專利名稱：一種構建gfor過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法
一種構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及山梨醇生產(chǎn)技術領域，具體地說，是一種通過構建一個葡萄糖-果糖 氧化還原酶(GFOR)過表達質粒，并在運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)中將葡萄 糖_果糖氧化還原酶過量表達，從而增強山梨醇生物催化生產(chǎn)效率及得率的方法。
背景技術：
山梨醇是一種存在于許多水果中的多羥基化合物。山梨醇的應用范圍很廣，它是 一種最具開發(fā)潛力的關鍵中間體。目前，山梨醇主要是合成維生素C的原料，大約有20% 用于生產(chǎn)維生素C ；同時，山梨醇作為甜味劑、保濕劑、軟化劑也被廣泛用于食品工業(yè)、化妝 品、藥品的生產(chǎn)。目前較為普遍的生產(chǎn)方法是采用葡萄糖催化加氫法生產(chǎn)山梨醇。生物法生產(chǎn)山梨醇就目前而言，在能生產(chǎn)山梨醇的微生物中只有運動發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)具有實現(xiàn)工業(yè)化的潛力。運動發(fā)酵單胞菌能夠組成型的表達一種葡 萄糖-果糖氧化還原酶(Glucose-Fructose oxidoreductase，GF0R)。該酶通過緊密結合 的輔酶(NADP)催化葡萄糖氧化為δ-葡萄糖內酯并產(chǎn)生Imol的還原力(NADPH)；同時該 酶將NADPH中的電子提供給果糖，完成果糖向山梨醇的轉換(見

圖1)。而δ-葡萄糖內酯 會在該菌株生成的S-葡萄糖內酯酶或者自發(fā)水解的作用下，迅速轉化生成葡萄糖酸。由 于葡萄糖_果糖氧化還原酶催化反應的高度選擇性以及該反應條件的溫和性，因此該法不 涉及到高壓容器的使用，生成的兩個產(chǎn)物山梨醇和葡萄糖酸都是重要的化工原料并可分別 進行回收利用。根據(jù)生物法生產(chǎn)山梨醇的以上優(yōu)點不難看出，利用生物法生產(chǎn)山梨醇的化 工過程符合當今經(jīng)濟和社會發(fā)展對低能耗，低污染工業(yè)技術的需求，有可能發(fā)展成為現(xiàn)有 生產(chǎn)山梨醇的替代技術。利用生物法生產(chǎn)山梨醇與其他生物催化法生產(chǎn)化學品有著共同的一個特點就是 方便的獲得大量、性質穩(wěn)定和廉價的生物催化劑(酶或細胞)是決定生物催化過程能否真 正用于實際工業(yè)中的一個決定因素。根據(jù)以往國內外相關的文獻報道可知，來源于運動發(fā) 酵單胞菌的葡萄糖-果糖氧化還原酶具有良好的穩(wěn)定性以及高度的催化選擇性。整個酶催 化反應機理單一，除山梨醇和葡萄糖酸外沒有其他副產(chǎn)物。經(jīng)過大量和長期的研究，國內 外學者提供了各種經(jīng)濟可行的細胞催化反應工藝；然而，作為催化劑的GFOR的來源，始終 是制約該過程在實際中得以應用的一個關鍵瓶頸。國外曾有許多學者曾通過將運動發(fā)酵 單胞菌中編碼GFOR的基因(gfo)進行克隆，并將其置于大腸桿菌表達體系中進行過量表 達，以期獲得大量和廉價的酶制劑(Arch. Microbiol. 1996，166，32-41 ；)。然而，由于編碼 GFOR的基因在運動發(fā)酵單胞菌中表達后存在一個表達后轉運以及加工的過程(其具體機 理仍然未見相關報道)，因此編碼該酶的基因至今仍然無法在大腸桿菌及其他常見表達體 系中大量表達出具有活性的產(chǎn)物(J. Bacteriol. 1992，174，1439-1447 ；Structure 1996， 4，1413-1428 ；Eur. J. Biochem. 1997，244，107-112) ；GFOR 的來源仍然僅限于從運動發(fā)酵單 胞菌中提取獲得。盡管曾經(jīng)有文獻報道，通過使用高糖濃度培養(yǎng)基以及使用玉米漿代替發(fā) 酵培養(yǎng)基中的酵母提取物的方法可以在一定程度上提高運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)GFOR的
3產(chǎn)量或者降低生物催化劑制備過程的成本(BrazilianJ. Microbiol. 2003，34，329-333)，然 而整個過程中GFOR得率以及比酶活低仍未能得到有效的解決。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種通過構建一個葡萄糖_果糖氧 化還原酶(GFOR)過表達質粒，并在運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)中將GFOR過 量表達，及其在制備山梨醇中的應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的本發(fā)明使用的表達載體是本實驗室構建的革蘭氏陰性菌細菌廣泛宿主接合轉移 質粒pLT20a ；所構建的表達載體pLT20a-gfo的表達單元具有如表1所示的核苷酸序列 (SEQ ID No:l)，其中引物序列根據(jù)此序列進行設計，并通過在引物的兩端添加XbaI和 EcoRI限制性內切酶識別序列用于基因的克隆以及pLT20a-gfo載體的構建；本發(fā)明所設計的構建引物，具有如表2所示的核苷酸序列(SEQ ID No 2)；本發(fā)明所構建的多拷貝表達載體pLT20a-gfo，其在Z. mobilis ZM4菌體中的拷貝 數(shù)為兩個或者兩個以上；本發(fā)明所構建的多拷貝表達載體pLT20a-gfO，是通過以Z. mobilis ZM4自身的編 碼葡萄糖_果糖氧化還原酶的全基因為模板，通過PCR反應獲得的；表1. gfo全基因核苷酸序列(SEQ ID No 1)

權利要求
一種構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，通過構建一個葡萄糖 果糖氧化還原酶表達質粒，并在運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis ZM4中將葡萄糖 果糖氧化還原酶過量表達，從而大幅度提高山梨醇生物轉化的催化效率、山梨醇產(chǎn)量以及轉化速率，所述的GFOR是指葡萄糖 果糖氧化還原酶。
2.如權利要求1所述的構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，將 來源于Z. mobilis ZM4的gfo全基因以核苷酸引物SEQ ID No 1通過PCR獲得并克隆至 pLT20a質粒中，完成表達質粒pLT20a-gfo的構建。
3.如權利要求1所述的構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，將 構建的gfo表達質粒pLT20a-gfo轉化至Z. mobilis ZM4中，從而實現(xiàn)葡萄糖-果糖氧化還 原酶過量表達。
4.如權利要求1所述的構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，通 過將過量表達的葡萄糖_果糖氧化還原酶，應用于山梨醇制備領域中。
5.如權利要求1所述的構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法，其特征在于利 用運動發(fā)酵單胞菌Z. mobilis ZM4作為質粒轉化的宿主菌，但運動發(fā)酵單胞菌只是最優(yōu)選 的菌株，還包括能夠產(chǎn)山梨醇的各種運動發(fā)酵單胞菌，以及能夠實現(xiàn)基因轉化并表達葡萄 糖-果糖氧化還原酶的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種構建GFOR過表達質粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法，以運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis ZM4)自身編碼GFOR的基因gfo，用于基因的克隆以及GFOR過量表達質粒pLT20a-gfo的構建。將構建的過量表達質粒pLT20a-gfo以接合轉化方式導入至Z.mobilis ZM4中，從而實現(xiàn)GFOR過量表達，并進而大幅度提高山梨醇生物轉化的催化效率、山梨醇產(chǎn)量以及轉化速率。本發(fā)明的優(yōu)點通過應用本發(fā)明所提供的技術，可以有效的提高利用運動發(fā)酵單胞菌進行山梨醇生物法制備的得率、反應效率以及降低反應過程中乙醇副產(chǎn)物的濃度。
文檔編號C12R1/01GK101993886SQ200910056639
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月19日 優(yōu)先權日2009年8月19日
發(fā)明者劉長俊, 董宏偉, 鮑杰 申請人:華東理工大學