的菌體破碎液 列3-5: 25。C誘導后的菌體破碎液
在本發(fā)明的實施例中，還提供了 一種用于治療男性勃起功能障 礙的藥物，其有效成分包含上述的重組蟲朱毒蛋白。
在本發(fā)明的實施例中，使用上述的重組蛛毒蛋白治療男性勃起 功能障礙。
上述實施例經(jīng)過活性篩選，確定了蛛毒蛋白的結(jié)構(gòu)組成，并利 用基因工程或化學合成法生產(chǎn)重組蛛毒蛋白，不^f又產(chǎn)量大，還可避 免排斥反應，是極具發(fā)展前景和吸引力的方法。
另夕卜，上述實施例利用該重組蛛毒蛋白治療男性勃起功能障礙 以及制造治療男性勃起功能障礙的藥物。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā) 明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進 等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種重組蛛毒蛋白，其特征在于，其由多肽鏈構(gòu)成，所述多肽鏈包含由以下48個氨基酸構(gòu)成的序列ATCAGQDQPCKETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAWYKLANCKK。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽 《連由所述48個氨基酸構(gòu)成的序列所構(gòu)成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽 鏈進一步包含以下34個氨基酸構(gòu)成的序列MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVE ELGR,該34個氨基酸構(gòu)成的序 列和所述的48個氨基酸構(gòu)成的序列共同構(gòu)成82個氨基酸構(gòu)成 的序列MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVE ELGR ATCAGQDQPC KETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAW YKLANCKK 。
4. 才艮據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽 鏈由所述82個氨基酸構(gòu)成的序列所構(gòu)成。
5. —種重組蛛毒蛋白的制備方法，其特征在于，使用大腸桿菌進 行表達制備權(quán)利要求1或2所述的重組蛛毒蛋白，其包括以下 步驟步驟i.人工合成以下DNA片^殳，1gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga 61 ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg 121 tataaacttg cteactgtaa aaaatga步驟ii.以該DNA片,殳為才莫片反，擴增出包含 gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagaggagaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga的核苷酸序列，回收所述核苷酸序列，在多克隆位點將其插入原核表達載體中；步驟iii.用氯化鈣法制備DH5 a感受態(tài)細胞后，用所述構(gòu) 建好的表達載體轉(zhuǎn)化所述DH5a感受態(tài)細胞，在抗性平板中 4兆取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提得到的質(zhì)粒；步驟iv.將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta 2大腸桿菌，從 轉(zhuǎn)化后含有正確表達所述質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種 于含葡萄并唐和抗生素的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37。C的條 件下以 100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至 OD600=1.2，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時，然后以4。C2000g離心IO分鐘，收集得到的菌體；步驟v.將所述菌體與lOOmMNaCl, 50mMTris pH8.0混 合，采用細月包石皮碎4支術將細月包進4亍石皮石卒，以12000rpm離心， 收集上清，然后經(jīng)親和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進 行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30。C至7。C凍干，得到 外又利要求1或2所述的重組蛛毒蛋白。
6. —種重組蛛毒蛋白的制備方法，其特;f正在于，4吏用大腸桿菌進 行表達制備權(quán)利要求3或4所述的重組蛛毒蛋白，其包括以下 步驟步驟i.人工合成以下DNA片段，1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tga加gct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 teaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 301 ttgcatttga aa肌3a肌3a a叫步驟ii.以該DNA片^殳為才莫版，擴增出包含 tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgttgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tga加gct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta taaacttgct aactgtaaaa aatga的核苷酸序列，回收所述核苦酸序列，在多克隆〗立點將其插入原核表達載體中；步驟iii.用氯化釣法制備DH5a感受態(tài)細胞后，用所述構(gòu) 建好的表達載體轉(zhuǎn)化所述DH5oc感受態(tài)細胞，在抗性平板中 挑取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提得到質(zhì)粒；步驟iv.將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta 2大腸桿菌，從 轉(zhuǎn)化后含有正確表達所述質(zhì)粒的抗性平板中4兆取單菌落，4妄種 于含葡萄津唐和抗生素的LB或TB i咅養(yǎng)基中，在20-37。C的條 件下以 100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至 OD600=1.2,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時，然后以4。C2000g離心IO分鐘，收集得到的菌體；步-驟v.將所述菌體與100mMNaCl， 50mMTris pH8.0混 合，采用細胞破石卒技術將細胞進行破碎，以12000rpm離心， 收集上清，然后經(jīng)親和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進 行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-3(TC至7"C凍干，得到 權(quán)利要求3或4所述的重組蛛毒蛋白。
7. —種重組蛛毒蛋白的制備方法，其特征在于，使用畢赤酵母進 行表達制備權(quán)利要求1或2所述的重組蛛毒蛋白，其包括以下 步驟步驟i.人工合成以下DNA片段，1 gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga 61 ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg 121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga步驟ii.以該DNA片,殳為才莫片反，擴增出包含gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggtat犯3cttgct a3ctgte333 aatga的核苦酸序列，回收所述核苦酸序列，在多克隆位點將 其插入表達載體pPIC9K中；步驟iii.用氯化鈣法制備DH5a感受態(tài)細胞后，用所述表 達載體轉(zhuǎn)化所述DH5a感受態(tài)細月包，在抗性平^反中^兆取單菌 落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提得到質(zhì)粒；步驟iv.按照5jJg/80juL將所述質(zhì)粒加入感受態(tài)P/c&a pa^oWsSMD1168轉(zhuǎn)入電擊杯中，電擊參凄t為電壓1300V,電 容25juF，電阻為200Q，均勻涂布MD平板，在30。C培養(yǎng) 3-4天，將所述MD平板上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次 接種到含l.O、 2.0、 3.0、 4.0mg/mL濃度梯度G418的YPD培 養(yǎng)基中，逐步篩選G418抗性菌林，接種所述菌株于BMGY 培養(yǎng)基中，30°C ， 250rpm培養(yǎng)24小時至OD600為4，室溫1500g 離心10分鐘，收集得到的菌體；步驟v.將所述菌體用BMMY培養(yǎng)基懸浮，29。C250rpm 誘導表達，每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入曱醇至終濃度5mL/L 培養(yǎng)基，培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液，經(jīng)親 和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進行層析純化，并經(jīng)過 無菌過濾后，在-3(TC至7。C凍干，得到權(quán)利要求1或2所述 的重組蛛毒蛋白。
8. —種重組蛛毒蛋白的制備方法，其特征在于， -使用畢赤酵母進 行表達制備權(quán)利要求3或4所述的重組蛛毒蛋白，其具體包括 以下步驟步艱《i.人工合成以下DNA片^殳，1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttectc tctattttgg tgcttgctgt 61 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tga加gct gtagaagaat tggggagagc 121 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 181 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 241 taaacttgct asctgtaaaa Mtgatetgg atttatgtat accacgatat aataaatata(301 ttgcatttga aaaaaaa犯a aaa;步驟ii.以該DNA片段為模版，擴增出包含tga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta ta肌cttgct犯ctgtaa肌犯tga的核普酸序列，回收所述核苦酸序列，在多克隆位點將其插入表達載體pPIC9K中；步驟iii.用氯化釣法制備DH5a感受態(tài)細胞后，用所述表 達載體轉(zhuǎn)化所述DH5a感受態(tài)細胞，在抗性平板中^兆耳又單菌 落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提得到質(zhì)粒；步驟iv.按照5jug/80juL將所述質(zhì)粒加入感受態(tài)尸/c/n'a pastoWs SMD1168 4爭入電擊杯中，電擊參凄史為電壓1300V，電 容25juF,電阻為200n，均勻涂布MD平4反，在30。C培養(yǎng) 3-4天，將所述MD平板上長出的His+轉(zhuǎn)化子用影印法依次 接種到含1.0、 2.0、 3.0、 4.0mg/mL濃度梯度G418的YPD培 養(yǎng)基中，逐步篩選G418抗性菌林，接種所述菌林于BMGY 培養(yǎng)基中，30。C，250rpm培養(yǎng)24小時至OD細為4,室溫1500g 離心10分鐘，收集得到的菌體；步驟v.將所述菌體用BMMY培養(yǎng)基懸浮，29。C250rpm 誘導表達，每隔24小時向培養(yǎng)基內(nèi)加入曱醇至終濃度5mL/L 培養(yǎng)基，培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)液4。C離心，收集上清液，經(jīng)親 和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進行層析純化，并經(jīng)過 無菌過濾后，在-30。C至7。C凍干，得到片又利要求3或4所述 的重組蛛毒蛋白。
9. 一種重組蛛毒蛋白的制備方法，其特征在于，使用大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、草生歐文菌、谷氨酸棒狀菌、 酵母或昆蟲細胞進行表達制備權(quán)利要求1-4任一項所述的重 組蛛毒蛋白，或使用化學合成法制備權(quán)利要求l-4任一項所述 的重組蛛毒蛋白。
10. —種用于治療男性勃起功能障礙的藥物，其特征在于，其有效 成分包含權(quán)利要求l-4任一項所述的重組蛛毒蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以及用于治療ED的藥物，以解決自然界中蜘蛛毒蛋白的問題。重組蛛毒蛋白，其由多肽鏈構(gòu)成，多肽鏈包含由以下48個氨基酸構(gòu)成的序列ATCAGQDQPC KETCDCCGER GECVCGGPCICRQGYFWIAW YKLANCKK。本發(fā)明制備的重組蛛毒蛋白能夠用于治療男性勃起功能障礙。
文檔編號C07K1/00GK101585872SQ20081009740
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者浩 胡, 紅 高 申請人:成都蓉藥集團四川長威制藥有限公司