專利名稱：融合表達(dá)載體pGEM－LTB及其構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地說是一個(gè)表達(dá)載體pGEM-LTB及其構(gòu)建方法和用途。
在免疫測定試劑抗原研究中，大分子重組蛋白有時(shí)會(huì)有非特異反應(yīng)，使用小分子肽可以減小非特異反應(yīng)，如Ortho公司第三代的HCV免疫印跡試劑RIBA3.0是把原來120個(gè)氨基酸殘基的重組蛋白c22-3r改為只有44個(gè)氨基酸(aa)的合成肽c22p，把c100-3r(362aa)改為只有16aa的c100p，從而減小了非特異反應(yīng)[Pawlotsky JM，Roudot-Thoraval F，Pellet C，Aumont P，Darthuy F，Remire J，Duval J and Dhumeaux D.，Influence of hepatitis C virus(HCV)Genotypes on HCV recombinant immunoblot assay patterns，J.ClinMicrob，1995；35(5)1357-1359]。然而，為了增加抗原的覆蓋面，如ELISA試劑，有時(shí)又需要具有多個(gè)抗原表位的融合抗原，以提高檢測的靈敏度[Chien DY，Arcangel P，Medina-Selby A，Coit D，Baumeister M，Nguyen S，George-Nascimento C，Gyenes A，Kuo G，Valenzuela P.Use of a novel hepatitis C virus(HCV)major-epitope chimeric polypeptide for diagnosis of HCVinfection.J Clin Microbiol 1999 May；37(5)1393-7]。若分別用化學(xué)合成法合成小肽，不但成本高，合成量有限，而且小肽不利于包被，影響試劑的靈敏度。理想的方法是小肽抗原表位既可單獨(dú)表達(dá)，又可根據(jù)需要，把多個(gè)抗原表位連接起來融合表達(dá)。
人源大腸桿菌不耐熱腸毒素由A、B兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中B亞基具有很強(qiáng)的免疫原性，因此在LTB基因中選擇合適部位插入目的基因，在并不改變讀碼框架的前提下，融合表達(dá)的蛋白可以產(chǎn)生抗大腸桿菌不耐熱腸毒素的抗體。而且，由于LTB片段具有很強(qiáng)的免疫佐劑作用，(1.Adjuvant activity of Escherichia coli Heat-labile Enterotoxinand effect on the unrelated protein antigens.Vaccine，1988；6269-277.2.G Douce，C Turcotte，I Cropley.Mutants of Escherichiacoli Heat-labiletoxin lacking ADP-ribosyltransferase activity act as nontoxic，mucosaladjuvants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995；921644 1648)，當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物用于疫苗免疫原研究時(shí)，分子中融合的人LTB片段又能起到免疫增強(qiáng)劑的作用。基于這一構(gòu)思，我們?cè)趐GEM表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)融合表達(dá)載體pGEM-LTB，使小分子肽能在原核細(xì)胞中高效穩(wěn)定地表達(dá)。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)在原核細(xì)胞表達(dá)的高效融合表達(dá)載體pGEM-LTB。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供表達(dá)載體pGEM-LTB的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供表達(dá)載體pGEM-LTB在基因克隆、抗原表達(dá)、藥物組合物及疫苗制備中的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明公開了pGEM-LTB載體。pGEM-LTB是一個(gè)閉環(huán)質(zhì)粒。它是在表達(dá)載體pGEM的多克隆位點(diǎn)EcoRI和BamHI之間插入人源大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(以下簡稱LTB)的核酸序列構(gòu)建成的。本發(fā)明的pGEM-LTB載體同樣帶有質(zhì)粒pGEM的啟動(dòng)子、終止子及其它構(gòu)件，因而仍然具有融合表達(dá)的特性，即插入pGEM-LTB的外源片斷與LTB基因一起融合表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，pGEM-LTB的構(gòu)建過程如下1.合成引物本發(fā)明合成的上、下游引物分別為P15’CGG TCT AGA GGC CTCGAG GGG ATC TAC 3’，P25’GCG ACT TTG GAA AAG CGA TTT GTC3’。在引物P1引入了Xho I和Xba I酶切點(diǎn)。引物P2引入了Xba I位點(diǎn)。
2.將LTB基因克隆入pGEM載體LTB基因購自上海市衛(wèi)生防疫站。將LTB基因改造后(參見實(shí)施例二)，用EcoR I和BamH I酶切，插入用同樣酶切的pGEM載體，即可獲得含有所需克隆酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體pGEM-LTB。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，pGEM-LTB可以方便地用于基因克隆、抗原表達(dá)及制備抗原組合物中的有用成分。
pGEM-LTB可用于單個(gè)目的基因的插入及表達(dá)。只要目的基因含有與載體相同的酶切位點(diǎn)，就可按基因工程的常規(guī)方法，將目的基因雙酶切后插入同樣處理過的pGEM-LTB載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，可以得到目的基因和LTB的融合表達(dá)。目的基因可以是化學(xué)合成的小基因片段，也可以是PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。pGEM-LTB還可以用于不同目的基因的共同插入及表達(dá)。通過設(shè)計(jì)特殊的通用連接引物L(fēng)1、L2(圖3b)，可以實(shí)現(xiàn)插入多個(gè)基因的目的。待插入基因可以是質(zhì)粒DNA，也可以是基因片段。
本發(fā)明的特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)如下首先，人LTB是很強(qiáng)的免疫原，通過pGEM-LTB載體獲得的小分子肽和LTB融合表達(dá)產(chǎn)物可以刺激產(chǎn)生抗人源大腸桿菌不耐熱腸毒素的抗體。其次，LTB是很好的免疫激活因子，在融合蛋白中可以作為免疫佐劑提高疫苗的免疫活性。第三，pGEM-LTB載體的克隆位點(diǎn)具有互補(bǔ)內(nèi)切酶，可方便地進(jìn)行基因間的相互連接，因此是抗原表達(dá)的理想載體。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。


圖1為載體pGEM-LTB的酶切鑒定及改構(gòu)后表達(dá)的鑒定；a/酶切鑒定(EcoR I，BamH I雙切)(1)分子量標(biāo)準(zhǔn)，(2)PGEM對(duì)照，(3)、(4)PGEM-LTB質(zhì)粒b/載體的誘導(dǎo)表達(dá)全菌的SDS-PAGE鑒定(1)分子量標(biāo)準(zhǔn)，(2)載體中LTB表達(dá)帶圖2a為外源基因插入pGEM-LTB的PCR鑒定(1)pGEM-LTB/NS4，(2)pGEM-LTB/C，(3)pGEM-LTB/NS3，(4)pGEM-LTB/NS5a，(5)pGEM-LTB/NS5b，(6)pGEM-LTB/NS5a-NS5b，(7)pGEM-LTB/NS4-C，(8)pGEM-LTB/NS4-C-NS5a，(9)pGEM-LTB-NS4-C-NS5a-NS5b，(10)分子量標(biāo)準(zhǔn)圖2b為外源基因插入后誘導(dǎo)表達(dá)全菌體的SDS-PAGE鑒定(1)pGEM-LTB載體，(2)pGEM-LTB/NS4，(3)pGEM-LTB/C，
實(shí)施例為進(jìn)一步說明pGEM-LTB表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用，參照下列實(shí)施例進(jìn)行說明，這些實(shí)施例是為了解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。
一、插入部位的確定及內(nèi)切酶的選擇通過英特網(wǎng)下載人LTB分子晶體X光衍射構(gòu)象分析資料(網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/3d)，并用RasMol動(dòng)態(tài)觀察人LTB的分子結(jié)構(gòu)，可以看到LTB分子主要為多個(gè)反向平行的β片層形成的β桶狀結(jié)構(gòu)，在分子第86-100處為無定形圈曲區(qū)(G環(huán))位于分子的表面，可用于片段插入和減小LTB的毒性。
人LTB中引入的酶切位點(diǎn)需要滿足以下要求在人LTB內(nèi)部及pGEM載體上不存在；酶切后的粘末端與其它的內(nèi)切酶有互補(bǔ)性，以便酶切后的基因與用互補(bǔ)酶切的基因連接后不再被切，由此實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同基因片段的連接。通過酶切位點(diǎn)分析，選擇了Xba I和Xho I作為插入LTB的克隆酶切位點(diǎn)，它們分別與Spe I和Sal I互補(bǔ)。
二、pGEM-LTB的構(gòu)建1.引物設(shè)計(jì)根據(jù)擴(kuò)增需要以及要引入的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成引物如下上游引物P15’ CGG TCT AGA GGC CTC GAG GGG ATC TAC 3’下游引物P25’ GCG ACT TTG GAA AAG CGA TTT GTC 3’2.在人LTB基因中引入Xho I和Xba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)以質(zhì)粒pGEM/LTB為模板，分別用F1、R1和F2、R2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為含鎂離子的10×擴(kuò)增緩沖液10μl，4×dNTPs(10 mmol)1μl，上下游引物(F1，R1或F2，R2)各1μl，上述pGEM/LTB1μ1，Taq DNA聚合酶(3單位/μ1)1μl，加滅菌水至100μl。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃ 3分鐘變性后，以94℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃ 1分，共30循環(huán)。用小量PCR產(chǎn)物純化試劑盒(華舜生物工程公司產(chǎn)品)按說明書方法純化。
兩種純化產(chǎn)物均用Xba I酶切。酶切體系為10μl 10×酶切緩沖液(H)，水21μl，純化產(chǎn)物30μl，酶XbaI 3μl(10單位/μl)，加水至60μl，37℃水浴8小時(shí)。酶切后產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳分離，用離心式小量膠回收試劑盒(華美生物工程公司產(chǎn)品)按說明書方法回收。
兩個(gè)片段連接連接體系為純化回收產(chǎn)物各2μl，10×T4 DNA連接緩沖液1μl，12u/μl的T4 DNA連接酶1μl，水6μl，16℃水浴過夜。以連接產(chǎn)物插入了酶切位點(diǎn)的變構(gòu)LTB(LTB)為模板，用引物F1和R2進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的純化同前。
3.LTB插入pGEM質(zhì)粒pGEM購自Promega公司，按照《分子克隆》的操作，將LTB基因克隆入pGEM載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM/LTB。
雙酶切上述純化的LTB和用堿變性法提取的質(zhì)粒pGEM，分別用EcoR I和BamH I雙酶切。對(duì)30μl純化的PCR產(chǎn)物及10μl質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，酶切體系還有10×緩沖液(H)4μl，10u/μl的EcoR I2μl，10u/μl的BamH I 2μl加水至總體積40μl，37℃水浴8小時(shí)。酶切后分別按上述方法純化。
插入連接連接體系為雙酶切后質(zhì)粒pGEM和LTB，各1μl，10×T4 DNA連接緩沖液1μl，T4 DNA連接酶(12u/μl)1μl，加水至總體積10μl，16℃水浴過夜。
4.轉(zhuǎn)化和表達(dá)大腸桿菌JM109為本室保存，復(fù)蘇活化冷凍的菌株后，按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的CaCl2方法制備感受態(tài)細(xì)胞；取感受態(tài)細(xì)胞100μl，加入連接產(chǎn)物5μl，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰浴中放置30分鐘，立即轉(zhuǎn)移到42℃水浴中放置2分鐘，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃水浴15分鐘后，37℃搖床輕搖45分鐘；取100μl轉(zhuǎn)化菌體，均勻涂布于含有100mg/ml氨芐的瓊脂平板培養(yǎng)基上，室溫晾干后，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
5.載體的鑒定從平皿上選取生長的集落，提取質(zhì)粒酶切鑒定，用EcoR I和BamHI酶切，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定的結(jié)果可見，除40kb的載體外，還可看到約460bp的LTB條帶，證明LTB已插入了pGEM，即pGEM-LTB構(gòu)建成功。圖5b為轉(zhuǎn)化有pGEM-LTB載體的細(xì)菌，在32℃培養(yǎng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)入42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2.5小時(shí)，取全菌體作聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠濃度為15％，操作過程見《分子克隆》，結(jié)果如圖所示，在17kd處有一深染帶，表明插入LTB得到了高效的表達(dá)。
三、目的基因和LTB融合表達(dá)1.插入以HCV/NS4基因的插入為例，由于引物NS4-P1和NS4-P2的3’端具有互補(bǔ)序列，在合適的條件下互補(bǔ)序列雜交后，在PCR反應(yīng)中，二者可以互為模板進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增體系及PCR反應(yīng)設(shè)置同實(shí)施例二所述，循環(huán)數(shù)為5個(gè)。取1μl擴(kuò)增產(chǎn)物作為再次PCR的模板，加入引物NS4-F2和NS4-R2，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化，用Xho I和Xba I雙酶切，對(duì)質(zhì)粒pGEM-LTB也用相同的酶雙酶切，然后使酶切后的基因和質(zhì)粒連接即為pGEM-LTB/NS4表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化、表達(dá)等操作均同實(shí)施例二所述。
表1. 用pGEM-LTB表達(dá)的不同基因來源和大小多肽名稱基因模板來源片段大小HCV/NS4 化學(xué)合成32 aaHCV/C 質(zhì)粒pBRTM/HCV49 aaHCV/NS3 質(zhì)粒pEX/NS3 266 aaHCV/NS5a質(zhì)粒pBRTM/HCV49 aaHCV/NS5b質(zhì)粒pBRTM/HCV78 aa按照上述步驟，用不同的引物擴(kuò)增的基因片斷見表1，插入pGEM-LTB載體中構(gòu)建成不同的表達(dá)質(zhì)粒分別為pGEM-LTB/NS4，pGEM-LTB/C，pGEM-LTB/NS3，pGEM-LTB/NS5a，pGEM-LTB/NS5b。
2.表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定以HCV/NS4基因?yàn)槔约兓筚|(zhì)粒pGEM-LTB/NS4為模板，以引物F1為正向引物，NS4-R2為負(fù)向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件實(shí)施例二，擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，可擴(kuò)增出約370bp的特異帶，證明NS4基因已插入。其它各插入基因質(zhì)粒的鑒定方法相同，電泳鑒定見圖3帶2-5，擴(kuò)增出相應(yīng)的片段依次為420bp，1000bp，420bp和510bp。
3.基因表達(dá)的SDS-PAGE鑒定以HCV/NS4基因?yàn)槔虮磉_(dá)的鑒定過程如下取插入HCV/NS4基因的表達(dá)質(zhì)粒pGEM-LTB/NS4，按實(shí)施例二方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和熱誘導(dǎo)培養(yǎng)，取全菌體進(jìn)行SDS-PAGE(膠濃度15％)鑒定結(jié)果如圖4，區(qū)帶2約在22kd處有一深染帶，和NS4和LTB的融合后的理論分子量一致。其它各基因HCV/C，NS3，NS5a，NS5b表達(dá)的鑒定方法相同，圖3b中區(qū)帶3-6為各質(zhì)粒表達(dá)菌，表達(dá)帶的分子量分別為25kd，50kd，25kd和29kd，和預(yù)期分子量結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一個(gè)表達(dá)載體pGEM-LTB，其中所述載體包含了質(zhì)粒pGEM的全部序列和人LTB基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體的制備方法，它包括以下步驟(1)合成引物；(2)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得人LTB基因；(3)PCR擴(kuò)增獲得LTB基因；(4)將LTB基因克隆入pGEM載體。
3.根據(jù)權(quán)利要2所述的制備方法，其中用于擴(kuò)增的引物的序列自5’端為P15’ CGG TCT AGA GGC CTC GAG GGG ATC TAC 3’P25’ GCG ACT TTG GAA AAG CGA TTT GTC 3’
4.根據(jù)權(quán)利2所述的制備方法，其中用于擴(kuò)增的引物P1含有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)，P2含有Xba I酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體在基因克隆、抗原表達(dá)、藥物組合物及疫苗制備中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中pGEM-LTB用于單個(gè)或多個(gè)基因的插入及表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中pGEM-LTB用于小分子多肽的高效表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中pGEM-LTB用于制備藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中pGEM-LTB制備免疫疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)載體pGEM－LTB及其構(gòu)建方法和用途。本發(fā)明公開了一個(gè)表達(dá)載體pGEM－LTB,它包含質(zhì)粒pGEM的核酸序列和人源大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)的核酸序列。本發(fā)明還公開了用生物工程的方法制備pGEM－LTB的過程,以及pGEM－LTB在基因克隆、抗原表達(dá)、藥物組合物制備中的用途。由于用pGEM－LTB表達(dá)的小分子肽及LTB融合蛋白的非特異反應(yīng)極低,表達(dá)產(chǎn)物中LTB的活性肽片具有免疫佐劑作用,載體上外源基因的克隆位點(diǎn)具有互補(bǔ)內(nèi)切酶,可方便地進(jìn)行多個(gè)基因的插入及表達(dá),因而是pGEM－LTB是抗原表達(dá)的理想載體,具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1340625SQ0012285
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
發(fā)明者程芳, 肖云寧, 王燕蓉 申請(qǐng)人:程芳, 肖云寧, 王燕蓉