本發(fā)明涉及一種反義寡核苷酸，尤其是涉及一種可調(diào)整突變型多巴脫羧酶基因序列剪接的反義寡核苷酸。
背景技術(shù)：
：芳香族l-氨基酸脫羧酶(aromaticl-aminoaciddecarboxylase，簡(jiǎn)稱aadc)為人類神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)多巴氨(dopamine)及血清素(serotonin)的合成酶。aadc的關(guān)鍵基因?yàn)槎喟兔擊让富?dopadecarboxylasegene，簡(jiǎn)稱ddc基因)，具有15個(gè)表現(xiàn)子。aadc缺乏癥屬罕見(jiàn)隱性遺傳疾病，發(fā)明人于2009年研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)臺(tái)灣的aadc缺乏癥主要為ddc基因介入子6的5端剪接位點(diǎn)下游第四個(gè)堿基(+4)由a突變?yōu)閠，簡(jiǎn)稱ivs6+4a＞t突變。ivs6+4a＞t突變繼而使得ddc基因的pre-mrna從一個(gè)錯(cuò)誤的剪接點(diǎn)(+38crypticsplicesite)剪接，使得突變的ddc基因的mrna在表現(xiàn)子6之后多插入37個(gè)堿基對(duì)的介入子6序列，因此，ivs6+4a＞t突變?cè)斐苫虍惓＜艚印７戳x寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，簡(jiǎn)稱aso)是一種人工合成的單股dna或rna分子，長(zhǎng)度約為13至45個(gè)堿基，可與互補(bǔ)的mrna雜交而抑制該mrna轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。此外，先前研究已報(bào)導(dǎo)過(guò)將不同型式的aso送入細(xì)胞中能成功地調(diào)整基因剪接異常。發(fā)展針對(duì)ddc基因的異常剪接進(jìn)行調(diào)整甚至修正的aso有助于發(fā)展治療aadc缺乏癥的藥物，而針對(duì)ivs6+4a＞t突變的ddc基因所設(shè)計(jì)的aso對(duì)臺(tái)灣aadc缺乏癥的藥物研發(fā)更是有助益。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)特定序列的aso以調(diào)整ivs6+4a＞t突變的ddc基因的剪接位置。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于實(shí)現(xiàn)一種反義寡核苷酸，其可調(diào)整ivs6+4a＞t突變的多巴脫羧酶基因剪接。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明揭露一種對(duì)突變型多巴脫羧酶基因做剪接調(diào)整的反義寡核苷酸，其序列與seqidno：1互補(bǔ)。本發(fā)明中一優(yōu)選實(shí)施例所揭露的反義寡核苷酸，其中該突變型多巴脫羧酶基因的突變型可為ivs6+4a＞t。本發(fā)明中一優(yōu)選實(shí)施例所揭露的反義寡核苷酸，其可提升ivs6+4a＞t突變細(xì)胞內(nèi)的血清素含量。本發(fā)明中一優(yōu)選實(shí)施例所揭露的反義寡核苷酸，其可調(diào)整ivs6+4a＞t突變型多巴脫羧酶基因的剪接片段分布。本發(fā)明中一優(yōu)選實(shí)施例所揭露的反義寡核苷酸，其可減少ivs6+4a＞t突變型多巴脫羧酶基因異常剪接片段。本發(fā)明中一優(yōu)選實(shí)施例所揭露的反義寡核苷酸，其序列可為seqidno：2-12或14中任一種。本發(fā)明的主要目的在于實(shí)現(xiàn)一種以反義寡核苷酸對(duì)ivs6+4a＞t突變的多巴脫羧酶基因剪接發(fā)生調(diào)整的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明揭露一種利用反義寡核苷酸調(diào)整體外ivs6+4a＞t突變細(xì)胞中的多巴脫羧酶基因剪接的方法，包含有以下步驟：加入如上述任一反義寡核苷酸至含有ivs6+4a＞t突變細(xì)胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)72小時(shí)。如此，本發(fā)明所揭露的反義寡核苷酸及方法對(duì)ivs6+4a＞t突變的多巴脫羧酶基因剪接發(fā)生調(diào)整。有關(guān)本發(fā)明的詳細(xì)特點(diǎn)，將在后續(xù)的詳細(xì)說(shuō)明中予以描述。然而，在本發(fā)明領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者應(yīng)能了解，這些詳細(xì)說(shuō)明以及實(shí)施本發(fā)明所列舉的特定實(shí)施例，僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并非用以限制本發(fā)明的專利申請(qǐng)保護(hù)范圍。附圖說(shuō)明圖1a為一代表的電泳膠照片，顯示肇因于ivs6+4a＞t突變的aadc缺乏癥病人(pt)與正常人(ct)的細(xì)胞中的mrna片段，其中標(biāo)出ddc基因的表現(xiàn)子5至8的間可能出現(xiàn)的剪接片段；圖1b為圖1a的量化結(jié)果；圖1c示意ddc基因表現(xiàn)子5至8的選擇性剪接模式(alternativesplicingpattern)；圖2a顯示aso與ddc基因互補(bǔ)的位置；圖2b為一代表的電泳膠照片，顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)aso處理后的mrna片段，其中標(biāo)出ddc基因的表現(xiàn)子5至8的間可能出現(xiàn)的剪接片段；圖2c為圖2b的量化結(jié)果；圖2d顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)aso處理后，其細(xì)胞內(nèi)的血清素的含量上升；圖3a示意aso與ddc基因互補(bǔ)的位置；圖3b為一代表的電泳膠照片，顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)不同濃度的aso處理后的mrna片段，其中標(biāo)出ddc基因的表現(xiàn)子5至8的位置；圖3c為圖3b的量化結(jié)果；圖3d為一代表的電泳膠照片，顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)不同濃度的aso處理后的mrna片段，其中標(biāo)出ddc基因的表現(xiàn)子5至8的位置；圖3e為圖3d的量化結(jié)果；圖3f為一代表的電泳膠照片，顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)aso處理后的mrna片段，其中標(biāo)出ddc基因的表現(xiàn)子5至表現(xiàn)子8的位置；圖3g為圖3f的量化結(jié)果；圖4a為一代表的照片，顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)aso處理后的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，其中標(biāo)出信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白30、40、55在西方墨點(diǎn)法轉(zhuǎn)漬膜上的位置和強(qiáng)度；圖4b為一代表的電泳膠照片，顯示ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)aso處理后的mrna片段，其中標(biāo)出ddc基因的表現(xiàn)子5至8的位置；圖4c為圖4b的量化結(jié)果；圖5a為ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞(mut)與正常細(xì)胞(ct)的ddc蛋白質(zhì)表現(xiàn)；圖5b為ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞與經(jīng)不同aso處理后的ddc蛋白質(zhì)表現(xiàn)；圖6a為ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞(mut)與正常細(xì)胞(ct)的血清素表現(xiàn)；圖6b為ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞經(jīng)不同aso處理后的血清素表現(xiàn)；圖7a為本發(fā)明各式aso對(duì)錯(cuò)誤的剪接點(diǎn)(+38crypticsplicesite)的影響示意圖；圖7b為電腦預(yù)測(cè)會(huì)影響正常ddc基因選擇性剪接模式的各種因子；圖7c為電腦預(yù)測(cè)會(huì)影響ivs6+4a＞t突變型ddc基因選擇性剪接模式的各種因子；圖8為本發(fā)明以ddc基因的介入子6為互補(bǔ)目標(biāo)所設(shè)計(jì)出的29個(gè)aso序列；圖9為本發(fā)明所揭露的所有aso序列的位置圖。具體實(shí)施方式為方便理解本發(fā)明，以下定義一些術(shù)語(yǔ)：核苷酸(nucleotide)：一單分子的去氧核醣核酸(dna)或核醣核酸(rna)，其包含一五碳醣(pentose)、一磷酸根(phosphate)及一含氮雜環(huán)堿基(nitrogenousheterocyclicbase)。該堿基鍵結(jié)該五碳醣的第一個(gè)碳原子(1端碳)，且該堿基及五碳醣的組合是一核苷(nucleoside)。包含與該五碳醣的第三個(gè)碳原子(3端位置)與第五個(gè)碳原子(5端位置)鍵結(jié)的至少一個(gè)磷酸根的一核苷是一核苷酸。該五碳醣若為去氧核醣則稱為去氧核醣核苷酸，該五碳醣若為核醣則稱為核醣核苷酸。寡核苷酸(oligonucleotide)：包含兩個(gè)以上的核苷酸，其中的一核苷酸的五碳醣的5端位置磷酸根與相鄰的核苷酸的五碳醣的3端位置磷酸根相接合形成，其優(yōu)選地超過(guò)三個(gè)，而通常超過(guò)十個(gè)，其確切長(zhǎng)度取決于許多因素，其依次依照該寡核苷酸的最佳功能或用途而定。核酸(nucleicacid)：核苷酸的一聚合物，去氧核醣核苷酸聚合為去氧核醣核酸(deoxyribonucleicacid，dna)，核醣核苷酸聚合為核醣核酸(ribonucleicacid，rna)。5端(5-prime，5’)：指相接合的核苷酸的五碳醣的第五個(gè)碳原子(5端位置)處缺少一核苷酸的一端，在該端可以有其它基，如一或多個(gè)磷酸根。3端(3-prime，3’)：指相接合的核苷酸的五碳醣的第三個(gè)碳原子(3端位置)處缺少一核苷酸的一端，在該端可以有其它基，通常是一氫氧根?；?gene)：一核酸，其核苷酸序列針對(duì)一rna及/或一多肽類(蛋白質(zhì))編碼。一基因可以是rna或dna。信使rna前體(precursormessengerrna，pre-mrna)：一種初級(jí)轉(zhuǎn)錄因子(primarytranscript)，其經(jīng)由轉(zhuǎn)錄(transcription)作用在真核細(xì)胞中以rna聚合酶(rnapolymerase)產(chǎn)生。一pre-mrna序列包含：5端非轉(zhuǎn)譯區(qū)(5’untranslatedregion)、3端非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3’untranslatedregion)、表現(xiàn)子及介入子。表現(xiàn)子(exon)：一基因轉(zhuǎn)錄因子序列的一部分或許多部分，其編碼蛋白質(zhì)可讀框(openreadingframe)。介入子(intron)：一基因轉(zhuǎn)錄因子序列的一部分或多個(gè)部分，其編碼非蛋白質(zhì)可讀框，介入子的5端為5端剪接位點(diǎn)(5’splicedonorsite)，介入子的3端為3端剪接位點(diǎn)(3’spliceacceptorsite)。信使核醣核酸(messengerrna，mrna)：pre-mrna表現(xiàn)子的組合，其在細(xì)胞核內(nèi)剪接結(jié)構(gòu)除去介入子之后形成，并作為用于蛋白質(zhì)合成的一蛋白質(zhì)編碼rna。反義(antisense，負(fù)鏈)：當(dāng)轉(zhuǎn)錄作用進(jìn)行時(shí)，雙股dna中會(huì)被rna聚合酶當(dāng)作模板的一股即為正鏈(sensestrand或sensenucleicacid，有義股)，其序列與轉(zhuǎn)錄出的mrna互補(bǔ)。而與sensestrand互補(bǔ)的一股則為負(fù)鏈(antisensestrand或antisensenucleicacid，反義)。反義寡核苷酸可為一種dna或rna片段，與pre-mrna或mrna互補(bǔ)?；パa(bǔ)(complemetary)：一寡核苷酸或一核酸的堿基排序(一序列的核苷酸)與另一寡核苷酸或另一核酸的堿基排序(另一序列的核苷酸)依堿基對(duì)原則(base-pairingrule)，則稱該二寡核苷酸或該二核酸互補(bǔ)。例如：序列“a-g-t”與序列“t-c-a”及“t-c-u”互補(bǔ)?；パa(bǔ)可以在一股寡核苷酸與一股核酸之間、兩股dna之間、一股dna與一股rna之間、或是在兩股rna之間。雜交(hybridization)：一條單股的核酸或寡核苷酸與另一條單股且互補(bǔ)的核酸或寡核苷酸組合成一雙股分子的過(guò)程。剪接(splicing)：經(jīng)轉(zhuǎn)錄作用形成的pre-mrna變成mrna的過(guò)程之一，即將pre-mrna中的介入子移除及合并表現(xiàn)子。剪接還分為分子內(nèi)剪接(cissplicing)以及分子間剪接(transsplicing)。選擇性剪接(alternativesplicing)：一個(gè)由dna經(jīng)轉(zhuǎn)錄作用后的pre-mrna能藉由多種選擇性剪接產(chǎn)生不同序列的mrna，即產(chǎn)生各種剪接片段，各種剪接片段再經(jīng)由轉(zhuǎn)譯作用產(chǎn)生多種相似卻又獨(dú)特的蛋白質(zhì)。異常的剪接片段：若一mrna序列與正常細(xì)胞中所出現(xiàn)的mrna序列不同，稱為異常的剪接片段。調(diào)整基因的剪接片段：加入細(xì)胞中的反義寡核苷酸若與互補(bǔ)的pre-mrna鍵結(jié)，則將影響pre-mrna剪接，產(chǎn)生與平常不同的剪接片段，或是產(chǎn)生種類相同但數(shù)量與平常不同的剪接片段。上述情況稱為該反義寡核苷酸能調(diào)整該基因的剪接片段。血清素(serotonin)：又稱5-羥色氨酸(簡(jiǎn)稱為5-ht)，為一種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，由5-hydroxytryptophan經(jīng)芳香族l-氨基酸脫羧酶(aadc)轉(zhuǎn)化為血清素，因此血清素可做為l-氨基酸脫羧酶正常表現(xiàn)的檢測(cè)指標(biāo)。以下說(shuō)明本發(fā)明相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法，其中mrna片段的含量相較于細(xì)胞中所有的mrna含量且以百分比表示。由于傳統(tǒng)的aso進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被核酸內(nèi)切酶(endonucleases)或核酸外切酶(exonucleases)迅速地分解，因此本發(fā)明以嗎啉基aso(morpholinoaso)取代傳統(tǒng)的aso。嗎啉基aso即是以嗎啉環(huán)(morpholinering)取代傳統(tǒng)aso的六碳環(huán)(deoxyribosoering)結(jié)構(gòu)。嗎啉基aso結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定且擁有更佳的效率與專一性。實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用的人類淋巴母細(xì)胞(humanlymphoblastoidcells)分離自正常人及肇因于ivs6+4a＞t突變型的aadc缺乏癥病人的同型合子(homozygousivs6+4a＞tcells)，并培養(yǎng)在含有20％胎牛血清、100units/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及0.25μg/ml兩性霉素b(amphotericinb)的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)的溫度為37℃，二氧化碳為5％的大氣壓。所有培養(yǎng)液及化學(xué)物質(zhì)購(gòu)自hyclone(gehealthcarelifesciences，logan，ut，usa)。實(shí)驗(yàn)二：反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染(transfect)細(xì)胞取8x106細(xì)胞/ml與10-30μm的aso共同培養(yǎng)在含有胎牛血清的rpmi-1640中72小時(shí)，其中aso以8μmendoporter(genetool，philomath，or，usa)攜帶。本發(fā)明所使用到的aso如以下表所示：名稱序列seqidnoaso-dttggccaggagccacaagtgctgcc2aso-kcaccttattggccaggagccacaag3aso-rggagtttcaccttattggccaggag4aso-wgagacggagtttcaccttattggcc5aso-aaagtagagacggagtttcaccttatt6aso-6astgtggaattgacttgaattgacaaa7aso-6aegccatgtcagttcttccacattaca8aso-9aacaccatgcccggctaattttttttt9aso-6eccgctttgtctctctccagggcttc10aso-6sacaagtgctgccgaacatacaaaga11tb30gctcgtccgcccagcccgacatc12tb40cgatgaatacccgacagccactcat13tb55acccaagggctggttgtcgaacggc14實(shí)驗(yàn)三：分離rna及對(duì)ddcmrna做定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction，簡(jiǎn)稱定量rt-pcr)培養(yǎng)細(xì)胞中所有的rna皆由trireagent(molecularresearchcenter，ohio，usa)萃取出來(lái)，再?gòu)闹腥〕?00ngrna進(jìn)行定量rt-pcr(superscriptiii，invitrogenco.，carlsbad，ca，usa)，其中ddcmrna表現(xiàn)子5至8將被增量。增量的設(shè)定簡(jiǎn)述如下：rt步驟以55℃持續(xù)60分鐘，接著的pcr步驟由95℃持續(xù)30秒、60℃持續(xù)30秒及72℃持續(xù)50秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。定量rt-pcr的產(chǎn)物以2％瓊脂糖凝膠分離，續(xù)以凝膠綠染劑(gelgreen，biotium，inc.hayward，ca，usa)染色，最后以藍(lán)光燈箱觀察。亮帶的光強(qiáng)度以低量dna梯度(lowdnamassladder，invitrogen)校正并以影像分析軟件(alphaview，proteinsimple，sanjose，ca，usa)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)四：蛋白質(zhì)分離及免疫印跡分析(westernblotanalysis)從經(jīng)aso處理過(guò)的細(xì)胞中萃取三種絲氨酸/精氨酸豐富蛋白質(zhì)(ser/arg-richprotein，簡(jiǎn)稱sr蛋白質(zhì))，分別為srp30c、srp40及srp55。取40μg的細(xì)胞均質(zhì)(homogenate)與等量的2倍標(biāo)準(zhǔn)sds樣本緩沖溶液混合，并在電泳前煮沸10分鐘。2倍標(biāo)準(zhǔn)sds樣本緩沖溶液包含125mmtris-hcl(ph6.8)，4％十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，sds)，20％甘油，10％β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)及0.25％溴酚藍(lán)。蛋白質(zhì)以12％sds-page分離并使用轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜片上。膜片接著依照順序以阻隔溶液處理，續(xù)經(jīng)適當(dāng)稀釋的sr蛋白質(zhì)抗體(srp30c抗體購(gòu)自proteintechgroup，manchester，uk、srp40抗體購(gòu)自mbl，nagoya，japan、srp55抗體購(gòu)自santacruzbiotechnology，texas)處理，之后再經(jīng)igg抗體(goatanti-rabbitigg(h+l)polyclonalantibodyconjugatedtoperoxidase，jackson，pa，usa)處理。接著膜片經(jīng)過(guò)清洗之后，蛋白質(zhì)的免疫活性以immobilonwesternhrpsubstrate(emdmillipore，darmstadt，germany)觀察，并以imagequantlas4000(gehealthcare，bucks，uk)記錄。阻隔溶液為具有5％脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖生理食鹽水。實(shí)驗(yàn)五：血清素含量測(cè)定依照廠商建議的實(shí)驗(yàn)流程，利用酵素免疫分析系統(tǒng)(serotoninhighsentivityelisa，ibl，germany)測(cè)定細(xì)胞中的血清素含量。以免疫沉淀溶解緩沖液(immunoprecipitationlysisbuffer)采集并且萃取細(xì)胞后，取出上清液進(jìn)行elisa分析。依照廠商的建議，使用非線性回歸模型進(jìn)行曲線擬合(curvefitting)。最后，利用雙尾學(xué)生t測(cè)試(two-tailedstudent’st-test)比較aso處理后的細(xì)胞與控制組中以雜燴寡核苷酸處理處理后的細(xì)胞當(dāng)中血清素的表現(xiàn)濃度。實(shí)驗(yàn)六：ddc蛋白質(zhì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ddc蛋白質(zhì)濃度是使用接近延伸檢測(cè)技術(shù)(proximityextensionassay，pea)，利用proseek檢測(cè)套組(proseekassaydevelopmentkit，olinkbioscience，sweden)以及廠商建議的實(shí)驗(yàn)流程來(lái)進(jìn)行。以免疫沉淀溶解緩沖液采集并且萃取細(xì)胞后，取出上清液進(jìn)行pea分析。寡核酸a和寡核酸b嵌合在多株人類ddc抗體(r&dsystems，usa)，分別創(chuàng)造出ddc蛋白質(zhì)的proseak探針a和探針b。然后，將proseek探針a和b在分析溶液中混合，以準(zhǔn)備探針混合溶液(probemastermixture)。接著將3μl探針混合溶液和13μl細(xì)胞萃取液置入反應(yīng)管中，在室溫下培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。接著在探針延長(zhǎng)步驟中，將反應(yīng)管放置在已經(jīng)預(yù)熱的pcr反應(yīng)器，于37℃培養(yǎng)5分鐘，再將76μl預(yù)延長(zhǎng)混合液(pre-extentionmastermixture)加入并且在37℃培養(yǎng)5分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，加入20μl含有延長(zhǎng)合成酶的延長(zhǎng)混合液(extentionmastermixture)，在37℃培養(yǎng)20分鐘進(jìn)行合成步驟，接著在85℃下培養(yǎng)10分鐘來(lái)去除延長(zhǎng)合成酵素的活性。最后，使用rotorgene6000(cobettresearch，australia)以下列條件進(jìn)行即時(shí)pcr，95℃下5分鐘進(jìn)行1循環(huán)，接著95℃下15秒和60℃1分鐘進(jìn)行45循環(huán)。實(shí)驗(yàn)七：電腦模擬潛在的基因剪接調(diào)節(jié)因子以spliceaid(http：//www.in-troni.it/splicing.html)，esrsearch(http：//ibis.tau.ac.il/ssat/esr.htm)及esefinders(http：//rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ese3/esefinder.cgi？process＝home)預(yù)測(cè)。剪接調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)強(qiáng)度則是以maxentscan(http：//genes.mit.edu/burgelab/maxent/xmaxentscan_scoreseq.html)預(yù)測(cè)。結(jié)果一：正常人與ivs6+4a＞t突變型aadc缺乏癥病人在分離淋巴細(xì)胞中的表現(xiàn)模式首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)一取得正常人的淋巴母細(xì)胞(正常細(xì)胞ctl-ct3)及肇因于ivs6+4a＞t突變型的aadc缺乏癥病人的淋巴母細(xì)胞(ptl-pt3)，接著進(jìn)行實(shí)驗(yàn)三分析兩種細(xì)胞中的ddc基因剪接片段分布。請(qǐng)見(jiàn)圖1a、圖1b，正常細(xì)胞中的ddc基因以剪接片段5-6-7-8所占比例最多，其他還有包含較少量的一新穎表現(xiàn)子6a的片段5-6-6a-7-8，及片段5-7-8。而ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞中的ddc基因以剪接片段5-7-8所占比例為大宗，其他則是包含了在表現(xiàn)子6之后多出的一段長(zhǎng)37個(gè)核苷酸的異常片段(5-6+37-7-8及5-6+37-6a-7-8)。需注意的是，剪接片段5-7-8代表基因剪接跳過(guò)表現(xiàn)子6+37或表現(xiàn)子6，此外，正常細(xì)胞中也含有片段5-7-8，只是所占比例低于11％。圖1c是根據(jù)圖1b的結(jié)果歸納出ddc基因的選擇性剪接模式(alternativesplicingpattern)示意圖，圖中的斜線連接ddc基因剪接后的mrna片段，斜線越粗代表以此方式剪接的機(jī)率越大。結(jié)果二：asos修正ivs6+4a＞t突變型aadc缺乏癥病人在淋巴細(xì)胞中的基因剪接異常本發(fā)明所設(shè)計(jì)的aso長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸序列長(zhǎng)度，購(gòu)自genetools(philomath，or，usa)。一共有四類aso。第一類aso的互補(bǔ)目標(biāo)為ddc基因的介入子6，設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列由介入子6的5端剪接位點(diǎn)(即表現(xiàn)子6與介入子6的交界處)開(kāi)始，逐一向下游移動(dòng)直到包含ivs6+4a＞t突變型ddc基因的錯(cuò)誤的剪接點(diǎn)(+38crypticsplicesite)，設(shè)計(jì)并考量aso與互補(bǔ)目標(biāo)的結(jié)合能(aso-targetingbindingenergy)、解鏈溫度(meltingtemperature，tm)及rna的二級(jí)結(jié)構(gòu)。共有29個(gè)適合的aso，代號(hào)為a-2、a-1、a～z、aa，其詳細(xì)的序列請(qǐng)見(jiàn)圖8。此外，本發(fā)明還利用一種長(zhǎng)度相同、載體相同，但隨機(jī)序列的寡核苷酸做為控制組(scr)，以驗(yàn)證aso的功效。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)一制備實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞，再由上述29個(gè)aso挑選其中5個(gè)(aso-d、aso-k、aso-r、aso-w、aso-aa)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)二、三以證明其調(diào)整ivs6+4a＞t突變型ddc基因剪接的功效，上述5種aso與ddc基因互補(bǔ)的位置請(qǐng)見(jiàn)圖2a。將上述5種濃度為30μm的aso轉(zhuǎn)染入ivs6+4a＞t突變細(xì)胞并培養(yǎng)72小時(shí)。由定量rt-pcr后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種aso都能使ivs6+4a＞t突變細(xì)胞中出現(xiàn)數(shù)量不一的正常剪接片段(第2b、2c圖中的5-6-7-8)。由十個(gè)獨(dú)立的重復(fù)操作歸納出這5種aso的校正潛力(restorationpotential)，即正常剪接片段百分比除以異常剪接片段(5-6+37-7-8)百分比。aso-aa將正常剪接片段由0％增加為7％，異常剪接片段僅剩3.5％，因此校正潛力為2∶1。aso-w將正常剪接片段增加為13％，異常剪接片段僅剩3％，因此校正潛力為4.3∶1。aso-r將正常剪接片段增加為24％，異常剪接片段僅剩8％，因此校正潛力為3∶1。aso-k將正常剪接片段增加為12％，異常剪接片段為18％，因此校正潛力為0.7∶1。aso-d將正常剪接片段增加為41％，而完全沒(méi)有異常剪接片段(5-6+37-7-8)出現(xiàn)，因此，aso-d修正了ivs6+4a＞t突變型ddc基因的異常剪接。不過(guò)，aso-d使得另外二種新穎卻是異常的剪接片段出現(xiàn)，片段5-6+37-6a-6b-7-8出現(xiàn)7.81％及片段5-6+37-6a′-6b’-7-8出現(xiàn)3.6％。除此之外，aso-d及aso-r相較于控制組還能減少剪接片段5-7-8的比例，其中，aso-r減少剪接片段5-7-8至49％，aso-d減少剪接片段5-7-8至38％。因此，上述aso-daso-k、aso-r、aso-w、aso-aa均能修正異常片段5-6+37-7-8，產(chǎn)生出正常的剪接片段5-6-7-8，并且能夠減少片段5-7-8。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)五測(cè)量ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞中的血清素發(fā)現(xiàn)，請(qǐng)見(jiàn)圖2d，經(jīng)過(guò)上述5種aso轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，與控制組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相較，具有較多的血清素，說(shuō)明了本發(fā)明所設(shè)計(jì)的第一類aso能藉由修正ddc基因剪接異常，改善血清素生成不足的問(wèn)題。結(jié)果三：阻斷表現(xiàn)子6a增加ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞中5-6+3-7-8片段的表現(xiàn)量基于以上結(jié)果，本發(fā)明設(shè)計(jì)第二類aso其雜交目標(biāo)為新穎表現(xiàn)子6a。請(qǐng)見(jiàn)圖3a，aso-6as與包含介入子6的5端剪接位點(diǎn)(5’splicedonorsite)互補(bǔ)。aso-6ae與包含介入子6的5端剪接位點(diǎn)的下游潛在剪接促進(jìn)區(qū)(exonicsplicingenhancers，eses)互補(bǔ)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)一至三后結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖3b、圖3c，發(fā)現(xiàn)10μm、20μm、30μm的aso-6as及aso-6ae皆減少片段5-6+37-6a-7-8，且濃度越高減少得越顯著。相較于10μm的aso-6as(6as10)的5-6+37-6a-7-8片段的比例為34％，30μm的aso-6as(6as30)將5-6+37-6a-7-8片段的比例降至1.3％。相較于10μm的aso-6ae(6ae10)，30μm的aso-6ae(6ae30)將5-6+37-6a-7-8片段的比例由18％降至0％。但aso-6as及aso-6ae卻使得異常片段5-6+37-7-8增加，例如，10μm的aso-6as(6as10)的5-6+37-7-8片段為30％，30μm的aso-6as(6as30)的5-6+37-7-8片段增至77％。10μm的aso-6ae(6ae10)的5-6+37-7-8片段為10％，30μm的aso-6ae(6ae30)的5-6+37-7-8片段增至64％。此外，aso-6as及aso-6ae能使得片段5-7-8減少，例如，aso-6as的5-7-8片段由37％減少至13％，aso-6ae的5-7-8片段由60％減少至31％。結(jié)果四：利用aso阻斷找出調(diào)控表現(xiàn)子6+37片段的異常剪接本發(fā)明設(shè)計(jì)第三類aso其雜交目標(biāo)為突變的表現(xiàn)子6+37片段。請(qǐng)見(jiàn)圖3a，aso-6s以包含正常的介入子6的5端剪接位點(diǎn)為雜交目標(biāo)，aso-6e以包含表現(xiàn)子6中電腦預(yù)測(cè)的eses結(jié)合區(qū)為雜交目標(biāo)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)一至三后結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖3d、圖3e，兩種aso都使異常片段5-6+37-7-8減少，并使片段5-7-8增多。例如，10μmaso-6e(6e10)的異常片段5-6+37-7-8為31％，片段5-7-8為68％，而30μmaso-6e(6e30)使異常片段5-6+37-7-8減少至2.4％，使5-7-8增多至86％，但出現(xiàn)了12％的片段5-6+37-6a-7-8。同樣的，比較10μm與30μm，aso-6s使5-6+37-7-8由27％減少至0％，使5-7-8由64％增多至90％，但5-6+37-6a-7-8由8％增加至11％。本發(fā)明還針對(duì)ivs6+4a＞t突變型ddc基因的錯(cuò)誤的剪接點(diǎn)(+38crypticsplicesite)的下游處的剪接抑制區(qū)(exonicsplicingsilencer，ess)為雜交目標(biāo)，設(shè)計(jì)出一aso-9aa。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)一至三后結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖3f、圖3g，與控制組(scr)相較，30μm的aso-9aa能使片段5-7-8由43％降為3％，能使片段5-6+37-7-8由11％增為37％，也使片段5-6+37-6a-7-8由45％增為59％。結(jié)果五：sr蛋白質(zhì)srp30c和srp55調(diào)控表現(xiàn)子6+37片段的異常剪接本發(fā)明設(shè)計(jì)第四類aso是針對(duì)基因剪接的外部因子(trans-actingfactors)進(jìn)行轉(zhuǎn)譯阻斷(translationblocking，tb)，用以剔除(knockdown)sr蛋白質(zhì)。分別針對(duì)srp30c、srp40及srp55的mrna設(shè)計(jì)與之互補(bǔ)的阻擋aso，簡(jiǎn)稱為tb30、tb40及tb55。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)一至四后結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖4a，與未經(jīng)阻擋aso處理的ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞(ct)相較，30μm的tb30、tb40及tb55分別使得ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞中的srp30c、srp40及srp55被剔除了50％，細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白(actin)作為不受tb30、tb40及tb55影響的參照。請(qǐng)見(jiàn)圖4b、圖4c，與控制組(scr)相較，經(jīng)tb30處理的ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞的片段5-6+37-7-8由23％降為7.4％、片段5-7-8由64％增為89％。經(jīng)tb55處里的ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞的片段5-6+37-7-8由23％降為9％、片段5-7-8由64％增為90％。而經(jīng)tb40處里后各片段的比例大致不變。結(jié)果六：ivs6+4a＞t突變型aadc缺乏癥病人在淋巴細(xì)胞中的ddc蛋白質(zhì)與血清素在asos處理后增加為了驗(yàn)證aso處理后能夠有效增加ddc蛋白質(zhì)的含量及其活性，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)五、六來(lái)測(cè)定ddc蛋白質(zhì)以及下游產(chǎn)物血清素的濃度。圖5a所示，相較于ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞(257.4pg/ml)，正常的淋巴細(xì)胞含有高濃度的ddc蛋白質(zhì)(18861.7pg/ml)。如圖5b所示，相較于控制組(17.1pg/ml)的ddc蛋白質(zhì)量，經(jīng)過(guò)aso-d、aso-k、aso-r、aso-w或aso-aa處理之后，分別提升至252.8、154.4、335.4、151.5和69.4pg/ml。血清素的含量利用elisa分析來(lái)測(cè)定，結(jié)果如圖6a所示，正常淋巴細(xì)胞內(nèi)的血清素含量(4.108±0.096pg/105細(xì)胞)顯著高于未處理的ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞(2.133±0.164pg/105細(xì)胞)(p＜0.001)。然而，以asos轉(zhuǎn)染ivs6+4a＞t突變型細(xì)胞造成血清素含量的顯著增加。相較于控制組(1.453±0.018pg/105細(xì)胞)的血清素含量，以aso-d、aso-k、aso-r、aso-w或aso-aa處理之后，血清素含量分別增加至1.588±0.042、1.575±0.011、1.612±0.015、1.528±0.009和1.614±0.014pg/105細(xì)胞(各個(gè)p＜0.001)。結(jié)果七：電腦預(yù)測(cè)剪接調(diào)控蛋白(spliceregulatoryproteins)與ddc基因結(jié)合的位置及強(qiáng)度為了要了解被剔除的sr蛋白質(zhì)在ddc基因上結(jié)合的位置，接下來(lái)進(jìn)行電腦預(yù)測(cè)剪接調(diào)控蛋白(spliceregulatoryproteins)與ddc基因結(jié)合的位置及強(qiáng)度，sr蛋白質(zhì)即為一種剪接調(diào)控蛋白。圖7b、圖7c中的彩色柱狀的位置代表與ddc基因結(jié)合的位置，彩色柱狀的高度代表結(jié)合的強(qiáng)度，朝上的彩色柱狀代表促進(jìn)剪接，朝下的彩色柱狀代表抑制剪接。圖7b以正常的ddc基因預(yù)測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)除了srp30c、srp55，還有一種小核醣核蛋白質(zhì)u1snrnp會(huì)結(jié)合在介入子6的5端剪接位點(diǎn)幫助正?；蚣艚?。圖7c以ivs6+4a＞t突變型ddc基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)u1snrnp已不再原本的結(jié)合位置，而是結(jié)合在錯(cuò)誤的剪接點(diǎn)(+38crypticsplicesite)。srp30c及srp55會(huì)結(jié)合在介入子6的5端剪接位點(diǎn)附近，最遠(yuǎn)結(jié)合在介入子6的5端剪接位點(diǎn)朝下游-45處，也就是在表現(xiàn)子6的5端往上游+20處(圖中的20)。黑色的橫條代表其他的aso結(jié)合在ivs6+4a＞t突變型ddc基因的位置，例如aso-6e結(jié)合的位置也是某一類sr蛋白質(zhì)(圖中具有問(wèn)號(hào)的藍(lán)色橢圓形)結(jié)合的位置，aso-6e調(diào)整剪接的功效可能來(lái)自于阻擋該類sr蛋白質(zhì)的運(yùn)作。又例如aso-6s及aso-d結(jié)合的位置也是srp30c及srp55結(jié)合的位置，aso-6s、aso-d調(diào)整剪接的功效可能來(lái)自于阻擋srp30c及srp55的運(yùn)作。值得注意的是，aso-9aa可能阻擋了許多抑制的剪接調(diào)控蛋白(圖中具有問(wèn)號(hào)的黃色橢圓形)，這些抑制的剪接調(diào)控蛋白結(jié)合在ivs6+4a＞t突變型ddc基因介入子6的5端剪接位點(diǎn)往上游+65至+86處(圖中的149至170)。如圖9所示，有鑒于本發(fā)明設(shè)計(jì)的aso涵蓋了ivs6+4a＞t突變型ddc基因介入子6的5端剪接位點(diǎn)往上游+324至下游-45之間(seqidno：1)，任一aso可與ivs6+4a＞t突變型介入子6的5端剪接位點(diǎn)往上游+324至下游-45的間(seqidno：1)雜交，即可以阻擋剪接調(diào)控蛋白的運(yùn)作，也就具有調(diào)整剪接的功效。總結(jié)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了四類aso以調(diào)整ivs6+4a＞t突變型ddc基因的剪接，所有揭露的aso位置與序列如圖9所示。請(qǐng)一并參照?qǐng)D7a和圖9所示，第一類aso包含aso-a至aso-aa與aso-9aa，其互補(bǔ)序列為ddc基因介入子6的5端剪接位點(diǎn)往下游+4至+84。第二類aso包含aso-6as和aso-6ae，其雜交目標(biāo)為包含新穎表現(xiàn)子6a(圖中未示出)。第三類aso以aso-6e、aso-6s為代表，其雜交目標(biāo)為包含表現(xiàn)子6+37片段。第四類aso以tb30、tb55為代表，其互補(bǔ)序列為sr蛋白質(zhì)30c、sr蛋白質(zhì)55的mrna，圖7a中的箭號(hào)表示該aso對(duì)錯(cuò)誤的剪接點(diǎn)(+38crypticsplicesite)利用的機(jī)率，箭號(hào)往上代表促進(jìn)利用，箭號(hào)往下代表抑制利用。以電腦預(yù)測(cè)能調(diào)整基因剪接的蛋白質(zhì)與正常ddc基因(圖7b)互相雜交的位置，及與ivs6+4a＞t突變型ddc基因(圖7c)互相雜交的位置，可以發(fā)現(xiàn)受第四類aso剔除的sr蛋白質(zhì)可與表現(xiàn)子6至介入子6之間結(jié)合，佐以第二類aso的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以知道若是表現(xiàn)子7之前還具有一新穎表現(xiàn)子6a，則本發(fā)明設(shè)計(jì)的aso也能針對(duì)該新穎表現(xiàn)子6a做剪接調(diào)整。因此，本發(fā)明可調(diào)整ivs6+4a＞t突變型ddc基因剪接的aso與ivs6+4a＞t突變型介入子6的5端剪接位點(diǎn)往上游+324至下游-45之間的序列(seqidno：1)互補(bǔ)。在此必須說(shuō)明的是，以上配合附圖所作的詳細(xì)描述，僅是為了說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及特征而提供的一實(shí)施方式，凡在本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有一般通常知識(shí)的人，在了解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及特征之后，在不違背本發(fā)明的精神下，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12