一種木聚糖酶TlXynA的突變基因TlXynA_3及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種木聚糖酶TlXynA的突變基因TlXynA_3，所述基因的突變位點為R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還公開了所述基因在制備木聚糖酶中的應(yīng)用。實驗證明，這種基因所編碼的突變木聚糖酶活性可達到3897IU/mg，是野生型酶的107％；在外加鹽濃度為4M時相對酶活性是野生型酶的1.92倍。預(yù)示該突變木聚糖酶具有耐高溫、耐鹽的特性，在飼料、食品、造紙、醫(yī)藥、能源等工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種木聚糖酶τ I XynA的突變基因 TI XynA_3及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3& 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖是繼纖維素后最豐富的植物細胞壁多糖，占地球上生物質(zhì)資源總量的1/3。 其主鏈骨架由木糖通過β-l，4糖苷鍵連接而成，而側(cè)鏈包括多種官能團，如葡萄糖醛酸、阿 魏酸、阿拉伯糖、乙酰基等。這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致木聚糖的降解需要多種酶系共同作用。其 中的關(guān)鍵酶是內(nèi)切β-l，4-木聚糖酶，可以通過水解β-l，4-糖苷鍵來進行主鏈的降解，把木 聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟竟烟?。?008年，木寡糖已被中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新功能性食品，它安全、高效、 穩(wěn)定，在食品、飼料、造紙、醫(yī)藥、能源等領(lǐng)域具有廣闊的前景。
[0003] 來自疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的木聚糖酶XynA(TlXynA)是 一種良好的工業(yè)用酶。它專一性地識別木聚糖底物；熱穩(wěn)定性強，最適溫度在65°C以上，在 80°C下孵育40min后仍保持60%的酶活(Damaso et al. ,2003);可以耐受廣泛的pH;酶活性 可高達4000IU/mg(Singh et al.JOOShTIXynA可以用不同宿主進行異源表達，例如用畢 赤酵母(Pichia pastoris)異源表達時，產(chǎn)量可以達到1.2g/L(Mellitzer et al. ,2012)。 因此，TIXynA是一種理想的工業(yè)用酶，可以用作烘焙劑、紙漿漂白劑、飼料添加劑、燃料乙醇 生產(chǎn)時的底物處理劑等。但是，在TIXynA的實際應(yīng)用中，仍存在著亟待解決的問題。例如工 業(yè)生產(chǎn)中的很多步驟往往是在高鹽濃度、存在胰蛋白酶的環(huán)境中進行的，這往往會限制 TIXynA將最適條件下的高酶活性發(fā)揮出來。為了擴展TIXynA的工業(yè)應(yīng)用，提高其耐高溫、耐 鹽、耐胰蛋白酶酶解等性質(zhì)是一個很關(guān)鍵的任務(wù)，然而，經(jīng)檢索，還未見關(guān)于TIXynA耐鹽、耐 胰蛋白酶酶解等性質(zhì)和其相關(guān)突變基因的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3,其特征在于:所述基因的突變 位點為R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 本發(fā)明所述木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3表達的木聚糖酶，其特征在于： 所述酶命名為TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0007] 本發(fā)明所述木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3在制備木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T 中的應(yīng)用。
[0008] 含有木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3的重組載體PET28a-TlXynA-R116QR161QR187SK119T 的構(gòu)建及木聚糖酶 TlXynA-R116QR161QR187SK119T 的表達及純化。 [0009] 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取木聚糖酶TIXynA基因，將TIXynA基因和質(zhì)粒pET28a連接，獲 得pET28a-TlXynA質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示;直接對質(zhì)粒進行定點突變，引入 R116Q、R161Q、R187S和K119T四個突變位點；將上述突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細 胞，篩選并測序鑒定陽性重組載體，提取質(zhì)粒，即得到含有木聚糖酶突變基因 TlXynA_3的重 組載體pET28a-TlXynA-Rl 16QR161QR187SK119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO· 4所示。
[0010] 將前述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細胞，即獲得含有重組載體的重 組工程菌株。
[0011] 將獲得的含有重組載體的重組工程菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37±2°C，200 ± lOrpm條件發(fā)酵培養(yǎng)至0D_ = 0 · 6-0 · 8;用終濃度為0 · 5mM的IPTG于20 °C，200rpm條件培養(yǎng) 20 ± 2h，誘導(dǎo)表達得到木聚糖酶TIXynA-Rl 16QR161QR187SK119T;離心并收集菌體，破碎菌 體取上清，將上清液中的蛋白用鎳柱進行純化。
[0012] 本發(fā)明所述的木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T在制備耐高溫耐鹽工業(yè)酶 制劑中的應(yīng)用。
[0013] 實驗證實：利用本發(fā)明所述的木聚糖酶突變基因 TlXynA_3制備得到的木聚糖酶 TlXynA-R116QR161QR187SK119T作為飼料添加劑、造紙漂白劑、烘焙劑等工業(yè)用酶時能在更 廣泛的環(huán)境中保持較高活性，具體應(yīng)用包括但不僅限于:在飼料工業(yè)中，此突變木聚糖酶可 以作為飼料添加劑，在動物消化系統(tǒng)中發(fā)揮作用，增加動物對飼料的消化和吸收;在造紙工 業(yè)中，此突變木聚糖酶可以用來替代氯化物進行底物漂白處理，能夠改善紙張白度和質(zhì)量， 減少環(huán)境污染;在食品工業(yè)中，此突變木聚糖酶可以作為釀酒時采用的添加劑，降低啤酒黏 度，提高澄清度，還可以獲得含有特定組成的寡糖，增加餅干的口感;在能源工業(yè)中，此突變 木聚糖酶可以和纖維素酶共同作用降解被酸和離子溶液處理過的木質(zhì)纖維素，更高效地產(chǎn) 生乙醇等清潔能源。預(yù)示其具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0014] 本發(fā)明具有的有益效果是：
[0015] (1)本發(fā)明提供的將突變木聚糖酶異源表達和純化的方法可以有效保持目的蛋白 的高表達量，方法簡便實用。
[0016] (2)本發(fā)明中木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3所編碼的突變木聚糖酶 TIXynA-Rl 16QR161QR187SK119T具有高酶活性，可達到3897IU/mg，是現(xiàn)有野生型木聚糖酶 TIXynA 活性的 107 %。
[0017] (3)本發(fā)明中木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3所編碼的突變木聚糖酶 TlXynA-R116QR161QR187SK119T具有耐鹽性，在外加鹽濃度為1M到5M時，其相對酶活性分別 是野生型木聚糖酶TIXynA的1.36、1.62、1.76、1.92和1.77倍。
[0018] (3)本發(fā)明中木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3所編碼的突變木聚糖酶 TlXynA-R116QR161QR187SK119T具有耐高溫、耐鹽、耐胰蛋白酶酶解的特性，在造紙、飼料、 食品、醫(yī)藥、能源等工業(yè)領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實施例3中TlXynA-R116QR161QR187SK119T蛋白表達的SDS-PAGE結(jié)果 圖，其中Μ為Unstained Protein Marker(Thermo Scientific，MA，USA)，l_7為突變木聚糖 酶TIXynA-Rl16QR161QR187SK119T。
[0020] 圖2為本發(fā)明實驗例1中TlXynA-R116QR161QR187SK119T與TIXynA在不同鹽濃度下 的相對酶活性圖，其中WT為TlXynA，M3為TlXynA-R116QR161QR187SK119T。
[0021] 圖3為本發(fā)明實驗例1中TlXynA-R116QR161QR187SK119T與TIXynA在外加鹽濃度為 0時的酶活性比較圖，其中WT為TlXynA，M3為TlXynA-R116QR161QR187SK119T。
【具體實施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明保護內(nèi)容做進一步的闡述，但所述實例并不是對 本發(fā)明保護內(nèi)容的限制。
[0023] 實施例1:
[0024]構(gòu)建含有木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3的重組載體，具體步驟如下：
[0025] (1)從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取木聚糖酶TIXynA基因，將TIXynA基因和質(zhì)粒pET28a連接， 獲得pET28a-TlXynA質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。以上述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計 突變引物，進行定點突變，引物序列如下：
[0027] PCR擴增反應(yīng)體系如下：
[0029] 反應(yīng)程序如下：
[0031] (2)取3yL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，留下條帶清晰的反應(yīng)產(chǎn)物。用Dpnl 限制酶對產(chǎn)物中消化野生型的質(zhì)粒進行消化，確保之后步驟中的轉(zhuǎn)化子均為突變型。消化 體系如下表，將體系充分混合，于37 °C水浴反應(yīng)15min;
[0033] (3)將消化后的PCR產(chǎn)物進行純化，實驗步驟參照北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任 公司GV-High-Efficiency DNA Fragments Purification Kit;
[0034] (4)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞：
[0035] 將10yL已純化的上述突變質(zhì)粒加入50yL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，冰浴30min;42 °C熱擊90s;冰浴2min，加 lmL液體LB，37 °C搖床中培養(yǎng)1-1.5h; 8000rpm離心2min，棄上清（留 少許底部液體）。將剩余溶液涂布到含50yg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C過夜倒置培養(yǎng);次 日挑取單克隆，接種在5mL含50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C 200rpm過夜培養(yǎng)；
[0036] (5)提取質(zhì)粒，實驗步驟參照北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司GV-Plasmid DNA Mini Extraction Kit；
[0037] (6)取3yL質(zhì)粒進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，留下條帶清晰的質(zhì)粒；
[0038] (7)取10yL質(zhì)粒溶液于滅菌EP管中進行測序。比對測序結(jié)果和原始序列，確認定點 突變是否成功。測序正確的質(zhì)粒即為含有木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3的重組載體 pET28a-TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0039] 實施例2:
[0040] 構(gòu)建含有上述突變基因 TlXynA_3的重組工程菌，具體步驟如下：
[0041 ] 將2yL測序正確的上述突變質(zhì)粒加入50yL大腸桿菌BL-21感受態(tài)細胞，冰浴30min; 42°C熱擊90s;冰浴2min，加入lmL液體LB，37 °C搖床中培養(yǎng)1-1.5h; 8000rpm離心2min，棄上 清（留少許底部液體）。將剩余溶液涂布到含50yg/mL卡那霉素的LB平板，涂布均勻至干燥， 37°C過夜倒置培養(yǎng);次日挑取單克隆，接種在5mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C200rpm過夜 培養(yǎng)，即得到含有突變基因 TlXynA_3的重組工程菌。
[0042] 實施例3:
[0043] 發(fā)酵表達并純化上述突變基因 TlXynA_3所編碼的突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T，具體步驟如下：
[0044] (1)重組蛋白的異源表達：
[0045]①取實施例2得到的含有上述突變基因 TlXynA_3的重組工程菌，于5mL LB培養(yǎng)基 中（含50yg/mL卡那霉素)37 °C 200rpm過夜培養(yǎng)；
[0046]②將培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)接到裝有300mL LB培養(yǎng)基的1L三角瓶中（含50yg/mL卡那 霉素），37°C下培養(yǎng)約3h，至0D_ = 0.6-0.8;
[0047] ③加入終濃度為0.5mM的IPTG，20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)20h;
[0048] ④8000rpm，4 °C離心1 Omin，得到菌體沉淀；
[0049] ⑤用pH 8.0的NaH2P〇4_NaCl緩沖液重懸菌體，將菌液置于100mL離心管中；
[0050] ⑥將離心管置于冰上，超聲破碎細胞，時間設(shè)置為9s 0N，10s 0FF，共90次；
[0051] ⑦ 11〇〇〇Γρπι，4Γ 離心 30min;
[0052] ⑧用0.22μπι的濾頭過濾上清液，把柱子的填料與濾液結(jié)合，準(zhǔn)備進行親和純化。
[0053] (2)重組蛋白的純化：
[0054]①使用GE Healthcare公司Ni Sepharose 6 Fast Flow親和柱對含有6XHis tag 的目的蛋白進行親和純化。將上一步獲得的粗酶液與填料混合，于4 °C轉(zhuǎn)動結(jié)合2h，使填料 上的鎳與蛋白上的His標(biāo)簽充分結(jié)合；
[0055]②用pH 8.0的NaH2P〇4_NaCl緩沖液配制濃度為1M的咪唑母液，然后分別稀釋到 5mM，20mM，60mM，1 OOmM，200mM，用以上濃度的咪唑洗脫蛋白，分別收集至1 OmL EP管中；
[0056] ③蛋白洗脫后鎳柱再生，鎳柱再生時按照如下順序加入對應(yīng)溶液:50mM EDTA-蒸 餾水-1M NaCl-蒸餾水-0.1M硫酸鎳-蒸餾水-70%乙醇-20%乙醇保存?zhèn)溆茫?br>[0057] ④將收集的酶液進行SDS-PAGE:將樣品與SDS buffer按4:1混勻，樣品取16yL， buffer取4yL，Marker取 10yL，105°C處理lOmin;點樣時樣品點 12yL，Marker點5yL。用80V電 壓進行電泳，待蛋白樣品呈一條直線時把電壓調(diào)成180V。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍R-250染液 染色30min，脫色液脫色約2h，用掃描儀掃膠觀察；
[0058]⑤找出目的蛋白條帶較純的幾管，加 pH 6.0的Na2HP〇4_檸檬酸緩沖液，4900rpm于4 °C超濾，至濾出的緩沖液pH=6.0;
[0059] ⑥用無菌的0.2 2μπι濾頭將超濾后的酶液過濾到滅菌的1 OmL離心管中，4 °C保存。如 要長期保存，需置于-80 °C。
[0060] (3)重組蛋白的含量測定：
[0061] ①將目的蛋白稀釋到合適的濃度(測定時不超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的量程）；
[0062] ②對照組加入0. lmL pH 6.0的Na2HP〇4_檸檬酸緩沖液，實驗組加入0. lmL稀釋后的 目的蛋白溶液。每管再分別加入lmL考馬斯亮藍染色液，搖勻。靜置10min后測定0D595 ;
[0063] ③每組三個平行，測定三次，共九組重復(fù)；
[0064] ④根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白量和蛋白濃度。
[0065] 如圖1所示，SDS-PAGE電泳顯示，突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T的 條帶為25kDa左右的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，與預(yù)期大小21.3kDa相似，和前人的研究也相符(Damaso et al. ,2003)。此結(jié)果顯示，本發(fā)明成功獲得了目標(biāo)蛋白TlXynA-R116QR161QR187SK119T。
[0066] 以下用實驗例的方式來闡述本發(fā)明的有益效果：
[0067] 實驗例1 :本發(fā)明中突變基因 TlXynA_3所編碼的突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T與野生型酶TIXynA在不同鹽濃度下的酶活性比較：
[0068] (1)將突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T和野生型酶TIXynA稀釋到 0.0005mg/mL；
[0069] (2)在對照組管中加入20yL pH 6.0的Na2HP〇4_檸檬酸緩沖液，實驗組管中加入20μ L稀釋過的酶液，每管再分別加入80yL含NaCl濃度為0-5Μ不等的1 %木聚糖底物，65 °C反應(yīng) 10min；
[0070] (3)每管各加入80yL DNS，沸水浴lOmin;
[0071] (4)迅速冷卻，加入820yL ddH20,搖勻，測定OD550 ;
[0072] (5)每種酶做三次重復(fù)實驗；
[0073 ] (6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出木糖量，再根據(jù)公式算出比酶活；
[0074] (7)比較兩種蛋白在外加鹽濃度為0時的酶活性。
[0075] 突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T與野生型木聚糖酶TIXynA在不同鹽 濃度下的酶活性如圖2所示。在外加鹽濃度為1M到5M時，突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T的酶活性分別是野生型木聚糖酶TIXynA的1.36、1.62、1.76、1.92和 1.77倍，這證明突變木聚糖酶的耐鹽性相比野生型有所提高。
[0076] 突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T與野生型木聚糖酶TIXynA在外加鹽 濃度為〇時的酶活性如圖3所示。在外加鹽濃度為0時，野生型TIXynA的酶活性為3632IU/mg， 而突變木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T的酶活性為它的107%，達到了 3897IU/mg， 這證明突變木聚糖酶酶活性很高，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
[0077]上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明 精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3,其特征在于：所述基因的突變位點為 R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。2. 權(quán)利要求1所述木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3表達的木聚糖酶，其特征在于： 所述酶命名為TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。3. 權(quán)利要求1所述木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3在制備木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T 中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于： ① 構(gòu)建含所述木聚糖酶TIXynA的突變基因 TlXynA_3的重組載體pET28a-TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21 (DE3)中，獲得重組工程菌株； ② 將獲得的重組工程菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37±2°C，200± lOrpm條件發(fā)酵培 養(yǎng)至0D6QQ = 0.6-0.8;用終濃度為0.5mM的IPTG于20 °C，200rpm條件培養(yǎng)20 ± 2h，誘導(dǎo)表達得 到木聚糖酶 TlXynA-R116QR161QR187SK119T。
【文檔編號】C12N15/70GK105969783SQ201610497299
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】王祿山, 劉詩佳, 吳秀蕓, 張懷強
【申請人】山東大學(xué)