專利名稱：拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合、其表達(dá)載體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合及其表達(dá)載體，以及通過該拆分
熒光蛋白的融合蛋白的組合篩選病毒包膜蛋白的受體的方法，和篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
膜融合是生物系統(tǒng)中非常普遍的現(xiàn)象。肌肉發(fā)生，受精作用，以及囊泡的運(yùn)輸過程中都涉及到膜融合。具有包膜的病毒侵染宿主細(xì)胞，同樣依賴于膜融合。膜融合是由2個(gè)膜所分開的2個(gè)獨(dú)立區(qū)室發(fā)生合并形成一個(gè)區(qū)室的過程。人們可以使用多種不同的技術(shù)監(jiān)測這個(gè)過程。 一種方法是使用一對拆分蛋白，當(dāng)它們相互重新結(jié)合的時(shí)候，將會(huì)重新獲得其整體蛋白的活性。 在這類方法中已經(jīng)建立了很多種報(bào)告蛋白系統(tǒng)。像天然就具有的自我組裝能力的拆分P-半乳糖苷酶(P-gal)，以及拆分GFP蛋白(spGFP)都已應(yīng)用于膜融合的分析中。拆分的酶可以實(shí)現(xiàn)定量的監(jiān)測，但是如果使用的底物不具有膜通透性則需要破壞細(xì)胞膜才能實(shí)現(xiàn)。spGFP可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)地觀察活體細(xì)胞中發(fā)生的情況，但是其定量效果不如酶。
所以在現(xiàn)有技術(shù)里就不存在一種技術(shù)，即可以實(shí)現(xiàn)定量地監(jiān)測體細(xì)胞融合又可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)地觀察活體細(xì)胞融合的蛋白或其組合以及方法。同時(shí)也缺乏一種簡便地篩選病毒包膜蛋白的受體的方法，和一種簡便地篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
( — )發(fā)明的摘要[oooe](發(fā)明所要解決的問題) 本發(fā)明經(jīng)過對大量拆分蛋白的研究和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在融合二種不同種類的拆分熒光蛋白的情況下，特別是這二種不同種類的拆分熒光蛋白中的至少一種為拆分熒光酶的情況下，就可以提供即可以實(shí)現(xiàn)定量地監(jiān)測體細(xì)胞融合又可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)地觀察活體細(xì)胞融合的蛋白或其組合以及方法的技術(shù)。 本發(fā)明同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)有的熒光蛋白的新的拆分點(diǎn)。如果使用這個(gè)新的拆分點(diǎn)拆
分的熒光蛋白作為拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合的一部分，可以解決現(xiàn)有的問題。 (二)發(fā)明的詳細(xì)說明 本發(fā)明的目的是提供一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，包括第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分熒光蛋白的融合蛋白，為可自我重新結(jié)合的已被拆分的第一熒光蛋白的一部分和可自我重新結(jié)合的已被拆分的第二
熒光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，為前述第一熒光蛋白的剩
余部分和前述第二熒光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白與前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白結(jié)合后，前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)，可以自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。
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本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，該方法包括以下步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，c)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，d)檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，c)加入促進(jìn)或抑制病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的促進(jìn)劑或抑制劑，d)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，e).檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式而融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。
(具體實(shí)施形態(tài)) 以下通過提供本發(fā)明的具體實(shí)施形態(tài)來說明本發(fā)明，但是這里說明的具體實(shí)施形態(tài)只是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例而已，不是用來限定本發(fā)明的范圍以及其等同范圍的。屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)者可以容易地理解本說明書所記述的發(fā)明范圍以及本發(fā)明的等同范圍。
(第一實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第一實(shí)施形態(tài)為提供一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，包括第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分熒光蛋白的融合蛋白，為可自我重新結(jié)合的已被拆分的第一熒光蛋白的一部分和可自我重新結(jié)合的已被拆分的第二熒光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，為前述第一熒光蛋白的剩余部分和前述第二熒光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白與前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白結(jié)合后，前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)，可以自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。 本發(fā)明不局限特定的蛋白，可以使用的拆分熒光蛋白可以是現(xiàn)有的技術(shù)中存在的所有的可拆分的熒光蛋白(fluorescent)或是可拆分的冷光(luminescent)蛋白。本發(fā)明所采用的拆分熒光蛋白優(yōu)選拆分熒光酶。因?yàn)橥ㄟ^加入酶的對應(yīng)底物(substrate)就可以定量地測量拆分熒光酶的活性(activity)。 另外本發(fā)明中的所謂的「拆分」是指，在蛋白的氨基酸序列的一個(gè)點(diǎn)上將蛋白拆分為兩部分，而這被拆分的兩部分可能自我重新結(jié)合后恢復(fù)其原來的功能。這里所謂的「自我重新結(jié)合」包括自我重聚(self-reassociate)或是自我再組(self reassemble)等形式。
在本發(fā)明中優(yōu)先采用的兩種拆分熒光蛋白分別為，海腎熒光素酶(renillaluciferase， RU禾口綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)。本發(fā)明采用的海腎熒光素酶(renilla luciferase， RL)是可以通過使用具有膜通透性的底物endurene，在活體細(xì)胞中連續(xù)地監(jiān)測膜融合的過程，從而定量地檢測膜融合。RL是一種應(yīng)用廣泛的酶，已經(jīng)建立了完善的檢測系統(tǒng)。但是它的缺點(diǎn)在于拆分RL(spRL)具有眾所周知較低的自我結(jié)合能力。因此為了增強(qiáng)spRL的自我結(jié)合能力，本發(fā)明采用了接合另外一個(gè)拆分熒光蛋白(spGFP)的方式。 本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)等在大量的可拆分的熒光蛋白中選定另外一個(gè)拆分熒 光蛋白，其為綠色熒光蛋白(GFP)。綠色熒光蛋白的拆分點(diǎn)有多種，本發(fā)明優(yōu)選在拆分點(diǎn)位 于氨基酸序列的第157和第158之間的，這樣就把綠色熒光蛋白拆分為GFP卜7和GFP8—1Q兩 部分。這兩部分自我結(jié)合后可以恢復(fù)原來的GFP的螢光功能是本發(fā)明人通過多種試驗(yàn)結(jié)果 首次發(fā)現(xiàn)的，是一種新穎的可拆分的綠色熒光蛋白的形態(tài)。 可以拆分為GFPh7和GFP8—1Q兩部分的GFP不盡是一種新穎的可拆分的綠色熒光蛋 白而且是協(xié)助和增大被拆分的RL的恢復(fù)能力。所以，本發(fā)明的特征在于，第一拆分熒光蛋 白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白里的spGFP各部分自我結(jié)合后可以恢復(fù)原 來的GFP的蛋白功能，同時(shí)，在spGFP的促進(jìn)下spRL各部分自我結(jié)合后也可以恢復(fù)原來的 海腎熒光素酶(Renila luciferase， RL)的蛋白功能。 本發(fā)明采用的海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)的拆分點(diǎn)位于氨基酸序列 的第229和第230之間，把海腎熒光素酶拆分為nRL和cRL兩部分。本發(fā)明采用的綠色熒 光蛋白的拆分點(diǎn)位于氨基酸序列的第157和第158之間。拆分點(diǎn)位于氨基酸序列的第157 和第158之間的綠色熒光蛋白是和最適合于被拆分海腎熒光素酶組成拆分熒光蛋白的融 合蛋白。 本發(fā)明的一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合中的第一拆分熒光蛋白的融合蛋 白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白分別為，nRL和GFPp7的融合蛋白以及cRL和GFP8—1Q的 融合蛋白，或是nRL和GFP8—1Q的融合蛋白以及和cRL和GFP^7的融合蛋白。本發(fā)明優(yōu)選由 nRL和GFPh7的融合蛋白以及cRL和GFP8—1Q的融合蛋白的組合。優(yōu)選nRL和GFP^7的融合 蛋白以及cRL和GFP8—1Q的融合蛋白的組合。
其融合蛋白的序列如下； nRL禾卩GFP丄—7的融合蛋白(Dual!—7) (SEQ ID No :1)
(nRL :1—229， linker :230—233， splitGFP卜7 :234—390)
NFNSHNVYITADK
cRL和GFP:
(splitGFP:
的融合蛋白(Dual8—n) (SEQ ID No :2) :2-75， linker :76-77， cRL :78-159)
KYIKSFVERVLKNEQ 另外，本實(shí)施形態(tài)的優(yōu)選融合蛋白通過2至4個(gè)氨基酸來連接。這種融合蛋白的
連接方式對本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說不需要付出創(chuàng)造行的勞力就可以容易地想到。
從圖la顯示了 nRL和GFP^7的融合蛋白以及cRL和GFP8—1Q的融合蛋白的組合的 立體圖，以及，在GFP的其自我重新結(jié)合的影響下cRL和nRL也自我重組的過程。圖中的數(shù)字表示引入拆分點(diǎn)的氨基酸殘基位置。該圖是根據(jù)RL(PDBid:2pse)和GFP超級折疊體
(PDBid :2b3p)的晶體結(jié)構(gòu)猜測的示意圖，相應(yīng)的使用黃色和綠色表示。 本發(fā)明人根據(jù)最近解出的RL三維結(jié)構(gòu)(PDB id :2pse)，分析了拆分RL的連接點(diǎn)
的構(gòu)造，和GFP超級折疊體(PDBid :2b3p)中發(fā)現(xiàn)的反向平行的13折疊連接的構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)了
以反向的方式融合兩個(gè)被拆分的熒光蛋白可以達(dá)到本發(fā)明的效果。 因此本實(shí)施形態(tài)中的nRL和GFPh7的融合蛋白通過GFP卜7的第157位氨基酸和nRL 的第229位氨基酸的結(jié)合而構(gòu)成。cRL和GFP8—1Q的融合蛋白通過GFP8—1Q的第232位氨基酸 和nRL的第229位氨基酸的結(jié)合而構(gòu)成。在通過GFP卜7和GFP8—1Q的自我重新結(jié)合的影響下 帶動(dòng)了 RL的重組，使得這二種熒光蛋白恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。 [OO35](第二實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第二實(shí)施形態(tài)為一種表達(dá)載體的組合，包括第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載 體，其特征在于，第一表達(dá)載體包括表達(dá)前述第一拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因，第二表 達(dá)載體包括表達(dá)前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因。 本實(shí)施形態(tài)中的表達(dá)載體組合中的第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體的具體例為， nRL和GFP卜7的融合蛋白基因的表達(dá)載體，nRL和GFP8—1Q的融合蛋白基因的表達(dá)載體，cRL 和GFP卜7的融合蛋白基因的表達(dá)載體，以及，cRL和GFP8—1Q的融合蛋白基因的表達(dá)載體。
本實(shí)施形態(tài)中的表達(dá)載體可以使用質(zhì)粒載體等本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的 表達(dá)載體。 本發(fā)明的第二實(shí)施形態(tài)為一種表達(dá)載體的組合，其中，前述第一表達(dá)載體和前述
第二表達(dá)載體中的任一個(gè)為包膜蛋白表達(dá)載體，再包括了表達(dá)病毒包膜蛋白的基因，該包
膜蛋白表達(dá)載體可以同時(shí)表達(dá)包膜蛋白以及第一拆分熒光蛋白的融合蛋白或第二拆分熒
光蛋白的融合蛋白。由此，本實(shí)施形態(tài)中的表達(dá)載體組合優(yōu)選以下四組 A.包括HIV-1的包膜蛋白的基因，nRL和GFP卜7的融合蛋白的基因的表達(dá)載體，以
及，包括cRL和GFP8—1Q的融合蛋白的基因的表達(dá)載體的組合； B.包括HIV-1的包膜蛋白的基因，nRL和GFP8—1Q的融合蛋白的基因的表達(dá)載體， 以及，包括cRL和GFP卜7的融合蛋白的基因的表達(dá)載體的組合； C.包括HIV-1的包膜蛋白的基因，cRL和GFP卜7的融合蛋白的基因的表達(dá)載體，以 及，包括nRL和GFP8—1Q的融合蛋白的基因的表達(dá)載體的組合； D.包括HIV-1的包膜蛋白的基因，cRL和GFP8—1Q的融合蛋白的基因的表達(dá)載體， 以及，包括nRL和GFP卜7的融合蛋白的基因的表達(dá)載體的組合。 [OO44](第三實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第三實(shí)施形態(tài)為一種病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，該方法包括以下 步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將本發(fā) 明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)， 該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，c)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，d)檢驗(yàn)第一 細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式融合后的熒光，該螢光為前述第一熒 光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。
本實(shí)施形態(tài)是一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合的使用，它用于病毒包膜蛋白 的受體的篩選方法的形態(tài)。因?yàn)楸景l(fā)明的拆分熒光蛋白在自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光，所以，轉(zhuǎn)染在不同的細(xì)胞里第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分
熒光蛋白的融合蛋白只有在其細(xì)胞融合之際才能自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從
而發(fā)出熒光。通過檢驗(yàn)螢光(GFP的信號)就可以檢驗(yàn)出細(xì)胞是否融合。同時(shí)通過RL的活
性以及GFP的信號，能夠在活體細(xì)胞中既定量又可視地監(jiān)測膜融合過程。 本實(shí)施形態(tài)優(yōu)選通過病毒包膜蛋白和其對應(yīng)的受體的結(jié)合而發(fā)生的細(xì)胞融合。比
如HIV-1的包膜蛋白和受體CD4與其輔助受體CCR5或受體CD4與其輔助受體CXCR4的結(jié)
合會(huì)導(dǎo)致含有HIV-1的包膜蛋白的細(xì)胞和含有受體CD4與其輔助受體CCR5或受體CD4與
其輔助受體CXCR4的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合。本實(shí)施形態(tài)可以篩選HIV-1的包膜蛋白的受體是
CD4與其輔助受體CCR5還是受體CD4與其輔助受體CXCR4，或是其兩者。 本實(shí)施形態(tài)的第一步驟為本發(fā)明所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，
這樣就產(chǎn)生了包括包膜蛋白以及第一拆分熒光蛋白的融合蛋白或第二拆分熒光蛋白的融
合蛋白的第一細(xì)胞。本實(shí)施形態(tài)的第二步驟為本發(fā)明所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基
因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，這樣
就產(chǎn)生了只含有第一細(xì)胞內(nèi)的包膜蛋白所對應(yīng)的受體和另外一個(gè)拆分熒光蛋白的融合蛋
白的第二細(xì)胞。 在混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞后(本實(shí)施形態(tài)的第三步驟)，只有在包膜蛋白和其 對應(yīng)的受體存在下才可能發(fā)生第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的融合以及檢測到，cRL和nRL重組后 的，以及GFP卜7和GFP8—1Q重組后的螢光。所以本實(shí)施形態(tài)可以通過螢光的測試來篩選包膜 蛋白所對應(yīng)的受體。 另外本發(fā)明的熒光蛋白為RL，其有一種膜通透性的底物endurene。可以通過投入 底物endurene來測試RL的反應(yīng)而定量地算出細(xì)胞融合。 另外，為了提高篩選包膜蛋白所對應(yīng)的受體的效率，本實(shí)施形態(tài)里還可以增加一
個(gè)篩選第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的步驟。(第四實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第四實(shí)施形態(tài)為一種膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，該方法包括 以下步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將 本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中 表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，c)加入促進(jìn)或抑制病毒包膜蛋白與 受體結(jié)合的促進(jìn)劑或抑制劑，d)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，e)檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通 過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式而融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前述第 二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。 從前述的第三實(shí)施形態(tài)可以知道，如果采用和HIV-1的包膜蛋白對應(yīng)的受體，第 一細(xì)胞和第二細(xì)胞一般會(huì)融合。在此前提下，在細(xì)胞融合時(shí)再添加抑制劑的話，就可以用 這個(gè)系統(tǒng)來篩選抑制細(xì)胞融合，也就是抑制HIV-1的包膜蛋白和其對應(yīng)的受體結(jié)合的抑制 劑。同樣也可以用這個(gè)系統(tǒng)來篩選促進(jìn)細(xì)胞融合，也就是促進(jìn)HIV-1的包膜蛋白和其對應(yīng) 的受體結(jié)合的促進(jìn)劑。 和前述的第三實(shí)施形態(tài)一樣，如果再添加RL的膜通透性的底物endurene，就可以
定量地測試抑制劑或促進(jìn)劑的反應(yīng)程度，算出抑制劑或促進(jìn)劑的效果。 另外，為了提高篩選包膜蛋白所對應(yīng)的受體的效率，本實(shí)施形態(tài)里還可以增加一個(gè)篩選第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的步驟。 [OO57](三)發(fā)明的效果 本發(fā)明通過提供一種新穎的拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，并且使用此融合蛋 白的組合可以來監(jiān)測膜融合，由于拆分熒光蛋白的融合蛋白的雙重功能，膜融合可以在相 同的活體細(xì)胞中使用下述的2個(gè)參數(shù)來定量的評估。 一個(gè)是平衡的膜融合步驟是如何傾向 于融合孔洞形成的，這個(gè)可以通過定量的RL活性的絕對數(shù)值或者GFP信號陽性細(xì)胞的數(shù)目 來估計(jì)。另一個(gè)是根據(jù)RL活性的時(shí)間進(jìn)程來評估膜融合發(fā)生有多快。使用本發(fā)明的方法 獲得的信息對于闡明膜融合的機(jī)制將會(huì)很有幫助。進(jìn)一步的定量膜融合檢測將會(huì)對于新藥 開發(fā)很有幫助。


圖1為拆分蛋白或拆分蛋白的融合蛋白的構(gòu)建以及互補(bǔ)效率的檢測結(jié)果。 圖2為在非細(xì)胞體系中分析RL活性恢復(fù)的酶動(dòng)力學(xué)以及使用拆分蛋白的融合蛋
白組合系統(tǒng)監(jiān)測膜融合在非細(xì)胞體系中互補(bǔ)反應(yīng)酶動(dòng)力學(xué)的測量結(jié)果。 具體的實(shí)施方式(實(shí)施例一 ) 拆分點(diǎn)位于氨基酸序列的第157和第158之間的綠色熒光蛋白的活性
本發(fā)明人對圖1 (b)所示的不同拆分點(diǎn)的綠色熒光蛋白進(jìn)行了測試，包括GFPh10和 GFPU以及GFP卜7和GFP8—n。所用到的縮略詞如下nRL :RL的N末端片斷，cRL :RL的C末端 片斷，BaseVel :來源于具有異源二聚亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的多肽(Velcro多肽)的基因工程多 肽衍生物，其含有Velcro多肽堿性的氨基酸殘基，AcidVel :亮氨酸拉鏈多肽的另一部分， 其含有一些酸性的氨基酸殘基，PH domain :pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域，Dual :GFP片斷和RL 片斷相互融合形成的融合蛋白(下標(biāo)的數(shù)字表示引入拆分點(diǎn)的GFP蛋白折疊的位置)。
拆分熒光蛋白的融合蛋白在293FT細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在圖l(c)。 RL或者GFP 的活性在轉(zhuǎn)染36小時(shí)后檢測。圖中上部分是根據(jù)材料和方法部分的方法測量出的RL活性。 R.L.U.表示相對發(fā)光值。下部分是使用IN CellAnalyzer檢測的GFP信號。圖中給出了 GFP信號的圖片以及明場(BF)的圖片。所有僅轉(zhuǎn)染了單個(gè)DNA的細(xì)胞都沒有表現(xiàn)出RL活 性以及GFP信號。pEGFP表示使用了表達(dá)增強(qiáng)型GFP表達(dá)質(zhì)粒，天然的RL表示使用了含有 RL全長的質(zhì)粒。 本發(fā)明人檢測了利用這個(gè)具有較強(qiáng)自我結(jié)和能力的蛋白對GFP卜7/GFP8—n構(gòu)建 的spRL的互補(bǔ)效率?；贕FPp7/GFP8—u的拆分熒光蛋白的融合蛋白(DualSplit fusion Protein (DSP) :DSP卜7/DSP8—n)中的spRL(圖lc， DSP卜7/DSP8—u)互補(bǔ)效率比使用GFP卜10/ GFPU(圖lc， DSP卜1Q/DSPn)或者比命名為"Velcro"的異源二聚巻曲螺旋要高2個(gè)數(shù)量級 (圖lc， nRL-baVel/acVel-cRL)。事實(shí)上，在所有測試的DSPs中，DSP卜7/DSP8—n恢復(fù)的GFP 信號是最強(qiáng)的(圖lc，DSPl-7/DSP8-ll)。本發(fā)明人也嘗試了在DSPs上融合pleckstrin同 源結(jié)構(gòu)域(PH domain)(圖lb)，因?yàn)樵诖饲暗难芯恐?，它有助于GFP片斷的表達(dá)。但在本實(shí)
驗(yàn)中附加上的ra結(jié)構(gòu)域卻降低了活性2個(gè)數(shù)量級，因此ra結(jié)構(gòu)域使用在DSP上起到的是
一個(gè)減弱活性的效果(圖lc， PH-GFP卜W/PH-GFPn和ra-GFP!—7/PH_GFP8—u)。與預(yù)期一致， 單個(gè)DSP片斷并不產(chǎn)生GFP信號，或者具有RL活性。這兩種拆分熒光蛋白的融合蛋白在表達(dá)細(xì)胞中都是均勻分布的，沒有觀察到特異的定位模式。本發(fā)明人接下來在非細(xì)胞體系中 研究了 DSP^7/DSP8—u互補(bǔ)反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)。通過將含有單個(gè)拆分熒光蛋白的融合蛋白的細(xì) 胞抽提物相互混合，然后測定選定時(shí)間點(diǎn)的RL活性。DSP卜7和DSPs—u的互補(bǔ)反應(yīng)起始非常 迅速，并在8分鐘內(nèi)完成了反應(yīng)(圖2a);表明拆分熒光蛋白的融合蛋白可以用于研究膜融 合的早期步驟。
(實(shí)施例二 ) (1)拆分蛋白和融合蛋白的組合質(zhì)粒的構(gòu)建 本發(fā)明人使用了phRL-CMV質(zhì)粒(Promega)的骨架序列來表達(dá)融合蛋白。RL拆分 點(diǎn)的選擇是基于此前的遺傳學(xué)研究(Paulmurugan，2003) 。 spRL的N末端或者C末端片斷相 應(yīng)地命名為nRL或者cRL。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中將一些結(jié)合蛋白融合到了 spRL上。這包括使 用了一個(gè)稱作Velcro多肽的亮氨酸拉鏈片斷，其含有形成平行巻曲螺旋(parallel coiled coil)的酸性或者堿性殘基(0'Shea，1993)。 Velcro含有酸性殘基的片段(AcidVel)被克 隆到了 nRL的C末端。Velcro含有堿性殘基的片段(BaseVel)被克隆到了 cRL的N末端。
為了將spGFP與spRL相互融合，通過使用OPT GFP!— (Cabantous， 2006)為模板 使用K0D(+)聚合酶(Toyobo)或者Pfu turbo (Stratagene)PCR擴(kuò)增得到兩端含有Nhel 和Sbfl酶切位點(diǎn)的spGFPs的片段(GFPp1Q， GFPp7和GFP8—n)。該擴(kuò)增片段隨后被克隆到 PCR-4T0P0blunt中，并測序。然后GFP&1Q和GFP卜7片段被克隆到nRL或者phRL上游的Nhel 和Sbfl酶切位點(diǎn)之間。GFP8-11片段被克隆到spRL/phRL-CMV載體的Sail和Xbal酶切位 點(diǎn)之間。 在5'末端和3'末端含有Nhel和Sbfl酶切位點(diǎn)GFP11片段是通過退火一對合成 的寡居核苷酸片段獲得，并克隆得到。這些構(gòu)建的spRL基因融合到GFP卜w，GFPh7，GFP8—n和 GFPn上后，相應(yīng)的命名為dual卜1Q， dual卜7， dual8—u，和dualu。為了將ra結(jié)構(gòu)域附著到雙 重拆分蛋白的基因序列上，所有的雙重拆分蛋白的基因序列都通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增，在5'和 3'末端相應(yīng)地添加上了 EcoRI和Kpnl酶切位點(diǎn)，并克隆到了前述的含有ffl結(jié)構(gòu)域序列的 spGFP/pdDEGFP載體中(WJQ等)。 (2)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共轉(zhuǎn)拆分蛋白和雙重拆分蛋白的互補(bǔ)分析
所有的細(xì)胞培養(yǎng)都是在371:，5% 0)2濃度的條件下培養(yǎng)的。2乂105細(xì)胞密度的 293FT細(xì)胞使用Fugene HD轉(zhuǎn)染了 100ngDNA(Fugene HD/20ng/ii 1DNA所用試劑比例是 1/17;本實(shí)驗(yàn)中所有的轉(zhuǎn)染都是使用這個(gè)比例完成的)。轉(zhuǎn)染完成后2天，使用IN Cell Analyzer 1000 (GE healthcare)對293FT細(xì)胞拍照(使用10X物鏡，每孔選擇5個(gè)不同 的區(qū)域取樣拍照)。在此分析之后，同樣的培養(yǎng)物使用Renilla Luciferase Assay試劑盒 (Promega)跟據(jù)產(chǎn)品說明書測量RL活性。 (3)非細(xì)胞體系中拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合的互補(bǔ)分析
在6cm的培養(yǎng)皿(BD falcon)上鋪種每毫升密度為4 X 104的293FT細(xì)胞和293CD4 細(xì)胞。在鋪種2天之后，使用DSP1-7和DSP8-11基因相應(yīng)的轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞和293CD4細(xì) 胞。在使用PBS洗滌細(xì)胞2次以后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞使用細(xì)胞刮刀(BD falcon)移除細(xì)胞，并 使用離心機(jī)(20，000g，4。C，10分鐘)收集，然后按照說明書(Renilla Luciferase Assay Kit, Promega)使用500 的樣品裂解緩沖液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞裂解液。每份裂解液取 20iU混合，在室溫使用Glomax儀器(Promega)根據(jù)選定時(shí)間進(jìn)程測量活性值。每個(gè)獨(dú)立
10的實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)3次。 (4)使用拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合基因以及enduren底物監(jiān)測活體細(xì)胞的 膜融合 當(dāng)細(xì)胞大約50%鋪滿的時(shí)候，向293FT細(xì)胞中轉(zhuǎn)入DSPl-7以及表達(dá)HIV-1包膜蛋 白Env或其突變型的表達(dá)載體pNHcRedEluc[WJQ等]，以在96孔板中產(chǎn)生HIV-lEnv表達(dá) 細(xì)胞。另一方面，將轉(zhuǎn)入DSP8-11的293CD4細(xì)胞培養(yǎng)在溫度依賴型的6cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)溫 度從37t:降到25t:的時(shí)候，細(xì)胞可以很容易的從這種培養(yǎng)皿壁上脫離下來。轉(zhuǎn)染36到48 小時(shí)后，293CD4細(xì)胞的培養(yǎng)基使用含有60 ii M RL膜通透底物enduren (Promega)的50 yl 培養(yǎng)基替換，然后在37t:培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。與此同時(shí)，293FT細(xì)胞的培養(yǎng)基使用不含enduren 的培養(yǎng)基替換。在培養(yǎng)2小時(shí)結(jié)束后，將培養(yǎng)于溫度依賴的培養(yǎng)皿中的293CD4細(xì)胞置于 室溫溫育5分鐘，然后使用吸移管輕輕的搖動(dòng)使得293CD4細(xì)胞的濃度均一。這些懸浮起的 293CD4細(xì)胞隨后與每孔中的293FT細(xì)胞共同鋪種。在共培養(yǎng)這些細(xì)胞的期間，按照時(shí)間順 序使用Glomax(Promega)的enduren分析程序測量每個(gè)孔的RL活性。也按照時(shí)間順序使 用In Cell analyzer IOOO(GE healthcare)檢測GFP的綠色熒光信號。
使用可溶性的CD4和T-20(NIH AIDS研究和參考試劑計(jì)劃)檢測了抑制劑的效果。 除了抑制劑的添加，共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)都使用上述方法進(jìn)行。每種抑制劑在共培 養(yǎng)之后的0， 20， 40， 60， 100， 150分鐘時(shí)添加。RL的活性在共培養(yǎng)后200分鐘測量。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表示在圖2。在非細(xì)胞體系中分析RL活性恢復(fù)的酶動(dòng)力學(xué)以及使用 雙重拆分蛋白系統(tǒng)監(jiān)測膜融合(圖2a)在非細(xì)胞體系中互補(bǔ)反應(yīng)酶動(dòng)力學(xué)的測量。將轉(zhuǎn)染 了 DSP1-7和DSP8-11基因的293FT細(xì)胞和293CD4細(xì)胞的細(xì)胞裂解液混合后，監(jiān)測恢復(fù)的 RL活性。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了 3次以上，具有代表性的數(shù)據(jù)呈列在此。(圖2b)實(shí)時(shí)檢測HIV-1 包膜蛋白介導(dǎo)的膜融合，(圖2b)使用RL的膜通透底物enduren的RL活性。
通過共培養(yǎng)表達(dá)HIV-1包膜蛋白或其受體以及相應(yīng)的雙重互補(bǔ)蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 并在選定的時(shí)間點(diǎn)做出測量。所使用的Env基因是來自于HXB2(空心方塊)的野生型Env， 其突變體的跨膜區(qū)被血型糖蛋白A(GpA，空心菱形)以及水泡性口炎病毒(VSV-G，空心三 角)的跨膜區(qū)所替代。使用相同的骨架序列但是不含erw基因的質(zhì)粒(no Env，空心圓)作 為負(fù)對照。(d)在膜融合過程中抑制劑的效果?？扇苄訡D4是Env及其受體結(jié)合的抑制劑。 T-20是膜融合過程中g(shù)p41形成中間產(chǎn)物的抑制劑。 從通過以上的恢復(fù)的GFP信號，就能夠很容易的掌握膜融合的分布范圍。融合的 數(shù)目隨著時(shí)間的增加而增加，這與此前的結(jié)果一致(圖2)。同時(shí)也使用膜通透底物enduren 測量了 RL的活性，與此前得到使用的定量T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。即使是在共 培養(yǎng)8小時(shí)之后，也能夠檢測到突變體較低的RL活性。野生型的Env表現(xiàn)出與此前報(bào)道相 似的S-型酶動(dòng)力學(xué)曲線(圖2b)，共培養(yǎng)之后完成50%最多融合的時(shí)間t1/2，為100分鐘 (圖2b)。 而在突變體中，GpA突變體表現(xiàn)出了較慢的酶動(dòng)力學(xué)，其t1/2 = 165分鐘，而 VSV-G突變體表現(xiàn)出了更慢的酶動(dòng)力學(xué)，t1/2 = 264分鐘。即使是GpA和VSV-G突變體自 身的酶動(dòng)力學(xué)也存在差異。這個(gè)差異在本發(fā)明人以前使用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)移分析法或者染 料轉(zhuǎn)移分析法的時(shí)候都沒有檢測到。連續(xù)地實(shí)時(shí)監(jiān)測同一個(gè)培養(yǎng)物是拆分熒光蛋白的融合 蛋白的組合系統(tǒng)的一個(gè)很大的優(yōu)勢。本發(fā)明人注意到本實(shí)驗(yàn)的檢測和以前的檢測中得到的
11tl/2的不同是由于染料的轉(zhuǎn)移原因，本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果表現(xiàn)出更長的tl/2。 這種使用拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合和染料轉(zhuǎn)移的方法間產(chǎn)生的差異可能
是由于在使用拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合的實(shí)驗(yàn)中需要兩個(gè)成分間形成足夠大的孔
洞使拆分熒光蛋白的融合蛋白能夠通過，而對于小分子的染料來說，可以轉(zhuǎn)移得比蛋白要
快得多?；蛘咭灿锌赡苁遣鸱譄晒獾鞍椎娜诤系鞍椎幕謴?fù)活性所需要的延遲時(shí)間導(dǎo)致了這
個(gè)差異。本發(fā)明人也利用這個(gè)系統(tǒng)檢測了融合抑制劑的效果。在加入可溶性CD4之后t1/2
大約為51分鐘；在加入六螺旋管束形成抑制劑之后tl/2大約為78分鐘(圖2c)。這些值
都與所預(yù)測的這些抑制劑在膜融合過程中的作用點(diǎn)順序相一致。 在本發(fā)明中，本發(fā)明人應(yīng)用了拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合來監(jiān)測膜融合。由 于拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合的雙重功能，膜融合可以在相同的活體細(xì)胞中使用下述 的2個(gè)參數(shù)來定量的評估。 一個(gè)是平衡的膜融合步驟是如何傾向于融合孔洞形成的，這個(gè) 可以通過定量的RL活性的絕對數(shù)值或者GFP信號陽性細(xì)胞的數(shù)目來估計(jì)。另一個(gè)是根據(jù) RL活性的時(shí)間進(jìn)程來評估膜融合發(fā)生有多快。使用本方法獲得的信息對于闡明膜融合的機(jī) 制將會(huì)很有幫助。進(jìn)一步的定量膜融合檢測將會(huì)對于新藥開發(fā)很有幫助。另外，拆分熒光 蛋白的融合蛋白的組合也可以用于測試細(xì)胞中的兩個(gè)區(qū)室間的相互作用，例如囊泡運(yùn)輸。序列表(SEQUENCE LISTING)〈110〉國立大學(xué)法人東京大學(xué)(The Universii:y of Tokyo)中國科學(xué)院生物物理研究所〈120〉拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合、其表達(dá)載體及用途〈130>JSP080384〈160>2〈170>PatentIn version 3.1〈210>1〈211>390〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工融合蛋白(An artificial fusionprotein)〈400>1Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu GinArg Lys ArgMetlieThr1 5 1015Gly Pro Gin Trp Trp Ala Arg Cys Lys GinMet Asn ValLeuAspSer20 2530Phe lie Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys HisAla Glu AsnAlaVallie35 4045Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser TyrLeu Trp ArgHisValVal50 5560Pro His lie Glu Pro Val Ala Arg Cys lielie Pro AspLeulieGly65 7075800109]MetGlyLysSerGlyLysSerGlyAsnGlySerTyrArgLeuLeuAsp
0110]859095
0111 ]HisTyrLysTyrLeuThrAlaTrpPheGluLeuLeuAsnLeuProLys
0112]100105110
0113]LyslieliePheValGlyHisAspTrpGlyAlaCysLeuAlaPheHis
0114]115120125
0115]TyrSerTyrGluHisGinAspLyslieLysAlalieValHisAlaGlu
0116]130135140
0117]SerValValAspVallieGluSerTrpAspGluTrpProAsplieGlu
0118]145150155160
0119]GluAsplieAlaLeulieLysSerGluGluGlyGluLysMetValLeu
0120]165170175
0121]GluAsnAsnPhePheValGluThrMetLeuProSerLyslieMetArg
0122]180185190
0123]LysLeuGluProGluGluPheAlaAlaTyrLeuGluProPheLysGlu
0124]195200205
0125]LysGlyGluValArgArgProThrLeuSerTrpProArgGluliePro
0126]210215220
0127]LeuValLysGlyGlyGlyLeuGinGlyMetValSerLysGlyGluGlu
0128]225230235240
0129]LeuPheThrGlyValValProlieLeuValGluLeuAspGlyAspVal
0130]245250255
0131]AsnGlyHisLysPheSerValArgGlyGluGlyGluGlyAspAlaThr
0132]260265270
0133]lieGlyLysLeuThrLeuLysPhelieCysThrThrGlyLysLeuPro
0134]275280285
0135]ValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGinCys
0136]290295300
0137]PheSerArgTyrAspProHisMetLysGinHisAspPhePheLysSer
0138]305310315320
0139]AlaMetProGluGlyTyrValGinGluArgThrlieSerPheLysAsp
0140]325330335
0141]AspGlyLysTyrLysThrArgAlaValValLysPheGluGlyAspThr
0142]340345350
0143]LeuValAsnArglieGluLeuLysGlyThrAspPheLysGluAspGly
0144]355360365
0145]AsnlieLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnPheAsnSerHisAsnVal
0146]370375380
0147]TyrlieThrAlaAspLys0148]385390
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0152]〈213〉人工序列
0153]〈220〉
0154]〈223〉人工融合蛋白(An artificial fusionprotein)
0155]〈400>2
0156]Met GinLysAsnGlylieLysAlaAsnPheThrValArgHisAsnVal
0157]151015
0158]Glu AspGlySerValGinLeuAlaAspHisTyrGinGinAsnThrPro
0159]202530
0160]lie GlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThr
0161]354045
0162]Gin ThrValLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisMetVal
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0164]Leu HisGluTyrValAsnAlaAlaGlylieThrValAspLysProAsp
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0172]Val LysGlyLeuHisPheSerGinGluAspAlaProAspGluMetGly
0173]130135140
0174]Lys TyrlieLysSerPheValGluArgValLeuLysAsnGluGin
0175]14515015權(quán)利要求
一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，包括第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分熒光蛋白的融合蛋白，為可自我重新結(jié)合的已被拆分的第一熒光蛋白的一部分和可自我重新結(jié)合的已被拆分的第二熒光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，為前述第一熒光蛋白的剩余部分和前述第二熒光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白與前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白結(jié)合后，前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)，可以自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，其中，前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)，是海腎熒光素酶(Renilla luciferase，RL)，其拆分點(diǎn)在氨基酸序列的第229和第230之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，其中，前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)，是綠色熒光蛋白，其拆分點(diǎn)在氨基酸序列的第157和第158之間。
4. 一種表達(dá)載體的組合，包括第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體，其特征在于，第一表達(dá)載體包括表達(dá)前述第一拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因，第二表達(dá)載體包括表達(dá)前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種表達(dá)載體的組合，其中，前述第一表達(dá)載體和前述第二表達(dá)載體中的任一個(gè)為包膜蛋白表達(dá)載體，再包括了表達(dá)病毒包膜蛋白的基因，該包膜蛋白表達(dá)載體可以同時(shí)表達(dá)包膜蛋白以及第一拆分熒光蛋白的融合蛋白或第二拆分熒光蛋白的融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的包膜蛋白表達(dá)載體，其中，病毒包膜蛋白為HIV-1包膜蛋白。
7. —種病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，該方法包括以下步驟a) 將權(quán)利要求5所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b) 將權(quán)利要求5所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，c) 混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，d) 檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。
8. —種膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟a) 將權(quán)利要求5所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b) 將權(quán)利要求5所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞含有該包膜蛋白所對應(yīng)的受體，c) 加入促進(jìn)或抑制病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的促進(jìn)劑或抑制劑，d) 混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，e) 檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式而融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，病毒包膜蛋白為HIV-1，受體為CD4與其輔助受體CCR5的組合體或是CD4與其輔助受體CXCR4的組合體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，病毒包膜蛋白為HIV-1，受體為CD4與其輔助受體CCR5的組合體或是CD4和其輔助受體CXCR4的組合體。
全文摘要
一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合和其表達(dá)載體，以及在細(xì)胞融合時(shí)通過檢測該拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合中自我重新結(jié)合后的熒光蛋白的螢光來篩選病毒包膜蛋白的受體的方法，和篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。
文檔編號C12Q1/02GK101747439SQ20081018603
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者巖本愛吉, 松田善衛(wèi), 近藤直幸 申請人:國立大學(xué)法人東京大學(xué);中國科學(xué)院生物物理研究所