基于酶切靈敏檢測人類egfr基因突變的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因突變檢測領域，尤其涉及基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變 的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 人類表皮生長因子受體（EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是一種由原 癌基因C-erbB-l(HER-l)編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，廣泛表達于大部分正 常上皮細胞中。然而在許多實體腫瘤(如非小細胞肺癌)中往往存在EGFR高表達或異常表達 的情況，這與腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡的抑制有關，因此EGFR已經(jīng)成 為相關腫瘤(尤其是非小細胞肺癌）靶向治療的一個重要靶點。目前應用于臨床的EGFR靶 向藥物包括：EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKIs，如吉非替尼即易瑞沙和厄羅替尼即特羅凱）， 以及EGFR單克隆抗體如西妥昔單抗。大量研究表明，吉非替尼（Gefitinib)和厄羅替尼 (Erlotinib)的療效與EGFR基因尤其是其18-21號外顯子的突變狀況密切相關。攜帶EGFR 基因突變的肺癌患者對酪氨酸激酶抑制劑高度敏感，患者將得到很大的受益；反之野生型 基因的患者將基本不受益，因此EGFR基因檢測作為非小細胞肺癌等癌癥靶向藥物選用的 前提被列入了最新的NCCN(美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡）腫瘤臨床實踐指南。
[0003] 目前報導的EGFR基因突變檢測方法包括Sanger測序、Scorpions-ARMS、 TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等，其中在科研和臨床中較為常用的方法為Sanger 測序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探針；Amplificationrefractorymutation system，擴增阻滯突變系統(tǒng)）法。Sanger測序法是基因突變/多樣性檢測的金標準，具有 技術和平臺成熟、結(jié)果準確和全面等優(yōu)點；然而Sanger測序法主要的不足在于檢測靈敏度 約只有10-20%左右（即突變基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠檢出），且檢測過程繁 瑣、檢測時間長(大致需要2天)，這制約了其臨床應用?；赟corpions-ARMS法開發(fā)的如 德國Qiagen公司的EGFR檢測試劑盒，可同時檢測EGFR基因的29種常見突變，具有靈敏 度高(可測出低至1%水平的突變)、操作簡單、快速檢測等優(yōu)點；然而該類進口試劑盒檢測 成本過高(每份標本需3000-5000元）限制了其臨床的推廣和應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有人類EGFR基因突變檢測方法和試劑盒的不足，本發(fā)明的目的之一 在于提供一種基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的試劑盒；本發(fā)明的另一個目的在于 提供一種基于酶切的靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法。
[0005] 由于在EGFR基因片段的擴增體系中加入了針對突變位點的連接引物和耐熱DNA 連接酶，導致樣品中的野生型EGFR基因片段的擴增將受到有效的抑制，而突變型的擴增則 基本不受影響；因此使得突變含量低至1%的樣品其最終的擴增產(chǎn)物中突變片段的比例高 于50%，從而保證了酶切對于雜合基因片段體系的有效檢測。
[0006] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案如下： 首先，本發(fā)明涉及二赴基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的試劑盒，所述試劑盒包 括10XPCR緩沖液、10X耐熱DNA連接酶緩沖液、dNTPs、8條擴增引物、9條連接引物、耐熱 DNA連接酶、DNA聚合酶、10X錯配切除酶緩沖液和錯配切除酶；所述8條擴增引物其序列 如SEQ.IDNO. 1-SEQ.IDNO. 8 所示，其中SEQ.IDNO. 1 和SEQ.IDNO. 2、SEQ.IDNO. 3 和 SEQ.IDNO. 4、SEQ.IDNO. 5 和SEQ.IDNO. 6、SEQ.IDNO. 7 和SEQ.IDNO. 8 分別用于靶向第 18、19、20、21號外顯子片段的擴增；所述9條連接引物其核苷酸序列如SEQ.IDNO. 9-SEQ.IDNO. 17所示，所述連接引物其5'端第一個核苷酸均進行磷酸化修飾，其中SEQ.IDNO. 9 靶向第18號外顯子的3種突變位點，SEQ.IDNO. 10靶向第19號外顯子的19種突變位點， SEQ.IDNO. 11-SEQ.IDNO. 15 靶向第 20 號外顯子的 5 種突變位點，SEQ.IDNO. 16-SEQ.ID NO. 17靶向第21號外顯子的2種突變位點；所述錯配切除酶為T7核酸內(nèi)切酶I或芹菜Cel I酶，酶活單位不低于500單位/mL。
[0007] 其實，本發(fā)明實現(xiàn)涉及一種基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法，通過在 EGFR基因片段擴增體系中引入耐熱DNA連接酶和針對突變位點處的特定連接引物組，可以 基于擴增片段條帶直接判定野生型樣本或使得低突變含量樣品其最終的PCR產(chǎn)物中突變 片段的比例高于50% ;然后通過變性和退火，制備在突變位點處含有錯配構(gòu)造的DNA片段雜 交樣品，從而利用錯配切除酶實現(xiàn)對雜合基因片段樣品的有效檢測&
[0008] 更具體地，基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法及其試劑盒，具體步驟和 本發(fā)明試劑盒相關內(nèi)容如下： (1)樣本采集和基因組DNA提取 采集或取出待測生物樣本如患者的腫瘤組織或外周血等，利用相應的試劑盒提取其基 因組DNA。
[0009] (2)EGFR基因特定片段擴增 采用本發(fā)明試劑盒分別配制EGFR基因外顯子組合的含連接酶擴增體系即正常體系， 一共需要配制5管；所配制的5管擴增體系除了擴增引物和連接引物不同外其余均相同，如 表1所示： 表1EGFR基因外顯子正常擴增體系（25uL)
同時配制對應的不含連接引物、耐熱DNA連接酶緩沖液和耐熱DNA連接酶這三種組分 的對照擴增體系5管，體系配制參照表1，所缺組分添加量由滅菌去離子水替補，其余組分 同對應的正常體系。
[0010] 共5管正常體系(含連接酶擴增體系）和5管對照體系（不含連接酶擴增體系）在 基因擴增儀上進行EGFR基因片段的擴增，擴增條件均為：95°C預變性5-10min;94°C變性 15-30s，50-53°C退火 45-90s，72°C延伸l_2min，循環(huán) 30-36 次；72°C終延伸 10_12min。
[0011] (3 )擴增產(chǎn)物的電泳分析 所有的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在0. 5ug/ml的EB溶液中染色20min并用 清水脫色后置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照和分析。在對照體系成功擴增出目的基因片段的情況 下，以電泳圖譜中的DNAMarker條帶為標準，選取正常體系中出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物條帶明亮 即其濃度不低于5ng/uL的那些管，以及和其對應的對照體系擴增產(chǎn)物管備用。
[0012] (4)DNA片段雜交樣品的制備 將（3)中選取的各正常體系及其對應的對照體系的擴增產(chǎn)物，混合于新的PCR管中配 制混合DNA片段體系，將其置于PCR儀上進行變性和退火，從而獲得DNA片段雜交樣品； 將（3)中選取的各正常體系及其對應的對照體系的擴增產(chǎn)物，按照一定體積比混合于 新的PCR管中，添加一定量的PCR緩沖液和去離子水后在PCR儀上進行變性和退火，從而獲 得DNA片段雜交樣本。
[0013] (5)DNA片段雜交樣品的酶切分析 利用可以有效識別并切除DNA雙鏈上錯配位點的酶(簡稱錯配切除酶)處理（4)中制備 的DNA片段雜交樣本，反應后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，以DNAMarker為參照，分析 得到的實際酶切帶型和對應的理論酶切帶型的一致性情況。
[0014] (6)EGFR突變結(jié)果判定 以DNAMarker條帶為標準，在對照體系正常擴增的情況下，如果正常體系中的各目的 擴增片段條帶微弱即其濃度明顯低于5ng/uL，則無需進行酶切和后續(xù)操作直接判定樣品的EGFR基因檢測結(jié)果為陰性即野生型；如果某些目的條帶明亮即其濃度不低于5ng/uL，且酶 切產(chǎn)物電泳帶型和對應的理論酶切帶型一致的話，則判定樣品的EGFR基因檢測結(jié)果為陽 性即突變型，突變類型以對應的理論酶切帶型代表的突變?yōu)闇?；如果目的條帶明亮即其濃 度不低于5ng/uL，但無顯見的酶切帶型出現(xiàn)或出現(xiàn)的酶切帶型與對應的理論酶切帶型不一 致的話，則判定樣品此次EGFR基因檢測結(jié)果為無法判斷，需要重新測定。
[0015] 其中，步驟（1)中樣本的采集對象若為腫瘤患者則應在其充分知情同意的前提下 進行；采集或取出的組織樣本包括但不限定于新鮮組織、冰凍組織、甲醛浸泡組織和甲醛固 定石蠟包埋組織切片，血液樣本包括但不限定于新鮮血液、血漿和血清，其它生物樣本包括 但不限定于胸水、腹水和腫瘤脫落細胞，樣本采集或取用量等取樣要求和前處理按照對應 的基因組提取試劑盒執(zhí)行；提取樣本基因組DNA后，利用瓊脂糖凝膠電泳或吸亮度法評估 其提取量(濃度）和純度，需要保證EGFR基因片段的有效擴增：如基因組DNA的提取量不少 于200ng，純度以0D26。/ 0D2S。在1. 8-2. 0之間為宜。
[0016] 其中，步驟（2)中采用的本發(fā)明試劑盒的組分如表2所示： 表2本發(fā)明試劑盒組分
表2中，編號1-7的組分是用于步驟（2)中的目的片段擴增的，編號8和9兩種組分是 用于步驟（5)中的酶切反應的。其中10XPCR緩沖液是由100mmol/LTr