專利名稱：Ngal質(zhì)粒構(gòu)建及其融合蛋白的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及NGAL蛋白，特別是涉及質(zhì)粒構(gòu)建及其融合蛋白的表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)是Kjeldsen等人于1993年在中性粒細(xì)胞的特殊顆粒中首先發(fā)現(xiàn)的，正 常表達(dá)于中性粒細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。進(jìn)一步 研究表明NGAL不僅在乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌、慢性粒細(xì)胞性白血病等細(xì)胞系中過(guò) 表達(dá)，并在癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與不良分化中發(fā)揮重要的作用。研究證實(shí)NGAL可通過(guò)捕獲細(xì)菌分 泌結(jié)合了鐵的小分子鐵螯合物，部分阻斷細(xì)菌的鐵攝取、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、參與抗微生物的固 有免疫應(yīng)答。在一些炎癥性疾病中，NGAL表達(dá)上調(diào)，是一種急性期反應(yīng)蛋白。尤其是NGAL 與腎臟的一些炎癥性疾病相關(guān)，是診斷急性腎損傷的重要生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)判斷與監(jiān)測(cè)病情 變化有顯著的意義。越來(lái)越多的證據(jù)也表明血液和尿液中NGAL的測(cè)定可成為判斷急性腎 損傷的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物。因此，制備NGAL融合蛋白對(duì)深入研究NGAL的功能及其臨床 診斷的應(yīng)用具有重要的意義。NGAL基因全長(zhǎng)5369bp，其中包括1695bp的5端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，178bp的3'端非轉(zhuǎn)錄 區(qū)，定位于染色體9q34，由7個(gè)外顯子和六個(gè)內(nèi)含構(gòu)成，屬單拷貝，蛋白編碼總長(zhǎng)度591bp， 為197個(gè)氨基酸殘基編碼，包括成熟肽段178年氨基酸殘基和前導(dǎo)序列19個(gè)氨基酸殘基。 成熟NGAL蛋白能夠以單體、同源二聚體或MMP-9 (matrix metalIoproteinase 9)以二硫鍵 形成異源二聚體等多種形式存在。目前，重組蛋白主要是通過(guò)大腸桿菌融合表達(dá)并進(jìn)行親 和層析純化而獲得，但是在本申請(qǐng)之前，沒(méi)有人公開或發(fā)表過(guò)本發(fā)明的人型NGAL蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的與人疾病相關(guān)的中性粒細(xì)胞明膠酶脂質(zhì)運(yùn)載蛋 白及其制備和應(yīng)用。1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與高效轉(zhuǎn)化菌株的篩選根據(jù)基因結(jié)構(gòu)及載體的克隆位點(diǎn)，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增NGAL cDNA 片段。然后，將擴(kuò)增片段與pET28a空載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-NGAL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta DE3后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及載體測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果和pET28a 載體多克隆位點(diǎn)及NGAL基因的ORF序列進(jìn)行同源比較，驗(yàn)證重組質(zhì)粒pET28a-NGAL克隆正確。挑選陽(yáng)性菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將未誘導(dǎo)的原核NGAL蛋 白為參照物，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)前、后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳及western blot篩選出高效 表達(dá)NGAL蛋白。2、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化(1)將高效NGAL重組菌株在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，離心收集菌液。(2)細(xì)菌沉淀用BindingBuffer(無(wú)尿素，20mM咪唑)懸浮，反復(fù)凍融破碎細(xì) 胞，加Lysozyme至lmg/ml，冰上孵育lh，4°C、10000rpm、20min，取上清，將沉淀用變性的 BindingBuffer (8M尿素)懸浮，然后室溫?fù)u動(dòng)30min，再對(duì)上清和尿素懸浮的沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE，分析目的蛋白以包涵體的形式存在于沉淀中。沉淀經(jīng)50g/L積層膠，150g/L分 離膠進(jìn)行SDS-PAGE，倒積層膠時(shí)不插梳子，讓積層膠的頂端和玻璃板的頂端之間有Icm的 距離(便于大量上樣)，電泳完畢后，用預(yù)冷的0. 25mol/L的KCL溶液染色5-lOmin，參照 同樣條件下用考馬斯亮藍(lán)R250染色的凝膠，仔細(xì)辨認(rèn)融合蛋白條帶后，用潔凈的手術(shù)刀片 切下目的蛋白所在的凝膠塊，用PBS洗3次后，將凝膠塊切成0. 1-0. 3mm左右的小顆粒，加 入適量PBS反復(fù)凍融3-4次，再4°C浸泡過(guò)夜，使目的蛋白釋放到溶液中，lOOOOr/min離心 5min收集上清液，用120g/L的SDS-PAGE對(duì)純化效果進(jìn)行鑒定見(jiàn)圖6，bardford測(cè)蛋白濃 度，置-20°C保存。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化與篩選，證實(shí)未加IPTG誘導(dǎo)前，沒(méi)有融合蛋白的 表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)后3小時(shí)可獲得高效表達(dá)NGAL融合蛋白。該蛋白質(zhì)可用于篩選或抗NGAL 蛋白質(zhì)的抗體。表達(dá)的重組NGAL蛋白還可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或激活NGAL功能 的蛋白質(zhì)分子。


圖1為pET28a載體結(jié)構(gòu)圖；圖2為瓊脂糖凝膠電泳鑒定NGAL基因PCR產(chǎn)物電泳圖；圖3為瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組表達(dá)載體pET28a_NGAL及雙酶切電泳圖圖4為SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況；圖5為western blot評(píng)估不同時(shí)間段NGAL融合蛋白表達(dá)產(chǎn)量的電泳圖；圖6為蛋白純化圖。其中圖2 (1)為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；圖2 O)為NGAL的PCR產(chǎn)物。圖3 (1)為DNA標(biāo) 準(zhǔn)DL2000 ；圖3 (2)為pET28a-NGAL重組質(zhì)粒；圖3⑶為HindIII和BamH I雙酶切重組質(zhì) 粒。圖4(1)為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；圖4(2)未誘導(dǎo)的pET28a-NGAL;圖4(3)為IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)的pET28a-NGAL的總蛋白；圖4⑷為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a_NGAL上清；圖4(5) 為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a-NGAL沉淀。圖5(1)為IPTG誘導(dǎo)Ih的融合蛋白；圖5 (2)為 IPTG誘導(dǎo)池的融合蛋白；圖5(3)為IPTG誘導(dǎo)池的融合蛋白；圖5(4)為未加IPTG誘導(dǎo)。 圖6 (1)為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；圖6 (2)為IPTG誘導(dǎo)池pET28a-NGAL的總蛋白；圖6 (3) 為純化的NGAL融合蛋白。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是 限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1。重組質(zhì)粒的構(gòu)建
IjJ^fNGAL cDNA 片段以人白血病細(xì)胞K562cDNA為模板，用下列引物擴(kuò)增Pl 5' -TAGAAAGCTTCACTCAGCCGTCGATACAC-3‘，P2 5' -ATAGGGATCCGAAATCATGCCCCTAGGTC-3‘；PCR弓丨物兩端分別弓丨入Hindi 11和BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)記)，斜體部分為 酶切位點(diǎn)前加的保護(hù)堿基，25ul的PCR反應(yīng)體系成分為2XPCR mixl2. 5ul, pET28a_NGAL Iul，Pl Iul，P2 Iul，PCRwater9. 5ul。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5min 預(yù)變性；94°C變性 50s， 59°C退火45s，72°C延伸50s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后用1. 5%的瓊 脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，見(jiàn)圖22、構(gòu)建重組pET28a_NGAL表達(dá)載體將純化的PCR產(chǎn)物和載體pET28a_vector用Hind III.BamH I雙酶切后，分別回收 酶切產(chǎn)物。在jM DNA連接酶作用下定向?qū)GAL基因片段與pET28a-vect0r連接。連接反應(yīng) PCR產(chǎn)物!3ul，pEI^8a 空載體 lul，2Xligation buffer 5ul，T41igase lul.混勻后 16°C連 接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞和鋪LB (kna)板，挑選單克隆接種5ml含有 30ug/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)O20rpm/min) 15h，堿裂解法提取質(zhì)粒并 進(jìn)Hind III和BamH I雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組表達(dá)載體pET28a_NGAL見(jiàn)圖 3.所獲得的pET28a-NGAL重組子進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行BLAST分析，確認(rèn)序列的正確性。3、篩選高效表達(dá)的融合蛋白將測(cè)序正確的NGAL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta DE3中，挑選含有表達(dá)質(zhì)粒 Rosetta DE3單個(gè)菌落接至5ml含有30ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，37 °C、 220r/min，以1 100轉(zhuǎn)接到新鮮的含30ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。于37°C培養(yǎng)至A600 =0. 4-0. 6時(shí)，取出ImL菌液做對(duì)照，加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。共誘導(dǎo)Mh， 分別于誘導(dǎo)2h、3h、4h、6h、10h、24h離心收集菌體。SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況，western blot證實(shí)不同時(shí)間段表達(dá)量的不同見(jiàn)圖5。離心前取aiil以備總蛋白電泳分析。實(shí)施例2。pET28a_NGAL融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化從上述LB平板挑取經(jīng)western blot鑒定為高表達(dá)的重組克隆接種于5ml含有 30ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，37°C、220r/min，以1 100轉(zhuǎn)接到新鮮的含 30ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。于37°C培養(yǎng)至A600 = 0. 4-0. 6時(shí)，加入終濃度為lmmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h，4°C、10000r/min、20min，徹底去上清，細(xì)菌沉淀用BindingBuffer (無(wú) 尿素，20mM咪唑)懸浮反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，加Lysozyme至lmg/ml，冰上孵育lh，4°C、 10000rpm、20min，取上清，將沉淀用變性的BindingBuffer (8M尿素)懸浮，然后室溫?fù)u動(dòng) 30min,對(duì)上清和尿素懸浮的沉淀行SDS-PAGE，分析目的蛋白以包涵體的形式存在于沉淀 中，沉淀經(jīng)50g/L積層膠，150g/L分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，倒積層膠時(shí)不插梳子，讓積層膠的 頂端和玻璃板的頂端之間有Icm的距離(便于大量上樣)，電泳完畢后，用預(yù)冷的0. 25mol/ L的KCL溶液染色5-lOmin，參照同樣條件下用考馬斯亮藍(lán)R250染色的凝膠，仔細(xì)辨認(rèn)融合 蛋白條帶后，用潔凈的手術(shù)刀片切下目的蛋白所在的凝膠塊，用PBS洗3次后，將凝膠塊切 成0. 1-0. 3mm左右的小顆粒，加入適量PBS反復(fù)凍融3_4次，再4°C浸泡過(guò)夜，使目的蛋白釋 放到溶液中，lOOOOr/min離心5min收集上清液，用120g/L的SDS-PAGE對(duì)純化效果進(jìn)行鑒 定見(jiàn)圖，bardford測(cè)蛋白濃度，置-20 V保存。
權(quán)利要求
1.一種NGAL原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征(1)PCR擴(kuò)增 NGAL 的 cDNA ；(2)PCR產(chǎn)物與載體pET28a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a_NGAL ；(3)重組質(zhì)粒pET28a-NGAL轉(zhuǎn)化大腸桿菌RosettaDE3，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，得到NGAL 融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的NGAL為人源NGAL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的引物為 Pl 5' -TAGAAAGCTTCACTCAGCCGTCGATACAC-3'，P2 5' -ATAGGGATCCGAAATCATGCCCCTAGGTC-3'。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)生產(chǎn)NGAL融合蛋白的方法，其特征在于包括如 下步驟(1)篩選高效表達(dá)的NGAL蛋白的菌落；(2)將高效表達(dá)的重組菌落用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得含有NGAL融合蛋白 的菌液；(3)離心，往沉淀中加入尿素去除包涵體、室溫?fù)u動(dòng)、收集融合蛋白；(4)SDS-PACE鑒定融合蛋白；(5)切膠純化融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于使用KCL對(duì)凝膠進(jìn)行短暫染色，并參照同樣 條件下用考馬斯亮藍(lán)R250染色的凝膠，直接從聚丙烯酰胺凝膠上切割下含有NGAL的凝膠 條帶。
全文摘要
一種NGAL質(zhì)粒構(gòu)建及其融合蛋白的表達(dá)，其特征是(1)PCR擴(kuò)增NGAL的cDNA；(2)PCR產(chǎn)物與載體pET28a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-NGAL；(3)重組質(zhì)粒pET28a-NGAL轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta DE3，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，得到NGAL融合蛋白。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化與篩選，證實(shí)未加IPTG誘導(dǎo)前，沒(méi)有融合蛋白的表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)后3小時(shí)可獲得高效表達(dá)NGAL融合蛋白，該蛋白質(zhì)可用于篩選或抗NGAL蛋白質(zhì)的抗體。表達(dá)的重組NGAL蛋白還可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或激活NGAL功能的蛋白質(zhì)分子。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102127564SQ201010590430
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者劉靜, 熊火梅, 王小中, 章海斌, 肖蕓, 黃波 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)