專利名稱：一種綠色木霉菌株及其代謝物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及一種綠色木霉菌株及其代謝物的應(yīng)用，屬于微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
花生(Arachis hypogaea L.)是我國重要的油料和經(jīng)濟作物，其種植面積和生產(chǎn)總量居世界前列，在國際上具有很強的競爭力。一直以來，花生特別容易受黃曲霉毒素污染，受污染后的花生不但產(chǎn)量和品質(zhì)大大下降，還嚴重威脅人類的生命健康，因此如何合理有效地防治花生免受黃曲霉毒素污染是提高花生出口貿(mào)易的重要問題。黃曲霉(Aspergillus flavus)存在于霉變的花生中，在生長后期，黃曲霉產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(Aflatoxins)，對人體和畜禽的組織器官產(chǎn)生毒性傷害，誘發(fā)癌癥。由于黃曲霉能在比較惡劣的環(huán)境下生長，因此控制黃曲霉及其毒素的污染比較困難。農(nóng)業(yè)上防治真菌及其毒素對食品污染的主要途徑是遵守良好的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)操作規(guī)范，選擇抗真菌的優(yōu)良品種，但由于黃曲霉毒素是一種次級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生量受環(huán)境影響十分嚴重，所以田間的預(yù)防措施也不能完全避免黃曲霉毒素的污染。收獲后儲藏過程中采取措施，如化學(xué)防霉等可抑制或延緩微生物的生長，但防霉效果不是很理想，而且化學(xué)防霉劑對人和動物有諸多潛在的危害。由于黃曲霉毒素對熱不敏感，100°c處理20h黃曲霉毒素都不會被破壞，巴氏消毒也不能去除毒素的污染，因此采取預(yù)防措施是避免黃曲霉毒素的最佳辦法。但目前還缺少真正有效、經(jīng)濟、操作性強的防霉去毒措施，因此從安全的角度出發(fā)， 考慮利用微生物之間的拮抗作用，探索生物控制方法以預(yù)防真菌的生長與產(chǎn)毒具有重要意義。盡管目前已經(jīng)篩選到的抗黃曲霉化合物有很多，但真正能夠投入實踐中應(yīng)用的卻很少，篩選出的微生物對黃曲霉的拮抗效果也不太理想，且成本較高，現(xiàn)急需尋找新的拮抗菌來抑制黃曲霉的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種綠色木霉菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供一種降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑，該制劑含有上述綠色木霉菌株。本發(fā)明的再一目的在于提供所述降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種綠色木霉(Trichoderma viride)菌株，名稱為綠色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為 CCTCC M 2010291。所述綠色木霉菌株應(yīng)用于防治黃曲霉素的污染。一種降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑，含有上述綠色木霉菌株的代謝物；所述降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑的制備方法，包含以下步驟將綠色木霉菌株接種到PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)液體培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵上清即為降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑。所述的PDA液體培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，pH6. 8，蒸餾水定容至 IOOOml ；所述的發(fā)酵條件可用現(xiàn)有技術(shù)中木霉的搖瓶發(fā)酵條件和發(fā)酵罐發(fā)酵條件，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的條件優(yōu)選為接種量IO5 IO7個孢子/IOOml培養(yǎng)基，28 30°C，200rmp搖菌培養(yǎng) 5 8天；所述制劑應(yīng)用于降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，具體步驟包括將所述制劑直接噴灑于收獲前2周的花生土壤中或是將所述制劑稀釋或濃縮后噴灑于收獲前2周的花生土壤中均可。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明提供了一種能有效拮抗黃曲霉生長的綠色木霉菌株。該綠色木霉菌株的代謝物噴灑于花生種植土壤中，能有效地降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，降低率達97%。


圖1是GZlOl制劑對黃曲霉毒素Bl的降解作用圖。圖2為GZlOl制劑對土壤黃曲霉種群數(shù)的影響圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1(1)綠色木霉菌株的分離及鑒定①分離土樣取自廣東省汕頭市花生種植田土壤。稱取土樣10g，放入盛有IOOml無菌水的帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩搖勻IOmin使土和水充分混合。在無菌操作條件下，用移液槍從三角瓶中吸取lml，加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，依此類推分別制成10-2、10_3、10-4不同稀釋度的土壤溶液。②涂布培養(yǎng)及劃線分離以10_2及10_3兩個濃度的土壤稀釋液作為涂布平板培養(yǎng)的對象，將其涂布在PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂)固體培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂 15g，pH6.8，蒸餾水定容至1000ml)上，每個樣3個重復(fù)，28°C培養(yǎng)3天后，對平板中的微生物進行觀察，用接種環(huán)挑取平板中長勢旺盛的菌株進行劃線分離，得到純培養(yǎng)物。接著對純培養(yǎng)進一步篩選利用牛津杯雙層平板法將純培養(yǎng)物的發(fā)酵液對黃曲霉進行抑菌活力的測定(所用的黃曲霉為黃曲霉GIM3. 17，購于中科院微生物所)，得到了不僅能抑制黃曲霉菌絲的生長，還能抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)的黃曲霉拮抗菌GZ101。③菌株鑒定A、形態(tài)學(xué)鑒定平板上菌落形態(tài)特征將接種針經(jīng)火焰滅菌并待冷卻后，從斜面上挑取少量黃曲霉拮抗菌GZlOl菌體，接種于平板的中間位置，倒置于25°C培養(yǎng)7 14天，觀察菌落特征。 結(jié)果表明，在察氏固體培養(yǎng)基上，生長較差，菌絲稀疏，培養(yǎng)7天后有稀疏的綠色產(chǎn)孢子叢束區(qū)，菌落反面無色；在麥芽汁固體培養(yǎng)基上生長快，培養(yǎng)7天后菌絲鋪滿整個平皿，最初為白色致密的基質(zhì)菌絲，而后出現(xiàn)棉絮狀氣生菌絲，并形成密實產(chǎn)孢叢束區(qū)，常排成同心輪紋，黃綠色的產(chǎn)孢區(qū)，有輻射狀溝紋，菌落反面無色；在PDA固體培養(yǎng)基上生長速度快，培養(yǎng) 7天后菌絲鋪滿整個平皿，最初為白色致密的基質(zhì)菌絲，而后出現(xiàn)棉絮狀氣生菌絲，并形成密實產(chǎn)孢叢束區(qū)，常排成同心輪紋，深黃綠色至深藍綠色的產(chǎn)孢區(qū)，菌落反面無色。顯微鏡下形態(tài)特征觀察用解剖針從培養(yǎng)皿的菌落上，挑取少量黃曲霉拮抗菌 GZlOl菌體，置載玻片的水滴中，加蓋蓋玻片。于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。發(fā)現(xiàn)其菌絲透明，壁光滑，有隔，直徑1.5 8μπι，厚垣孢子間生于菌絲中或頂生于短側(cè)枝上，多數(shù)為球形，少數(shù)為橢圓形，透明，壁光滑；分生孢子梗為菌絲的短側(cè)枝，其上對生或互生分枝，分枝上繼續(xù)分枝，形成二級、三級分枝，小梗瓶形成錐形，基部稍窄，中部較寬，從中部以上變窄成長頸，(8 12) X O. 5 3) μ m,分生孢子多數(shù)為球形，直徑2. 5 4. 5 μ m，少數(shù)孢子為短倒卵形，(4 5) X (3. 5 4) μ m。根據(jù)以上培養(yǎng)特征及顯微形態(tài)特征結(jié)果，查《真菌鑒定手冊》及《真菌的形態(tài)和分類》可知，該菌與綠色木霉菌(Trichoderma viride)最相似。B、分子生物學(xué)方法進行鑒定黃曲霉拮抗菌GZlOl的DNA的提取將GZlOl菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28°C 恒溫培養(yǎng)3 5天后，將菌絲轉(zhuǎn)移至滅過菌的研缽中，用液氮將菌體迅速研磨成粉末后，用基因組提取試劑盒提取基因組DNA。PCR擴增以提取的DNA為模板，用真菌通用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)、IT S2(5，-GCTGCGTTCATCGATGC-3，)擴增 18S rDNA
基因。PCR反應(yīng)體系為試劑體積2x PCR Master Mix5 μ L引物ITSl (濃度為 10 μ Μ)IyL引物ITSl (濃度為 10 μ Μ)IyL基因組DNA (濃度為 10ng/uL)5 μ L滅菌水定容至50 μ L反應(yīng)條件94"C 5min ；940C Imin，56 lmin，72°C 2min(30 個循環(huán))；72 °C 7min ；4°C 保存。將擴增條帶回收后送往上海英俊公司測序，測序序列如下所示。將測得的18S rDNA基因序列在GenBank等國際核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行同源序列搜索(blast search)，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等國際菌種保藏中心的菌株。結(jié)合形態(tài)特征，確定黃曲霉拮抗菌GZlOl為綠色木霉菌(Trichoderma viride)。將該菌株命名為綠色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為 CCTCC M 2010291ο測序序列
權(quán)利要求
1.一種綠色木霉(Trichoderma viride)菌株，其特征在于該綠色木霉菌株名稱為綠色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010291。
2.權(quán)利要求1所述綠色木霉菌株應(yīng)用于防治黃曲霉素的污染。
3.一種降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑，含有權(quán)利要求1所述綠色木霉菌株的代謝物。
4.權(quán)利要求3所述降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟將綠色木霉菌株接種到PDA液體培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵上清即為降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑。
5.權(quán)利要求3所述制劑應(yīng)用于降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，其特征在于包括如下步驟將所述制劑噴灑于收獲前2周的花生土壤中即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種綠色木霉菌株及其代謝物的應(yīng)用，屬于微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。該綠色木霉菌株能有效拮抗黃曲霉生長，其名稱為綠色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM 2010291。該綠色木霉菌株在PDA液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵上清噴灑于花生種植土壤中，能有效地降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，降低率達97％，因此可應(yīng)用該綠色木霉菌株的代謝物制備成降低花生收獲前黃曲霉毒素污染的制劑。
文檔編號C12N1/14GK102168019SQ20101058986
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉付香, 周桂元, 李少雄, 李玲, 梁炫強, 洪彥彬, 溫世杰 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所