專利名稱：一種重組融合蛋白pacap-ptd及其表達(dá)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組融合蛋白PACAP-PTD及其表達(dá)方法 和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Il 體腺 Ρ 酸環(huán)化 Bl激 舌多月太(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)是1989年發(fā)現(xiàn)的，由腦垂體分泌的或目的組織自分泌和旁分泌的具 有重要生物學(xué)功能的神經(jīng)多肽，屬于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。PACAP的 具有3個(gè)受體PAC1是PACAP的特異受體；VPACl和VPAC2是PACAP和血管活性腸肽(VIP) 的共同受體；PACAP對(duì)3個(gè)受體具有相同的激動(dòng)功能。PACAP及其受體在體內(nèi)分布廣泛， 主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)以及睪丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等非神經(jīng)組織內(nèi) 等。目前已證實(shí)由PACAP介導(dǎo)的生物學(xué)功能有神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；神經(jīng)損傷 修復(fù)；調(diào)節(jié)血管功能；促進(jìn)激素分泌，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡；調(diào)節(jié)性腺功能和生殖細(xì)胞的產(chǎn)生； 參與消化活動(dòng)，調(diào)節(jié)能量代謝平衡；參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)；調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化；與攝食睡眠有 關(guān)；與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)；與某些心理感受有關(guān)；與動(dòng)物的生物鐘有關(guān)；等等。已有研究表明 PACAP通過(guò)激活其特異受體，有效促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。因此，PACAP具有預(yù)防、治 療神經(jīng)損傷，神經(jīng)修復(fù)、神經(jīng)失調(diào)等神經(jīng)相關(guān)疾病的潛能。PACAP為38個(gè)氨基酸組成，不具備主動(dòng)穿越各種生物屏障，如血腦屏障、血睪屏 障、血管內(nèi)皮屏障、氣血屏障、胎盤屏障、角膜、眼部?jī)?nèi)部各層細(xì)胞等的功能，只能通過(guò)擴(kuò)散 傳播。PTD(Protein transduction domain)是最初發(fā)現(xiàn)于HIV病毒TAT蛋白中的具有 穿膜功能的核心區(qū)；由11個(gè)氨基酸YGRKKRRQRRR組成，含有8個(gè)堿性氨基酸，生理?xiàng)l件下帶 較高的正電荷，并形成穩(wěn)定的a螺旋結(jié)構(gòu)。PTD具有強(qiáng)大的運(yùn)載潛能，能將外源性蛋白質(zhì)、 DNA、RNA、化學(xué)藥物等轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，甚至可以穿越血腦屏障。此過(guò)程不受化合物/復(fù)合物 分子類型和大小的限制，并且對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有顯著毒副作用。目前尚未有人利用PTD的運(yùn)載功能將PACAP多肽運(yùn)送進(jìn)入靶位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)相關(guān) 疾病的治愈，也未見有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種既可通過(guò)血腦屏障和穿細(xì) 胞膜運(yùn)輸?shù)?，又具備PACAP生物活性的重組融合蛋白PACAP-PTD。本發(fā)明另一目的在于提供一種編碼上述重組融合蛋白PACAP-PTD的核苷酸序列。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述編碼上述重組融合蛋白PACAP-PTD的核 苷酸序列的重組質(zhì)粒。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述重組質(zhì)粒的表達(dá)工程菌。本發(fā)明另一目的在于提供上述重組融合蛋白PACAP-PTD的表達(dá)方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述重組融合蛋白PACAP-PTD的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種重組融合蛋白PACAP-PTD，由55個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQID NO 1 所示。編碼該蛋白的重組融合蛋白PACAP-PTD的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒中含有權(quán)利要求2所述的重組融合蛋白PACAP-PTD的基因。一種表達(dá)工程菌，該工程菌是將權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌構(gòu) 建而得。本發(fā)明重組融合蛋白PACAP-PTD是采用常規(guī)的基因重組方法制備而得，包括如下 步驟(1)采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的基因，所述引 物序列如SEQ ID NO :4 6所示；(2)將所得基因經(jīng)雙酶切、克隆構(gòu)建得到重組質(zhì)粒；(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，構(gòu)建表達(dá)工程菌；(4)用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)工程菌表達(dá)重組目的蛋白；(5)重組目的蛋白經(jīng)純化、硫醇切割和水解，得到重組蛋白PACAP-PTD。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明表達(dá)方法步驟O)中所述雙酶切為NdeI和B10I雙酶 切。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明表達(dá)方法步驟中所述誘導(dǎo)劑為異丙基-D硫代 半乳糖苷。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明表達(dá)方法步驟(5)中所述純化是用幾丁質(zhì)柱純化；所 述硫醇切割是硫醇誘導(dǎo)蛋白內(nèi)含肽的N端切割；所述水解時(shí)多肽C端硫酯水解。作為一種最優(yōu)選方案，本發(fā)明表達(dá)方法的步驟如下(1)擴(kuò)增 PACAP-PTD 基因本發(fā)明設(shè)計(jì)合成3條引物，采用兩步PCR方法擴(kuò)增PACAP-PTD基因引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；引物3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。上述三條引物中，N代表保護(hù)堿基，CATATG為NdeI酶切位點(diǎn)，CTCGAG為BioI酶切 位點(diǎn)。兩步PCR 首先以現(xiàn)有的PACAP基因?yàn)槟０?，引?和2進(jìn)行第一輪PCR ；然后以 第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以引物1和3為引物，進(jìn)行第二輪PCR，獲得PACAP-PTD基因，所述 PACAP-PTD基因其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒用NdeI和BioI進(jìn)行酶切，將PACAP-PTD基因克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒；(3)構(gòu)建表達(dá)工程菌將上述所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)大腸桿菌宿主菌，構(gòu)建表達(dá)工程菌；大腸桿菌宿主 菌選用 E. coli. ER2566。(4)用誘導(dǎo)劑異丙基-D硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)重組目的蛋白；
(5)表達(dá)的目的蛋白經(jīng)幾丁質(zhì)柱純化，硫醇誘導(dǎo)蛋白內(nèi)含肽的N端切割，釋放目的 多肽C端硫酯，多肽C端硫酯水解得到重組融合蛋白PACAP-PTD。本發(fā)明首次利用基因工程原理和技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組的PACAP和PTD融合的新型融合 蛋白PACAP-PTD的制備及生物學(xué)功能的研究。PACAP-PTD既有PACAP的活性，又能跨細(xì)胞 屏障運(yùn)輸，穿過(guò)血腦屏障，血睪屏障，角膜，眼內(nèi)部各層細(xì)胞；使其用藥途徑獲得優(yōu)化，應(yīng)用 范圍得以擴(kuò)展。如原PACAP、VIP等多肽必須通過(guò)腦腔注射，才能進(jìn)入腦部；PACAP-PTD可腹 腔注射或靜脈注射即可進(jìn)入腦部作用；PACAP-PTD還可通過(guò)角膜進(jìn)入眼內(nèi)部房水，作用于 眼底神經(jīng)。而且穿越細(xì)胞屏障的功能可使PACAP-PTD可通過(guò)透皮或透粘膜吸收，從而提高 PACAP-PTD的應(yīng)用效率和應(yīng)用范圍。本發(fā)明的重組融合蛋白PACAP-PTD可用于診斷、治療與PACAP或其受體相關(guān)的疾 病，如能量代謝失調(diào)、糖尿病(包括I型、II型)、肥胖、肥胖相關(guān)疾病、代謝障礙、代謝相關(guān) 綜合癥、腦損傷、腦缺血、防止神經(jīng)細(xì)胞死亡、受損神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)及再生、抗炎、男性陽(yáng)痿、性 冷淡、不孕不育、女性性功能障礙，神經(jīng)痛、神經(jīng)病、神經(jīng)混亂、焦慮癥、精神病，記憶損傷、癡 呆、認(rèn)知混亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、偏頭痛、神經(jīng)畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖維化、動(dòng)脈硬 化、肌畏縮癥、胃潰瘍、高血壓、內(nèi)毒性休克、血栓癥、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)萎縮、神經(jīng)保護(hù)，神經(jīng) 損傷修復(fù)、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤、及 任何與PACAP/VIP有關(guān)的疾病，等等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的重組融合蛋白PACAP-PTD既具有PACAP的生物學(xué)活性，又因含有PTD， 而具備跨生物屏障運(yùn)輸?shù)墓δ埽?.細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重組融合蛋白PACAP-PTD具有促進(jìn)PACl-CHO細(xì)胞 增殖的功能，說(shuō)明PACAP-PTD具有PACAP的活性；3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PACAP-PTD不僅能有效穿越血腦屏障，而且可以穿過(guò)角膜 組織進(jìn)入房水。PACAP的藥用功能已被眾多的研究所確定，而PACAP-PTD賦予的穿越生物 屏障運(yùn)輸?shù)墓δ軐⑹蛊漭^易穿過(guò)血腦屏障、角膜、氣血屏障、血睪屏障和內(nèi)皮屏障等生物屏 障，極大地提高其在腦部，眼部、肺部和生殖器官等部位的應(yīng)用價(jià)值。4.本發(fā)明的重組融合蛋白PACAP-PTD在透皮吸收、粘膜吸收、穿角膜施藥等方面 都提供了研究基礎(chǔ)，而且鑒于該重組融合蛋白PACAP-PTD既有PACAP的活性，又能跨生物屏 障運(yùn)輸，可改善其用藥途徑及擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。


圖1為重組融合蛋白PACAP-PTD結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為重組融合蛋白PACAP-PTD純化的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為蛋白marker，1為菌體IPTG誘導(dǎo)前，2為菌體IPTG誘導(dǎo)后，3為菌體IPTG 誘導(dǎo)后破碎沉淀，4為菌體IPTG誘導(dǎo)后破碎上清，5為上清過(guò)幾丁質(zhì)柱流出液，6為洗柱流出 液，7/8/9為硫醇切割后洗脫液(含目的蛋白)；10為硫醇切割后柱填料上結(jié)合蛋白；圖3為PACAP-PTD飛行質(zhì)譜結(jié)果質(zhì)譜圖；圖4為PACAP-PTD促進(jìn)PAC1-CH0增殖活性測(cè)定；
圖5為PACAP-PTD穿越小鼠腦屏障的效率測(cè)定；
圖6為PACAP-PTD穿越小鼠角膜的效率測(cè)定；圖7為PACAP-PTD穿越兔角膜的效率測(cè)定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任 何限定。實(shí)施例1重組融合蛋白PACAP-PTD的制備本實(shí)施例重組融合蛋白PACAP-PTD的制備，包括如下步驟1. PACAP-PTD基因的擴(kuò)增及克隆首先設(shè)計(jì)并合成3條引物引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；引物3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。上沭三條弓I物中，N代表保護(hù)堿基,CATATG為NdeI酶切位點(diǎn)，CTCGAG為BioI酶切 位點(diǎn)。兩步PCR (1)第一步PCR，以現(xiàn)有的PACAP基因?yàn)槟０澹琍CR反應(yīng)體系為引物2(0. OlA/ μ L) 1 μ L、弓丨物 3(0. 01Α/μ 1) 1 μ L、含 PACAP 基因的質(zhì)粒 1 μ L、dNTP 10 μ L、10 X TaKaRa Ex Buffer 10 μ L、TaKaRa Ex Taq 酶 1 μ L 和 H2O 76 μ L ；PCR 反應(yīng)條件為94°C，4min ；94°C， 45sec、55°C，45sec、72°C，60sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin ；(2)第二步PCR，以第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，PCR反應(yīng)體系為引物1 (0. OlA/ μ L) 1 μ L、弓丨物 3(0. OlA/μ 1) 1 μ L、第一步 PCR 反應(yīng)液 1 μ L、dNTPIO μ L、10 X TaKaRa Ex Buffer 10 μ L、TaKaRa Ex Taq 酶 1 μ L 和 H2O 76 μ L ；PCR 反應(yīng)條件為94°C，4min ；94°C， 45sec、58°C，45sec、72°C，60sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin。上述兩步PCR所涉及到的試劑均為市售或者采用試劑盒配帶的均可。2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建用NdeI和XholJf PACAP-PTDX基因克隆到質(zhì)粒pKTO (市售)的NdeI和XhoI位 點(diǎn)間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKY-PACAP-PTD ；3.表達(dá)工程菌的構(gòu)建重組質(zhì)粒pKY-PACAP-PTD轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E. coli Strain ER2566 (市售)，構(gòu)建表 達(dá)工程菌 pKY-PACAP-PTD-ER ；4.誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)由目的多肽、蛋白內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合域(Chitin binding domain, CBD)組成的“三元”融合蛋白的表達(dá)挑取單克隆于5mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，搖菌培養(yǎng)過(guò)夜，以 1 20 (體積比)接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C搖菌至OD6tltl為0. 5-0. 8， 加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度lmm0l/L，3(TC誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá) 4h，離心收集菌體，重懸于 60mL 的溶液 M20mMTris. HCl,500mM NaCl，ImM EDTA，pH8. 0)，然 后超聲破碎，20，OOOg離心30min，收集上清，作為后續(xù)純化的上樣樣品。5.融合蛋白的純化
取IOmL 幾丁質(zhì)珠裝填 2. 5 X IOcm 層析柱，溶液 M20mM Tris-HCl，0. 5MNaCl，ImM EDTA，pH 8. 0)洗柱；取上述上樣樣品以0. 5mL/min的流速上樣；溶液A以2mL/min洗去雜 蛋白，3011^溶液^201111 Tris-HCl, 0. 5M NaCl，ImM EDTA，50mMβ -巰基乙醇，pH 8.0)快速 過(guò)柱，使巰基乙醇均勻分布并浸泡柱內(nèi)填料，16°C誘導(dǎo)蛋白肽切割16h;溶液A洗脫目 的多肽，分管收集，每2mL為一管，目的多肽大多存在于前10管中。SDS-PAGE鑒定目的多肽，電泳結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出融合蛋白部分以 可溶狀態(tài)存在于破碎上清，并能有效與幾丁質(zhì)柱結(jié)合(過(guò)柱后目的帶消失)，經(jīng)硫醇切割 后，融合蛋白能有效釋放目的多肽PACAP-PTD，其電泳位置與預(yù)期相吻合；而柱填料上能夠 檢測(cè)出原融合蛋白和切割后融合蛋白兩種蛋白。4°C透析過(guò)夜除去β-巰基乙醇。重組多肽PACAP-PTD送北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院進(jìn)行飛行質(zhì)譜檢測(cè)，分子量為 6681.81(圖3)，與理論值相符。本實(shí)施例所用LB培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域技術(shù)人員配制LB培養(yǎng)基所采用的常規(guī)配方。實(shí)施例2重組融合蛋白PACAP-PTD促進(jìn)PACl-CHO細(xì)胞增殖采用特異表達(dá)PACAP受體PACl的PACl-CHO細(xì)胞，鋪板于96孔板，待細(xì)胞密度達(dá) 到80%左右，改用無(wú)血清培養(yǎng)(饑餓培養(yǎng))過(guò)夜，加入梯度濃度的PACAP-PTD (lnM，IOnM, ΙΟΟηΜ，IOOOnM)孵育，M小時(shí)后用MTT測(cè)定細(xì)胞活性。結(jié)果如圖4所示，PACAP-PTD具有顯著(P < 0. 01)促進(jìn)PAC1-CH0增殖的活性，說(shuō) 明PACAP-PTD能有效激活體內(nèi)的PACl受體。實(shí)施例3重組融合蛋白PTD-PACAP穿血腦屏障膜的功能檢測(cè)利用FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記試劑盒，對(duì)PACAP-PTD，PACAP進(jìn)行熒光標(biāo)記，測(cè) 定標(biāo)記蛋白濃度及標(biāo)記蛋白熒光值，計(jì)算多肽標(biāo)記效率(即每mol多肽所攜帶FITC的值)。KM小鼠按體重隨機(jī)分兩組，分別腹腔注射PACAP_FITC 0. lnmol/kg ；和 PACAP-PTD-FITC 0. lnmol/kg ；注射后他，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠的腦組織，用PBS漂洗 數(shù)次。以150mg濕重腦組織/lml PBS的比例分裝至EP管中，超聲破碎妨s，4°C下16000g 離心30min，取上清200ul加入96孔板中，用熒光分光光度計(jì)，激發(fā)光495nm，檢測(cè)各個(gè)樣品 在520nm的發(fā)射強(qiáng)度。多肽穿越血腦屏障效率(％ )=(樣品熒光值-空白對(duì)照熒光值)/ (標(biāo)記效率WX蛋白上樣量)。設(shè)PACAP-FITC的穿血腦屏障的效率為1，PACAP_PTD_FITC組的穿血腦屏障的效率 與PACAP-FITC組的比值為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖5所示PACAP-PTD-FITC組穿血腦屏障的 效率是PACAP-FITC組的5.沈士0. 17倍，這說(shuō)明PACAP-PTD較PACAP有效穿越血腦屏障，進(jìn) 入腦組織。實(shí)施例4重組融合蛋白PACAP-PTD穿小鼠眼角膜屏障的功能檢測(cè)利用FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記試劑盒，對(duì)PACAP-PTD，PACAP進(jìn)行熒光標(biāo)記，測(cè) 定標(biāo)記蛋白濃度及標(biāo)記蛋白熒光值，計(jì)算多肽標(biāo)記效率(即每mol多肽所攜帶FITC的值)。KM小鼠按體重隨機(jī)分為三組，每組8只空白對(duì)照(PBS)、PACAP-FITC組、 PACAP-PTD-FITC組。小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)先用10%水合氯醛麻醉小鼠，在眼部滴50 μ L各組對(duì)應(yīng) 的實(shí)驗(yàn)樣品。暗處放置一小時(shí)后，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠完整眼球，放入EP管中，加入 Iml的PBS，于超聲破碎30s，重復(fù)兩次。在冷凍離心機(jī)中15000g，離心30min，取上清200 μ L加入96孔板中，用熒光分光光度計(jì)，激發(fā)光495nm，檢測(cè)各個(gè)樣品在520nm的熒光值。計(jì)算 多肽穿越眼角膜效率(％)=(樣品熒光值-空白對(duì)照熒光值)/(標(biāo)記效率WX蛋白上樣
量)O設(shè)PACAP-FITC的穿小鼠角膜的效率為1，PACAP_PTD_FITC組的穿小鼠角膜的效率 與PACAP-FITC組的比值為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖6所示PACAP-PTD-FITC組小鼠角膜的效 率是PACAP-FITC組的6. 67士0. 19倍，這說(shuō)明PACAP-PTD較PACAP有效穿越小鼠角膜，進(jìn)入 眼睛內(nèi)部。實(shí)施例5重組融合蛋白PTD-PACAP穿兔眼角膜屏障的功能檢測(cè)利用FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記試劑盒，對(duì)PACAP-PTD，PACAP進(jìn)行熒光標(biāo)記。測(cè) 定標(biāo)記蛋白濃度及標(biāo)記蛋白熒光值，計(jì)算多肽標(biāo)記效率(即每mol多肽所攜帶FITC的值)。新西蘭大白兔按體重隨機(jī)分為三組，每組5只空白對(duì)照(PBS)、PACAP-FITC組、 PACAP-PTD-FITC組。兔子實(shí)驗(yàn)時(shí)在眼部滴入100 μ L對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)樣品，使樣品充分浸潤(rùn)整 個(gè)眼球。暗處放置一小時(shí)后，用注射器穿刺眼部，吸取房水，裝入EP管中，在冷凍離心機(jī)中 15000g，離心5min，取上清200 μ L加入96孔板中，用熒光分光光度計(jì)，激發(fā)光495nm，檢測(cè) 各個(gè)樣品在520nm的熒光值。多肽穿越眼角膜效率(％ )=(樣品熒光值-空白對(duì)照熒光值)/(標(biāo)記效率WX 蛋白上樣量)。設(shè)PACAP-FITC的穿兔角膜的效率為1，PACAP_PTD_FITC組的穿兔角膜的效率與 PACAP-FITC組的比值為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖7所示PACAP-PTD-FITC組兔角膜的效率是 PACAP-FITC組的6. 17士0. 23倍，這說(shuō)明PACAP-PTD較PACAP有效穿越兔角膜，進(jìn)入房水。
權(quán)利要求
1.一種重組融合蛋白PACAP-PTD，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述重組融合蛋白PACAP-PTD的基因，其特征在于所述基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3.—種重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒中含有權(quán)利要求2所述的重組融合蛋白 PACAP-PTD 的基因。
4.一種表達(dá)工程菌，其特征在于所述工程菌是將權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿 菌宿主菌構(gòu)建而得。
5.權(quán)利要求1所述重組融合蛋白PACAP-PTD的表達(dá)方法，其特征在于所述方法包括如 下步驟(1)采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到核苷酸序列如SEQID NO :2所示的基因，所述引物序 列如SEQ ID NO :4 6所示；(2)將所得基因經(jīng)雙酶切、克隆構(gòu)建得到重組質(zhì)粒；(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，構(gòu)建表達(dá)工程菌；(4)用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)工程菌表達(dá)重組目的蛋白；(5)重組目的蛋白經(jīng)純化、硫醇切割和水解，得到重組蛋白PACAP-PTD。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組融合蛋白PACAP-PTD的表達(dá)方法，其特征在于步驟O)中 所述雙酶切為NdeI和BioI雙酶切。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組融合蛋白PACAP-PTD的表達(dá)方法，其特征在于步驟(4)中 所述誘導(dǎo)劑為異丙基- β -D硫代半乳糖苷。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組融合蛋白PACAP-PTD的表達(dá)方法，其特征在于步驟(5)中 所述純化是用幾丁質(zhì)柱純化；所述硫醇切割是硫醇誘導(dǎo)蛋白內(nèi)含肽的N端切割；所述水解 時(shí)多肽C端硫酯水解。
9.權(quán)利要求1所述重組融合蛋白PACAP-PTD在制備診斷、治療與PACAP或其受體相關(guān) 疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述重組融合蛋白PACAP-PTD的應(yīng)用，其特征在于所述與PACAP 或其受體相關(guān)疾病為能量代謝失調(diào)、糖尿病I型、糖尿病II型、肥胖、肥胖相關(guān)疾病、代謝障 礙、代謝相關(guān)綜合癥、腦損傷、腦缺血、防止神經(jīng)細(xì)胞死亡、受損神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)及再生、抗炎、 男性陽(yáng)痿、性冷淡、不孕不育、女性性功能障礙，神經(jīng)痛、神經(jīng)病、神經(jīng)混亂、焦慮癥、精神病， 記憶損傷、癡呆、認(rèn)知混亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、偏頭痛、神經(jīng)畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖 維化、動(dòng)脈硬化、肌畏縮癥、胃潰瘍、高血壓、內(nèi)毒性休克、血栓癥、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)萎縮、神 經(jīng)保護(hù)，神經(jīng)損傷修復(fù)、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增 殖、抗腫瘤或其它與PACAP/VIP有關(guān)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組融合蛋白PACAP-PTD及其表達(dá)方法和應(yīng)用。本發(fā)明重組融合蛋白PACAP-PTD的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明重組融合蛋白PACAP-PTD既具有PACAP的生物學(xué)活性，又將PTD的跨細(xì)胞屏障運(yùn)輸?shù)墓δ苜x予PACAP，使其具備穿越細(xì)胞屏障運(yùn)輸?shù)墓δ埽苡行Т┰窖X屏障、角膜、氣血屏障、血睪屏障和內(nèi)皮與粘膜組織等，極大地提高了PACAP-PTD在腦部、眼部、肺部、生殖器等部位的相關(guān)疾病中的應(yīng)用價(jià)值，可以改善其用藥途徑，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。
文檔編號(hào)A61P27/02GK102079790SQ201010248229
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者丁勇, 余榕捷, 李娟 , 湯翠翠, 趙秀麗, 陳建蘇, 黃霖 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)