專利名稱：一種草莓nced基因及其載體的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種草莓NCED基因與該基因植物表達 載體的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
脫落酸作為一種在植物的整個生命循環(huán)中起著重要作用的激素，在植物胚胎發(fā) 育、種子休眠與萌發(fā)、果實成熟以及植物對逆境脅迫的響應(yīng)等許多方面具有廣泛的生理效 應(yīng)，對植物的生長發(fā)育起著重要的作用。ABA的間接合成途徑需要經(jīng)聚合、環(huán)化、異構(gòu)化、氧 化、裂解等一系列復(fù)雜的反應(yīng)變化，其中很多細節(jié)問題還不清晰，對其調(diào)節(jié)機理的研究也才 剛剛起步，合成過程中涉及的各種基因如何表達，各種酶的特異性也有待進一步證實。9-順 式環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶(NCED)催化9-順式-紫黃質(zhì)和9-順式新黃質(zhì)裂解形成黃質(zhì) 醛，此步驟被認為是植物ABA生物合成的關(guān)鍵步驟，NCED被認為是ABA合成中的一個關(guān)鍵 酶，對ABA的合成調(diào)控起到了十分重要的作用，NCED在果實成熟、萎蔫、缺水等過程或條件 下對ABA的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。目前并沒有關(guān)于草莓NCED基因的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種草莓NCED基因及其載體的構(gòu)建，為研究草莓ABA合成 代謝機制奠定了基礎(chǔ)，
本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
本發(fā)明的基因Λ 來源于草莓(/^^aria ananassa Duch )，該基因的核苷酸序 列是以下核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID NO :1ο2)與序列表中SEQ ID NO 1限定的cDNA序列具有90%以上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的cDNA序列。草莓ΛΟ恐基因編碼的9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶蛋白序列，編碼具有序列 表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至 少95%的同源性并具有相同功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種草莓NCED基因的植物表達載體的構(gòu)建。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明從草莓中克隆了 9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶的編碼基因，該基因在 成熟、萎蔫、干旱、高溫和抵溫等過程或條件下對ABA的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明 為研究草莓ABA合成代謝機制奠定基礎(chǔ)，為通過基因工程調(diào)控植物體內(nèi)ABA的代謝和積累 提供基因源。


圖1為草莓Λ 基因的克?。黄渲蠥 基因的保守區(qū)產(chǎn)物；B 基因的3’ RACE產(chǎn)物；C :Λ ￡ 基因的5’RACE產(chǎn)物；C :0RF克??；D 全長基因克??；M:DNA分子量標(biāo) 準DL2000 ；
圖2為ρΒΙ121-ΛΚ￡ 限制酶分析；其中1 -.Xba I私BamH I雙酶切ρΒΙ121_ΛΚ￡ ; M X-EcoT 14 I digest。
具體實施例方式實施例1草莓NCED基因的克隆
采用Trizol說明提取草莓果實總RNA。按大連寶生物有限公司的I^rimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的方法合成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄引物AP序列為 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC (T)17-3'。根據(jù)genebank里大豆、豇豆、菜豆、萊iNCED基因序列設(shè)計一 對保守區(qū)簡并引物，上游附5 ‘ -GGK CACCACTTCTTCGACGG-3 ‘，下游N2 5' -CTCTTCAAACTCTCVTCGCATTC-3‘，以這兩個引物進行PCR擴增，擴增出842 bp的片段， 如圖IA所示。根據(jù)草莓ΛΟ沿基因保守區(qū)克隆測序結(jié)果，設(shè)計3'端順式引物N3，引物序列 為5' -ATCTGGGTTGAGTCGCCGG-3 ‘，與通用引物AUAP配對進行PCR擴增，AUAP序列為 5' -GGCCACGCGT CGACTAGTAC-3‘。根據(jù) 3' RACE 的原理，擴增出了 3'端8(^bp 的片段， 如圖IB所示，其中包括一個含19個腺苷酸的poly (A)0根據(jù)草莓已獲得的ΛΟ沿基因測序的基礎(chǔ)上，設(shè)計了 2個5端反式引物，分別為N4 5' -AAGAGGCGGTCGTTGAAGTA-3 ‘和 P5:5' -GTCTCCCGATTTCACGCTCC-3 ‘。以大連寶生物 有限公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒為基礎(chǔ)，以N4為引物 合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈加同聚物尾，在加尾的基礎(chǔ)上進行cDNA第二鏈的合成，產(chǎn)物 用于PCR擴增。N5與通用引物AUAP配對進行PCR擴增。根據(jù)5' RACE的原理，擴增出了 5'端581的片段，如圖IC所示。根據(jù)草莓ΛΟ沿保守區(qū)序列、5'端、3'端序列結(jié)果，拼接出全長cDNA，分別設(shè)計 ORF引物N6和N7以及全長引物N8和N9，進行NCED cDNA ORF和全長克隆，驗證已獲得的 序列，如圖 1 中 D、E 所示，4 個引物的序列為 N6 5' -ATGGCTACTCCTTCGAATAGTTG-3‘，N7 5' - CTATGCCTGGTTTTTCAAGGC -3' , N8 5' - GAAACAAAACACATAAAACACCTTGC -3' , N9 5' - AAGGCAGAACTCCTAAATATTTACC -3'。草莓ΛΚ 全長cDNA為序列表中SEQ ID NO :1，該cDNA全長22 bp，兩端含有53 bp的5'非編碼區(qū)和345 bp的3'非編碼區(qū)，以19個腺苷酸的poly (A)結(jié)尾。具有完 整的開放閱讀框(第討個堿基 第1880個堿基)，共1827個堿基，編碼609氨基酸，編碼序 列表中SEQ ID NO 2蛋白質(zhì)。實施例2草莓NCED基因植物表達載體構(gòu)建
根據(jù)草莓ΛΟ沿基因cDNA全序列的編碼區(qū)、植物表達載體pBI121的多克隆位點，設(shè)計 一對特異引物用于雙 基因完整開放閱讀框的擴增，分別在5'和3'引入Zh l.BamH I 酶切位點(NCEDX :5，-GCTCTAGAATGGCTACTCCTTCGAATAGTTG-3 ‘ ；NCEDB 5，-CGGGATCC CTATGCCTGGTTTTTCAAGGC-3 ‘ )，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)損a I和BatnH I雙酶切，回收基因片 段。植物表達載體PBI121質(zhì)粒用損a I和I雙酶切，回收載體片段。將Λ 基因片段和PBI121的載體片段在T4連接酶的作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ε. coli DH5 α，涂在含有Kan的LB平板上，挑取單菌落分別以PCR、酶切和測序進行驗證，如圖2所 示，鑒定為陽性的重組表達質(zhì)粒命名為ΡΒΙ121-ΛΚ 即為構(gòu)建好的植物表達載體。
權(quán)利要求
1.一種草莓NCED基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列是以下核苷酸序列之一1)如SEQ ID NO 1 所示；2)與SEQID NO 1具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的cDNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓NCED基因，其特征在于所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示或與SEQ ID NO 2具有至少95%的同源性并具有相同功能的氨基酸序列。
3.含有如權(quán)利要求1或2所述基因的重組表達載體。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種草莓NCED基因及其載體的構(gòu)建，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示或與SEQ ID NO1具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的cDNA序列。本發(fā)明從草莓中克隆了9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶的編碼基因，該基因在成熟、萎蔫、干旱、高溫和抵溫等過程或條件下對ABA的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明為研究草莓ABA合成代謝機制奠定基礎(chǔ)，為通過基因工程調(diào)控植物體內(nèi)ABA的代謝和積累提供基因源。
文檔編號C12N15/29GK102094033SQ20101058951
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者朱海生 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所