本發(fā)明提供RAS蛋白的至少一種肽，其用于治療癌癥。本發(fā)明還涉及用于所述用途的所述至少一種肽的藥物制劑。

發(fā)明背景

癌癥發(fā)作的遺傳背景是原癌基因、癌基因和腫瘤抑制基因的改變。原癌基因是細(xì)胞具有變成癌基因的潛能的正?；?。所有癌基因都編碼蛋白并且通過(guò)蛋白來(lái)行使功能。在大部分情況中，其被證明是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組分。在自然中癌基因通過(guò)點(diǎn)突變或易位而由原癌基因產(chǎn)生，由此導(dǎo)致載有所述突變的細(xì)胞的轉(zhuǎn)變狀態(tài)。癌癥通過(guò)涉及癌基因和腫瘤抑制細(xì)胞中的若干突變事件的多步過(guò)程而發(fā)展。

在其最簡(jiǎn)單的形式中，原癌基因中的單堿基置換可能導(dǎo)致編碼的蛋白有一個(gè)氨基酸不同。

在涉及鼠腫瘤的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校呀?jīng)證明細(xì)胞內(nèi)“自我”-蛋白的點(diǎn)突變可能產(chǎn)生由與正常的肽具有單個(gè)氨基酸差異的肽組成的腫瘤排斥抗原。在腫瘤細(xì)胞表面上的主要組織相容性(MHC)分子的背景中識(shí)別這些肽的T細(xì)胞能夠殺死腫瘤細(xì)胞并因此將腫瘤排出宿主。(Boon，T.等人，Cell 1989，Vol.58，p.293-303)

在近三十年，專門的努力致力于分析人腫瘤抗原的抗體。已經(jīng)表明此種抗體可以用于診斷和治療目的兩者，例如連同抗癌劑一起。一個(gè)問(wèn)題是抗體僅能夠結(jié)合暴露在腫瘤細(xì)胞的表面上的腫瘤抗原。因?yàn)檫@一原因，產(chǎn)生基于身體免疫系統(tǒng)的癌癥治療的努力不如預(yù)期的成功。

抗體典型地識(shí)別天然構(gòu)象的游離抗原并且可以有效地識(shí)別暴露在抗原表面上幾乎任何位點(diǎn)。相對(duì)于由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，T細(xì)胞僅識(shí)別在MHC分子背景中的抗原，所述抗原在人中被稱為HLA(人白細(xì)胞抗原)，并且所述識(shí)別僅在適當(dāng)?shù)目乖庸ぶ螅隹乖庸ねǔＳ傻鞍椎牡鞍姿馄位M成，其產(chǎn)生適配到MHC分子的溝中的肽。這使得T細(xì)胞能夠識(shí)別來(lái)源于胞內(nèi)蛋白的肽。T細(xì)胞可以因此識(shí)別來(lái)源于腫瘤細(xì)胞中的任何地方的異常肽(當(dāng)其被MHC分子展示在腫瘤細(xì)胞表面上時(shí))。隨后T細(xì)胞可以被激活以消除帶有異常肽的腫瘤細(xì)胞。

T細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制控制癌癥的發(fā)展和生長(zhǎng)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(HLA I類限制性CD8+和HLA II類限制性CD4+兩種)可以直接殺死帶有適當(dāng)?shù)哪[瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。需要CD4+輔助T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)和保持細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)以及抗體反應(yīng)，并且誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)殺傷。

已經(jīng)鑒定了很多癌基因及其蛋白產(chǎn)物。此外，已經(jīng)證明健康人的T細(xì)胞庫(kù)(repertoire)包括對(duì)被遞呈在適當(dāng)?shù)腍LA分子上時(shí)的來(lái)源于一種p21RAS癌基因產(chǎn)物的合成的肽片段具有特異性的T細(xì)胞。此外，預(yù)期全部癌癥中有大約20％與RAS癌基因的突變相關(guān)。

WO 92/14756公開(kāi)了引起T細(xì)胞免疫性的癌基因蛋白產(chǎn)物的合成的肽和片段，其用于針對(duì)與RAS相關(guān)的癌癥的疫苗和用于治療癌癥的組合物。所述肽對(duì)應(yīng)于由癌細(xì)胞遞呈的癌基因的活性片段，并且在對(duì)應(yīng)于癌基因突變的一個(gè)或多個(gè)位置處包括突變。該文獻(xiàn)公開(kāi)了在RAS蛋白的位置12、13和61處的突變，并且具體公開(kāi)了G12A、G12V、G12C、G12S、G12K、G12D、G12R、Q61R、Q61K、Q61L、Q61H、G13V和G13D突變。雖然該文獻(xiàn)提及疫苗可以包含具有在癌基因蛋白中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的突變的肽的選擇，但是其沒(méi)有提示肽的任何具體組合。

WO 00/66153討論了用于癌癥疫苗的引起T細(xì)胞免疫性的合成的肽混合物。所述肽混合物由RAS p21突變體肽組成，并且該文獻(xiàn)具體公開(kāi)了G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61H、Q61K、Q61L、Q61R和G13D突變。該文獻(xiàn)還公開(kāi)了由肽混合物引起的免疫應(yīng)答顯著高于由單個(gè)肽引起的免疫應(yīng)答。然而，其未提示將肽疫苗與任何其他形式的治療一起用于癌癥的聯(lián)合治療。

Gjertsen等人(Int.J.Cancer 2001，92，p.441-450)公開(kāi)了涉及用合成的突變體RAS肽與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合給患有胰腺的腺癌的患者進(jìn)行疫苗接種的I/II期試驗(yàn)。該試驗(yàn)使用單肽疫苗或四種突變體肽的混合物。組合疫苗由四種在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的K-RAS突變組成，即具有G12V、G12D、G12C或G12R突變的肽。該文獻(xiàn)未提示與抗代謝物化療劑聯(lián)合治療可能有效。

Wedén等人(Int.J.Cancer 2010，128(5)，p.1120-1128)報(bào)道了用合成的突變體RAS肽進(jìn)行疫苗接種的患有胰腺癌的患者的長(zhǎng)期隨訪。所述疫苗由單個(gè)的RAS肽或七種RAS肽的混合物組成。具體地，用于該試驗(yàn)的七種RAS肽具有G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V或G13D突變。沒(méi)有提到與抗代謝物化療劑的聯(lián)合治療。

Prior等人(Cancer Res.2012，72(10)，p.2457-2467)公開(kāi)了不同類型的癌癥與特定RAS同種型的突變相關(guān)，并且各同種型具有與眾不同的密碼子突變特征。此外，Prior等人公開(kāi)了在RAS蛋白的位置12、13和61中出現(xiàn)總計(jì)18種突變，每個(gè)位置出現(xiàn)六種突變。該綜述還討論了這些突變對(duì)RAS功能的影響以及導(dǎo)致RAS同種型突變的差異模式的潛在機(jī)制。

之前的不相關(guān)的癌癥患者治療是系統(tǒng)性施用化療劑吉西他濱(gemcitabine)。吉西他濱是目前常見(jiàn)的用于患有各種癌癥的患者的化療療法，所述癌癥如非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌。尤其是，吉西他濱常用于治療晚期胰腺癌。

吉西他濱是抗代謝物化療劑，特別是嘧啶類似物。吉西他濱的三磷酸鹽類似物在DNA復(fù)制過(guò)程中替代胞苷，并且插入延長(zhǎng)的DNA鏈，在加入再一個(gè)核苷酸后中止進(jìn)一步的DNA合成，原因在于DNA聚合酶不能前進(jìn)。作用的進(jìn)一步機(jī)制被認(rèn)為是包括抑制核糖核苷還原酶，導(dǎo)致DNA合成所需的脫氧核糖核苷酸池消耗，并且與三磷酸脫氧胞苷競(jìng)爭(zhēng)作為DNA聚合酶的抑制劑。這些作用造成壞死，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)停滯。該作用還意為，抗代謝物化療劑對(duì)其他活躍分裂的細(xì)胞如T細(xì)胞有毒性。優(yōu)選的方案包括首先使用化療，接著疫苗接種以增強(qiáng)之后對(duì)來(lái)自殺傷的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。

盡管一些藥物組合，如FOLFIRINOX，已經(jīng)顯示比吉西他濱在患有轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者中更有效，但是利用該組合的治療與高的副作用發(fā)生率相關(guān)(Conroy等人，N Engl J Med 2011，vol.364(19)，P.1817-1825)。因此，希望找到用于治療癌癥的新策略。

Oettle等人(JAMA 2007，297(3)，p.267-277)報(bào)道了在可切除胰腺癌中使用吉西他濱作為輔助化療的研究，并且公開(kāi)了吉西他濱對(duì)不患病存活的作用在具有R0或R1切除的患者中顯著。尤其是，該研究公開(kāi)了，與在切除后未施用吉西他濱的患者相比，在完全切除胰腺癌后，手術(shù)后的吉西他濱顯著延遲復(fù)發(fā)疾病的發(fā)展。然而，該研究未提示吉西他濱能夠與其他癌癥藥物療法聯(lián)合使用。

Bauer等人(Cancer Immunol.Immunother.2014，63，p.321-333)公開(kāi)了吉西他濱對(duì)樹(shù)突細(xì)胞(DC)疫苗誘導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖具有消極影響。尤其是，該研究表明，與DC疫苗相比，延遲施用吉西他濱不改善患者的免疫應(yīng)答，而共同施用吉西他濱和DC疫苗顯著損害疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

因此，需要提供進(jìn)一步的并且更有效的癌癥療法。

發(fā)明概述

本發(fā)明產(chǎn)生是因?yàn)楝F(xiàn)在已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)施用RAS肽疫苗相比，與抗代謝物化療劑(吉西他濱)聯(lián)合施用RAS肽疫苗顯著改善患者的免疫應(yīng)答。這是預(yù)料之外的，因?yàn)橹皳?jù)信，向患者施用抗代謝物化療劑，如吉西他濱，引起增殖的免疫細(xì)胞(包括增殖的T細(xì)胞)的細(xì)胞死亡，由此將會(huì)降低患者的免疫系統(tǒng)的活性，并且由此降低患者對(duì)同時(shí)或順序施用的肽疫苗的免疫應(yīng)答。不希望受理論限制，據(jù)信，事實(shí)上，抗代謝物化療劑造成的細(xì)胞死亡可以導(dǎo)致產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫原性環(huán)境的信號(hào)傳導(dǎo)分子的釋放，由此促進(jìn)已經(jīng)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和促進(jìn)進(jìn)一步誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，抗代謝物化療劑實(shí)際上增強(qiáng)，而不是降低針對(duì)肽疫苗的免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明的第一方面，提供至少一種適于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的肽，其中所述肽或每種肽對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的片段但具有RAS蛋白的一至三個(gè)點(diǎn)突變，其用于通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用來(lái)治療癌癥。

有利地，所述肽或每種肽包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域，其中所述區(qū)域除了位置12或13外分別具有與RAS蛋白的相應(yīng)區(qū)域相同的至少6個(gè)氨基酸殘基，并且其中所述肽或每種肽分別在對(duì)應(yīng)于所述位置12或13的氨基酸殘基處具有點(diǎn)突變。

方便地，所述點(diǎn)突變中的一個(gè)選自G13A，G13C，G13D，G13R，G13S，G13V，G12A，G12C，G12D，G12R，G12S或G12V突變。

優(yōu)選，所述至少一種肽包括兩種以上的肽，每個(gè)肽具有不同的點(diǎn)突變。

有利地，所述至少一種肽包括：

具有G13D突變的肽

具有G12A突變的肽

具有G12C突變的肽

具有G12D突變的肽

具有G12R突變的肽

具有G12S突變的肽，和

具有G12V突變的肽，

優(yōu)選其中所述至少一種肽包括由SEQ ID NO：13表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：14表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：15表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：16表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：17表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：18表示的序列組成的肽和由SEQ ID NO：19表示的序列組成的肽。

方便地，所述至少一種肽包括：

具有G13D突變的肽

具有G13C突變的肽

具有G12A突變的肽

具有G12C突變的肽

具有G12D突變的肽

具有G12R突變的肽

具有G12S突變的肽，和

具有G12V突變的肽，

優(yōu)選其中所述至少一種肽包括由SEQ ID NO：13表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：14表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：15表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：16表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：17表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：18表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：19表示的序列組成的肽和由SEQ ID NO：20表示的序列組成的肽。

優(yōu)選地，所述抗代謝物化療劑是嘧啶類似物，或其藥用鹽。

有利地，所述嘧啶類似物是吉西他濱，或其藥用鹽。

方便地，所述癌癥包含表達(dá)突變的RAS蛋白的細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述癌癥是胰腺癌。

方便地，所述胰腺癌是切除的胰腺癌。

有利地，所述抗代謝物化療劑在首次劑量的至少一種肽之后至少三周首次施用。

方便地，所述抗代謝物化療劑在手術(shù)切除胰腺癌之后12周以內(nèi)首次施用。

優(yōu)選地，所述抗代謝物化療劑在至少一種肽的24小時(shí)內(nèi)施用。

有利地，所述抗代謝物化療劑在已經(jīng)施用至少一種肽之后施用。

方便地，所述至少一種肽以每劑量0.01-10mg，優(yōu)選0.1-2mg，并且更優(yōu)選0.7mg的劑量施用。

優(yōu)選地，所述抗代謝物化療劑以100-10,000mg/m²，優(yōu)選500-2000mg/m²，并且更優(yōu)選1000mg/m²的劑量施用。

有利地，所述至少一種肽和抗代謝物化療劑以至少兩個(gè)階段(instance)，并且更優(yōu)選以至少三個(gè)階段同時(shí)或順序施用，其中每個(gè)施用階段間隔至少一周，并且更優(yōu)選至少2周。

在本發(fā)明的第二方面，提供至少一種對(duì)根據(jù)上述第一方面的至少一種肽特異的T-細(xì)胞，或包含對(duì)呈遞到MHC分子上時(shí)的根據(jù)上述第一方面的至少一種肽特異的T-細(xì)胞的T-細(xì)胞制劑，其用于通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用來(lái)治療癌癥。

在本發(fā)明的第三方面，提供藥物組合物，其包含根據(jù)上述第一方面的至少一種肽，或根據(jù)上述第二方面的至少一種T-細(xì)胞或T-細(xì)胞制劑，其用于通過(guò)與抗代謝物化療劑組合或順序施用治療癌癥。

在本發(fā)明的第四方面，提供試劑盒，其包含分別含有根據(jù)上述第一、第二或第三方面的所述的至少一種肽、T細(xì)胞或藥物組合物的第一產(chǎn)品，和包含上述方面中所述的抗代謝物化療劑的供給的第二產(chǎn)品。

在本發(fā)明的第五方面，提供治療癌癥的方法，其包括向有此需要的患者施用分別如上述第一、第二或第三方面的所述的至少一種肽、T細(xì)胞或藥物組合物，和如上述方面中所述的抗代謝物化療劑。

術(shù)語(yǔ)“肽”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指作為較長(zhǎng)的蛋白的片段(或具有對(duì)應(yīng)于較長(zhǎng)的蛋白的片段的序列)的氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)還適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是修飾的殘基，或非天然存在的殘基，如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)擬似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

兩個(gè)序列之間的百分比“同一性”可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller和David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)使用默認(rèn)參數(shù)來(lái)確定。特別地，可以在互聯(lián)網(wǎng)上使用URL http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/來(lái)訪問(wèn)BLAST算法。

術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，在一些實(shí)施方案中是指在主要組織相容性(MHC)分子將肽遞呈在細(xì)胞表面上后T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且特別地是指在肽的遞呈后的T細(xì)胞的激活。

術(shù)語(yǔ)“RAS蛋白”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指由ras原癌基因編碼的那類小GTP酶蛋白并且包括RAS蛋白的全部三種同種型：HRAS、KRAS和NRAS。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“RAS蛋白”是指對(duì)應(yīng)于UniProtKB/Swiss-Prot登記號(hào)P01112.1并且如SEQ ID NO：23中所示的蛋白。

術(shù)語(yǔ)“RAS蛋白的位置13”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指從N端數(shù)起，形成野生型RAS蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸鏈中的第十三個(gè)氨基酸。

術(shù)語(yǔ)“RAS蛋白的位置12”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指從N端數(shù)起，形成野生型RAS蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸鏈中的第十二個(gè)氨基酸。

術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于位置13的氨基酸”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，表示RAS蛋白的肽中的位于所述肽的氨基酸鏈中在對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的氨基酸序列的第十三個(gè)氨基酸(從N端數(shù)起)的位置處的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于位置12的氨基酸”具有相應(yīng)的意義。

術(shù)語(yǔ)“RAS蛋白突變”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指在存在于取自受試者的樣品中的RAS蛋白中存在的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。

術(shù)語(yǔ)“點(diǎn)突變”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指蛋白產(chǎn)物的多肽鏈中的單個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基代替。

術(shù)語(yǔ)“一至三個(gè)點(diǎn)突變”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，意為一個(gè)點(diǎn)突變或兩個(gè)點(diǎn)突變或三個(gè)點(diǎn)突變。

術(shù)語(yǔ)，例如，“G12V突變”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指使得野生型RAS蛋白的位置12處的甘氨酸(G)被纈氨酸(V)代替的點(diǎn)突變。類似的定義適用于類似的術(shù)語(yǔ)，如G13C、G13R等。

術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，表示適用于出于治療目的而向目標(biāo)人或動(dòng)物受試者施用的藥物制劑。

術(shù)語(yǔ)“抗代謝物化療劑”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，意為具有抑制患者的細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞分裂的效果并且用作癌癥的治療型治療的產(chǎn)品。

術(shù)語(yǔ)“吉西他濱”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，意為IUPAC名稱為4-氨基-1-(2-脫氧-2，2-二氟-β-D-紅-五呋喃糖基)嘧啶-2(1H)-酮的化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)式：

術(shù)語(yǔ)“其藥用鹽”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，意為通過(guò)允許游離形式化合物與酸或堿反應(yīng)形成的鹽。藥用鹽的實(shí)例包括氫鹵酸鹽，如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽和氫碘酸鹽；無(wú)機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽、硝酸鹽、高氯酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽；低級(jí)烷磺酸鹽，如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽和乙磺酸鹽；芳基磺酸鹽，如苯磺酸鹽和對(duì)甲苯磺酸鹽；有機(jī)酸鹽，如乙酸鹽、蘋果酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽和馬來(lái)酸鹽；堿金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽；金屬鹽，如鋁鹽和鐵鹽；無(wú)機(jī)鹽，如銨鹽；胺鹽，包括有機(jī)鹽，如叔-辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘氨酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環(huán)己基胺鹽、N，N′-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-芐基苯乙胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、和三(羥甲基)氨基甲烷鹽；和氨基酸鹽，如甘氨酸鹽、賴氨酸鹽、精氨酸鹽、鳥(niǎo)氨酸鹽、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。

術(shù)語(yǔ)“順序施用”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，意為向患者施用兩種產(chǎn)品，其中所述兩種產(chǎn)品不同時(shí)施用。在一些實(shí)施方案中，順序施用的每個(gè)階段意為所述兩種產(chǎn)品間隔少于5天、4天、3天、2天或1分別施用。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示在每名患者中記錄陽(yáng)性DTH反應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)的表。¹DTH未評(píng)估；²NT：未治療。

圖2是顯示在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的過(guò)程中，吉西他濱對(duì)DTH反應(yīng)起作用后的協(xié)同輔助效果的圖表。

序列表簡(jiǎn)述

SEQ ID NO：1顯示具有G13C突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2顯示具有G13R突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3顯示具有G13D突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4顯示具有G13V突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5顯示具有G13A突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6顯示具有G13S突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7顯示具有G12A突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8顯示具有G12C突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9顯示具有G12D突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10顯示具有G12R突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11顯示具有G12S突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12顯示具有G12V突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13顯示具有G13D突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14顯示具有G12A突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15顯示具有G12C突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16顯示具有G12D突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17顯示具有G12R突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18顯示具有G12S突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19顯示具有G12V突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20顯示具有G13C突變的TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21顯示具有G13R突變的RAS肽的備選氨基酸序列。

SEQ ID NO：22顯示具有G13V突變的RAS肽的備選氨基酸序列。

SEQ rD NO：23顯示野生型RAS蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列。

發(fā)明詳述

在通常意義上，本發(fā)明涉及RAS蛋白的至少一種肽，其用于通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用來(lái)治療癌癥。至少一種肽的每種肽具有RAS蛋白的一至三個(gè)點(diǎn)突變。

根據(jù)本發(fā)明使用的所述肽或每種肽可以是對(duì)應(yīng)于HRAS、KRAS或NRAS中任一種的肽。這些RAS同種型中的所有三種共有在負(fù)責(zé)GDP/GTP結(jié)合的所有區(qū)域(即在癌癥中進(jìn)行突變的區(qū)域)中的序列同一性。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述一至三個(gè)點(diǎn)突變中的至少一個(gè)是對(duì)應(yīng)于由RAS癌基因編碼的突變的點(diǎn)突變，例如在RAS蛋白的位置12，13或61處的點(diǎn)突變。

在一些實(shí)施方案中，所述肽或每種肽包含至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少20個(gè)、至少24個(gè)或至少30個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種肽或每種肽包含至少8個(gè)氨基酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種肽或每種肽包含至少17個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，所述肽或每種肽包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或每種肽的點(diǎn)突變?cè)谒鑫恢?2或13的氨基酸殘基處。

在一些實(shí)施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區(qū)域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少37％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs 1-6中的一個(gè)具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個(gè)具有至少95％的序列同一性。在其他實(shí)施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個(gè)具有100％的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽包含在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個(gè)具有百分比序列同一性的第一肽和在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6的另一個(gè)具有不同百分比序列同一性的第二肽。在其他實(shí)施方案中，第一肽在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個(gè)具有百分比序列同一性，并且第二肽在包含位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的另一個(gè)具有相同的百分比序列同一性。在所有實(shí)施方案中，所述肽或每種肽能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。

上述實(shí)施方案中的至少一種肽的第一肽和第二肽中的每一個(gè)在RAS蛋白的位置13具有點(diǎn)突變，其中第一肽中的點(diǎn)突變不同于第二肽中的點(diǎn)突變。野生型RAS蛋白在位置13包含甘氨酸(G)。因此，位置13的突變可以是從甘氨酸到任何其他氨基酸的點(diǎn)突變。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)G13A、G13C、G13D、G13R、G13S和G13V突變與癌癥特別相關(guān)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或每種肽的點(diǎn)突變獨(dú)立地是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突變之一。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一肽和第二肽之一在位置13處的點(diǎn)突變獨(dú)立地是G13C或G13D突變。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一肽或第二肽之一在位置13處的點(diǎn)突變是G13C突變。在其他特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一肽或第二肽之一在位置13處的點(diǎn)突變是G13D突變。

在一些實(shí)施方案中，第一肽或第二肽在位置13處的點(diǎn)突變是G13C突變，并且另一種肽在位置13處的點(diǎn)突變是G13D突變。

在其他實(shí)施方案中，第一肽或第二肽在位置13處的點(diǎn)突變是G13R突變，并且另一種肽在位置13處的點(diǎn)突變是G13V突變。

在一些實(shí)施方案中，存在兩種以上RAS蛋白的肽，其具有RAS蛋白的一至三個(gè)點(diǎn)突變，其用在通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用治療癌癥的方法中。第二肽或更多的肽中的每個(gè)獨(dú)立地包含至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少20個(gè)、至少24個(gè)或至少30個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種肽包含至少8個(gè)氨基酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種肽包含至少17個(gè)氨基酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，每種肽包含至少18個(gè)氨基酸。通常，肽混合物中的每種肽可以包含與一種或多種其他肽不同數(shù)量的氨基酸。每種肽具有至少一個(gè)不同于其他一種或多種肽的點(diǎn)突變。

在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，所述至少一種肽可以包括RAS蛋白的至少第三肽，其包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域。所述至少第三肽可以在對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點(diǎn)突變，該點(diǎn)突變不于第一和第二肽的位置13的突變。所述點(diǎn)突變可以是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突變中的一個(gè)，獨(dú)立于第一和第二肽的點(diǎn)突變。

本發(fā)明的至少一種肽可以另外包括RAS蛋白的至少一種其他肽，其包含至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種其他肽的所述區(qū)域包括RAS蛋白的位置12。

在至少一種肽包括至少第三肽的實(shí)施方案中，每種肽獨(dú)立地包含至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少20個(gè)、至少24個(gè)或至少30個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種肽包含至少8個(gè)氨基酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種肽包含至少17個(gè)氨基酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，每種肽包含至少18個(gè)氨基酸。通常，所述至少一種肽中的每種肽可以包含與所述至少肽中的一種以上其他肽不同數(shù)量的氨基酸。

在至少一種肽包括至少一種包含包括RAS蛋白的位置12的區(qū)域的肽的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置12的氨基酸具有點(diǎn)突變。在野生型RAS蛋白中，位置12的氨基酸是甘氨酸(G)。因此，在一些實(shí)施方案中，位置12處的點(diǎn)突變可以是除甘氨酸之外的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)突變獨(dú)立地是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突變。在其他實(shí)施方案中，所述至少一種其他肽在包含位置12的區(qū)域之外的位置處與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽在包含位置12的區(qū)域之外的位置處與SEQ ID NO：7-12之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，存在多于一種RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域，并且在對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置12的氨基酸處具有點(diǎn)突變。在所述實(shí)施方案中，每種具有位置12非突變的肽具有不同的點(diǎn)突變。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽包括至少兩種RAS蛋白的肽，每種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域。位置12處的點(diǎn)突變可以是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突變之一。包括RAS蛋白的位置12的至少兩種肽可以在包含位置12的區(qū)域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，包含包括位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的至少兩種肽在包含位置12的區(qū)域之外的位置處與SEQ ID NOs：7-12和14-19之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在所述至少一種肽中設(shè)想上述突變和SEQ ID Nos的任意組合，用于本發(fā)明所述的應(yīng)用。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽由下述組成：具有G13D突變的肽，具有G12A突變的肽，具有G12C突變的肽，具有G12D突變的肽，具有G12R突變的肽，具有G12S突變的肽，和具有G12V突變的肽。在所述實(shí)施方案中，所述至少一種肽獨(dú)立地在包含位置12或13的區(qū)域之外的位置分別與SEQ ID NOs：3，7，8，9，10，11和12具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述肽混合物由獨(dú)立地在包含位置12或13的區(qū)域之外的位置分別與SEQ ID NOs：13-19具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的肽組成。在與SEQ ID NOs：13-19具有100％的序列同一性時(shí)，本發(fā)明的該實(shí)施方案在本文中稱為TG01。表3顯示優(yōu)選存在于TG01中的肽。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽由下述組成：具有G13C突變的肽，具有G13D突變的肽，具有G12A突變的肽，具有G12C突變的肽，具有G12D突變的肽，具有G12R突變的肽，具有G12S突變的肽，和具有G12V突變的肽。在所述實(shí)施方案中，所述至少一種肽獨(dú)立地在包含位置12或13的區(qū)域之外的位置分別與SEQ ID NOs：1，3，7，8，9，10，11和12具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述肽混合物由獨(dú)立地在包含位置12或13的區(qū)域之外的位置分別與SEQ ID NOs：13-20具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的肽組成。在與SEQ ID NOs：13-20具有100％的序列同一性時(shí)，本發(fā)明的該實(shí)施方案在本文中稱為TG02。表4顯示優(yōu)選存在于TG02中的肽。

通常，根據(jù)本發(fā)明使用的所述至少一種肽或每種肽，在包括位置12或13的8個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)，分別在位置12或13的殘基之外具有與RAS蛋白的相應(yīng)區(qū)域相同的至少6個(gè)氨基酸殘基。此外，通常，根據(jù)本發(fā)明使用的所述至少一種肽或每種肽，在包括RAS蛋白的位置12或13的區(qū)域之外的位置分別與SEQ ID NOs：1-20之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽由第一、第二、第三和第四肽組成。第一和第二肽各自在RAS蛋白的位置13處具有點(diǎn)突變，其中第一肽中的點(diǎn)突變不同于第二肽中的點(diǎn)突變。第一和第二肽中的每種的點(diǎn)突變獨(dú)立地是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突變之一。第三和第四肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域，并且第三和第四肽中的每一個(gè)獨(dú)立地在包括位置13的區(qū)域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第三和第四肽中的每種可以獨(dú)立地在包括位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6，20，13，21或22中的一個(gè)具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第三和第四肽中的每種在對(duì)應(yīng)于RAS肽的位置13的氨基酸處具有點(diǎn)突變，并且第一、第二、第三和第四肽中的每種具有與其他肽的點(diǎn)突變不同的點(diǎn)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽是具有G13R突變的肽，第二肽是具有G13A突變的肽，第三肽是具有G13S突變的肽，并且第四肽是具有G13V突變的肽。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽由最多8種不同肽組成。在其他實(shí)施方案中，存在最多10、12、14或16種不同的肽。在包含多于一種肽的實(shí)施方案中，所述至少一種肽可以包含1、2、3、4、5或6種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域的肽。在包含多于一種肽的其他實(shí)施方案中，所述至少一種肽可以包含1、2、3、4、5或6種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域的肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述至少一種肽包括1、2、3、4、5或6種獨(dú)立地包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域的肽。

在一些實(shí)施方案中，所述包含包括RAS肽的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的肽或每種包含包括RAS肽的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的肽包含RAS蛋白的位置1至30。在備選實(shí)施方案中，所述包含包括RAS肽的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的肽或每個(gè)包含包括RAS肽的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置13的氨基酸在每個(gè)肽的C-末端。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置13的氨基酸在所述肽或每種肽的N-末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域可以由RAS蛋白的包括位置13的任意8個(gè)位置組成。例如，具有包括位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域可以由RAS蛋白的位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、位置11至位置18、位置12至位置19或位置13至位置20的氨基酸組成。

在一些實(shí)施方案中，包含包括RAS肽的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的肽包含RAS蛋白的位置1至30。在其他實(shí)施方案中，包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在備選實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置12的氨基酸在肽的C-末端。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置12的氨基酸在肽的N-末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域可以由RAS蛋白的包括位置12的任意8個(gè)位置組成。例如，具有包括位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域可以由RAS蛋白的位置5至位置12、位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、位置11至位置18或位置12至位置19的氨基酸組成。

在包括多于一種肽的實(shí)施方案中，所述多于一種肽可以包括相同或不同比例的不同肽。例如，在由第一和第二肽組成的實(shí)施方案中，第一和第二肽以相同比例使用，即每種肽占使用的肽的50％。在其他實(shí)施方案中，第一肽的比例大于第二肽的比例。例如，第一肽可以占使用的肽的至少55％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在備選實(shí)施方案中，使用比第一肽大的第二肽的比例。例如，第二肽可以占使用的肽的至少55％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在其中使用多于兩種肽的實(shí)施方案中，肽可以以彼此相同或不同的比例使用。例如，每種肽可以獨(dú)立地占使用的肽的至少1％，至少5％，至少10％，至少20％至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。

備選實(shí)施方案包括包含至少五種RAS蛋白的肽的至少一種肽，其中五種肽中的每種包含包括RAS肽的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域。至少五種肽中的每種獨(dú)立地在包括位置13的區(qū)域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或獨(dú)立地在包括位置13的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6，13，20，21和22中的一個(gè)具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。所述至少五種肽中的每種在對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變獨(dú)立地選自G13A，G13C，G13D，G13R，G13S或G13V突變，并且每種肽的點(diǎn)突變不同于其他肽的點(diǎn)突變。

在另一實(shí)施方案中，適于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種肽由六種RAS蛋白的肽組成，其中每種肽包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域。每種肽獨(dú)立地在包括位置12的區(qū)域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或獨(dú)立地在包括位置12的區(qū)域之外的位置與SEQ ID NOs：7-12和14-19之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。每種肽在對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的位置12的氨基酸處具有點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變選自G12A，G12C，G12D，G12R，G12S或G12V突變，并且每種肽的點(diǎn)突變不同于其他肽的點(diǎn)突變。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，適于引發(fā)免疫應(yīng)答的所述至少一種肽由RAS蛋白的第一、第二、第三和第四肽組成，其中第一、第二和第三肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域，并且RAS蛋白的第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域。第一、第二、第三和第四肽的每種獨(dú)立地在包括位置12或13的區(qū)域之外的位置分別與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或獨(dú)立地在包括位置12或13的區(qū)域之外的位置處分別與SEQ ID NOs：7-12，14-19，1-6，13，20，21和22之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第一、第二、第三和第四肽中的每種在對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的所述位置12或13的氨基酸處分別具有點(diǎn)突變。在一些實(shí)施方案中，第一肽是具有G12A突變的肽，第二肽是具有G12R突變的肽，第三肽是具有G12S突變的肽，并且第四肽是具有G13C突的肽變。

根據(jù)本發(fā)明使用的至少一種肽是對(duì)應(yīng)于由MHC II分子展示在細(xì)胞表面上的RAS蛋白片段的肽。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的至少一種肽是這樣的肽：其對(duì)應(yīng)于由細(xì)胞內(nèi)蛋白水解RAS蛋白得到的蛋白片段，其隨后可以展示在HLA分子上，并且個(gè)體通常在其T細(xì)胞庫(kù)中具有對(duì)其有反應(yīng)性的T細(xì)胞。

在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供至少一種T-細(xì)胞，或包含所述T-細(xì)胞的T-細(xì)胞制劑，所述T-細(xì)胞對(duì)當(dāng)呈遞在MHC分子上時(shí)的上文所述的至少一種肽特異，其用于通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用來(lái)治療癌癥。所述至少一種T-細(xì)胞可以通過(guò)用RAS蛋白的至少一種肽刺激至少一種反應(yīng)性T-細(xì)胞產(chǎn)生。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種T-細(xì)胞包含多種T-細(xì)胞，其中第一和第二T-細(xì)胞分別對(duì)對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的片段的第一和第二肽特異，其中每種肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域，其中第一和第二T-細(xì)胞中的每種對(duì)肽的對(duì)應(yīng)于所述位置13的氨基酸的點(diǎn)突變特異，并且第一T-細(xì)胞特異針對(duì)的點(diǎn)突變不同于第二T-細(xì)胞特異針對(duì)的點(diǎn)突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如，所述至少一種T-細(xì)胞包含多種對(duì)對(duì)應(yīng)于RAS蛋白的片段的肽特異的T-細(xì)胞，其中所述肽包含包括RAS肽的位置13的至少8個(gè)氨基酸的區(qū)域，其中每種T-細(xì)胞對(duì)肽的對(duì)應(yīng)于所述位置13的氨基酸處的點(diǎn)突變特異。

上文所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞和T-細(xì)胞制劑用于治療癌癥，并且與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用。在一些實(shí)施方案中，所述抗代謝物化療劑是嘧啶類似物，或其藥用鹽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗代謝物化療劑是吉西他濱或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，吉西他濱的藥用鹽是吉西他濱鹽酸鹽。

根據(jù)本發(fā)明使用的至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞或T-細(xì)胞制劑用于治療癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是由于RAS蛋白中的突變，尤其是對(duì)應(yīng)于所施用的一種或多種肽中的點(diǎn)突變的突變引起的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌中的一種或多種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是切除的胰腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽包括具有G13C點(diǎn)突變的肽，所述至少一種T-細(xì)胞對(duì)具有G13C突變的肽特異，或所述T-細(xì)胞制劑包含對(duì)具有G13C突變的肽特異的T-細(xì)胞，并且用于通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用治療癌癥。在所述實(shí)施方案中，優(yōu)選所述癌癥是胰腺癌。在另一實(shí)施方案中，所述至少一種肽包括具有G13D突變的肽，所述至少一種T-細(xì)胞對(duì)具有G13D突變的肽特異，或所述T-細(xì)胞制劑包含對(duì)具有G13D突變的肽特異的T-細(xì)胞，并且用于通過(guò)與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用治療癌癥。尤其是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)施用肽疫苗相比，通過(guò)按照以下劑量方案同時(shí)或順序施用至少一種肽治療癌癥顯著改善針對(duì)至少一種肽的免疫應(yīng)答：第1周：僅肽；第2周-僅肽；第3周-僅肽；第4周-肽和抗代謝物化療劑；第5周-僅抗代謝物化療劑；第6周-肽和抗代謝物化療劑；第7周-無(wú)治療；和第8周-肽和抗代謝物化療劑。

還提供包含上文所述的至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞或T-細(xì)胞制劑的藥物組合物，其用于本發(fā)明所述的應(yīng)用。所述藥物組合物還可以包含至少一種藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物還包含一種以上另外的活性成分和/或佐劑。在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物還可以包含一種以上對(duì)同一疾病適應(yīng)癥治療有效的成分。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物還包含粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在一些實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑與所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物一起同時(shí)施用。因此，在所述實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑與所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物同時(shí)施用。

在其他實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑與所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物順序施用。在一些實(shí)施方案中，施用所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物，并且接著施用抗代謝物化療劑。在一些實(shí)施方案中，在順序施用的每個(gè)階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的6小時(shí)內(nèi)施用。在其他實(shí)施方案中，在順序施用的每個(gè)階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的12小時(shí)內(nèi)施用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在順序施用的每個(gè)階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的18小時(shí)內(nèi)施用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在順序施用的每個(gè)階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的24小時(shí)內(nèi)施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在順序施用的每個(gè)階段中，抗代謝物化療劑在施用所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物之后24小時(shí)立即施用。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑多于一次同時(shí)或順序施用給同一患者。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽和抗代謝物化療劑施用至少兩次(即以至少兩個(gè)階段)。在其他實(shí)施方案中，所述至少一種肽和抗代謝物化療劑施用至少三次(即以至少三個(gè)階段)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑施用多于三次(即以多于三個(gè)階段)。在一些實(shí)施方案中，施用所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑的每個(gè)階段間隔至少一周。在其他實(shí)施方案中，施用所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑的每個(gè)階段間隔至少兩周。在一些實(shí)施方案中，施用的每個(gè)階段間隔多于兩周。

在一些實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑在與本發(fā)明的至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物同時(shí)或順序施用之前或之后，單獨(dú)施用一次或多次。在其他實(shí)施方案中，所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物在與抗代謝物化療劑同時(shí)或順序施用之前或之后單獨(dú)施用一次或多次。

因此，在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的第一次施用，抗代謝物化療劑的第一次施用延遲。在一些實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的第一次施用后至少一周進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的第一次施用之后至少兩周進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的第一次施用之后至少三周進(jìn)行。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，盡管在所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物中的每種和抗代謝物化療劑的第一次施用之間有延遲，抗代謝物化療劑在施用所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的24小時(shí)內(nèi)施用。尤其是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物的第一次施用和抗代謝物化療劑的第一次施用之間三周的延遲對(duì)記錄的免疫應(yīng)答有顯著影響。

在一些實(shí)施方案中，其中所述癌癥是切除的胰腺癌，抗代謝物化療劑的第一次施用是在手術(shù)切除胰腺癌后12周以內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，第一次施用是在手術(shù)切除胰腺癌后10周以內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在手術(shù)切除胰腺癌后8周以內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明使用的所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的遞送技術(shù)施用給受試者。例如，其他技術(shù)中，所述至少一種肽、至少一種T-細(xì)胞、T-細(xì)胞制劑或藥物組合物可以以溶液的形式、脂質(zhì)體的形式或干燥形式(例如，以包衣顆粒的形式等)通過(guò)注射施用給受試者。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.01mg至10mg的至少一種肽的量施用。在其他實(shí)施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.1mg至2mg的至少一種肽的量施用。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.1mg的至少一種肽的量施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.7mg的至少一種肽的量施用。劑量取決于施用給患者的不同肽的數(shù)量。例如，當(dāng)所述至少一種肽僅由一種類型的點(diǎn)突變組成，則所述至少一種肽或藥物組合物優(yōu)選以每劑量0.1mg的至少一種肽的量施用。在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)至少一種肽包括七種以上類型的點(diǎn)突變時(shí)，所述至少一種肽或藥物組合物優(yōu)選以每劑量0.7mg的至少一種肽的量施用。

在一些實(shí)施方案中，所述至少一種T-細(xì)胞或T-細(xì)胞制劑以靜脈內(nèi)注射和/或輸注施用，并且以例如10⁶至10¹²個(gè)每種對(duì)本發(fā)明的肽特異的T-細(xì)胞的量施用。

抗代謝物化療劑可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何遞送技術(shù)施用給受試者。例如，在一些實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑通過(guò)套管、中線(central line)或通過(guò)外周插入的中心導(dǎo)管施用。在一些實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑以100至10,000mg/m²體表面積的量施用。在一些實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑以500至2000mg/m²體表面積的量施用。在其他實(shí)施方案中，抗代謝物化療劑以1000mg/m²體表面積的量施用。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，提供包含以下各項(xiàng)的試劑盒：包含上文所述的至少一種肽、T細(xì)胞或藥物組合物的第一產(chǎn)品，和提供如上文所述的抗代謝物化療劑的供應(yīng)的第二產(chǎn)品。以分開(kāi)的小瓶和隔室提供第一和第二產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于施用第一和第二產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。

表

表1.SEQ ID NOs：1-6的位置13突變的RAS肽

表2.SEQ ID NOs：7-12的位置12突變的RAS肽

表3.TG01中含有的SEQ ID NOs：13-19的肽

表4.TG02中含有的SEQ ID NOs：13-20的肽

實(shí)施例

實(shí)施例1

進(jìn)行I/II期試驗(yàn)以研究對(duì)切除的胰腺癌用單獨(dú)的RAS肽疫苗接種(TG01)以及隨后與吉西他濱輔助化療聯(lián)合的輔助治療的安全性和免疫學(xué)反應(yīng)。

患者在手術(shù)后1-8周內(nèi)接受TG01連同免疫調(diào)節(jié)劑，GM-CSF。在TG01/GM-CSF治療開(kāi)始后3-7周，患者也接受吉西他濱。在接受至少一個(gè)周期的吉西他濱后第11周對(duì)患者評(píng)估安全性和免疫應(yīng)答。

最初，將六名患者用TG01和GM-CSF處理，并且在第11周，如下文列出的，利用安全性和免疫應(yīng)答評(píng)估怎樣繼續(xù)研究。

在第11周，如果：

-6名患者中有0名顯示免疫應(yīng)答，和/或6名患者中有3名顯示劑量限制性毒性(DLT)，將終止研究，

-6名患者中有1-3名顯示免疫應(yīng)答和/或6名患者中有3名顯示DLT，則將招募另外6名患者進(jìn)入研究中，

-6名患者中有4名以上顯示免疫應(yīng)答和/或6名患者中有2名以下顯示DLT，則起始II期研究。

決定的是，如果I期招募擴(kuò)展到12名患者，則在第11周，如果：

-12名患者中有少于4名顯示免疫應(yīng)答和/或12名患者中多于4名顯示DLT，則將終止研究，

-12名患者中有4名以上顯示免疫應(yīng)答和/或12名患者中有4名以下顯示DLT，將起始II期研究。

因此，如果：

a)在第11周，6名患者中有4名以上顯示免疫應(yīng)答并且6名患者中有2名以下顯示DLT，或

b)在第11周，12名患者中有4名以上顯示免疫應(yīng)答并且12名患者中有4名以下顯示DLT，

則將起始II期研究。

試驗(yàn)治療的準(zhǔn)備

在2R玻璃小瓶中提供TG01，包含2.1mg的TG01，并且將一個(gè)TG01小瓶中的內(nèi)容物溶解在0.3mL無(wú)菌水中用于注射(7mg/mL)。在重構(gòu)后6小時(shí)內(nèi)使用溶液。

在小瓶中提供GM-CSF，含有0.1mg，并且將一瓶中的內(nèi)容無(wú)溶解在0.33mL無(wú)菌水中用于注射(0.30mg/mL)。在重構(gòu)后6小時(shí)內(nèi)使用溶液。

吉西他濱以1000mg/m²的劑量施用。藥物提供在200mg和1g的小瓶中，用于在要通過(guò)靜脈內(nèi)注射給予的鹽水中重構(gòu)。

對(duì)于DTH，將一個(gè)TG01小瓶中的內(nèi)容物溶解在0.3mL無(wú)菌水中用于注射。在重構(gòu)后6小時(shí)內(nèi)使用溶液。

TG01和GM-CSF劑量和施用

在第1，3，5，8，15，22天和每2周給予TG01和GM-CSF，直到化療結(jié)束(第1天定義為TG01治療的第一天，其是在手術(shù)后1-8周)。化療結(jié)束后，在未表現(xiàn)出復(fù)發(fā)和/或在研究治療期間具有陽(yáng)性免疫應(yīng)答的患者中，每4周給予進(jìn)一步的加強(qiáng)注射，直到第52周，然后每12周給予加強(qiáng)注射，持續(xù)至多2年，或直到同意終止或有毒性(取最早的那個(gè))。

TG01劑量是0.70mg(在水中以7mg/mL重構(gòu)的TG01溶液的0.10mL注射液用于注射)。GM-CSF劑量是0.03mg(-在水中以0.3mg/mL重構(gòu)的GM-CSF溶液的0.10mL注射液用于注射)。

將兩種研究藥物通過(guò)皮內(nèi)注射施用至上臂的背側(cè)，在注射TG01之前10-15分鐘施用GM-CSF。

化療劑量和施用

患者在開(kāi)始TG01和GM-CSF(起始治療期的第22，36或50天)之后至少3周(但不晚于自手術(shù)日起12周)開(kāi)始接受吉西他濱。將TG01和GM-CSF的首次劑量日視為化療治療期的第1天。在四周周期的第1、8和15天以1000mg/m²靜脈內(nèi)給予吉西他濱歷時(shí)30分鐘，總共六個(gè)周期。

DTH劑量和施用

在第1，8，15，22，36，50和64天在對(duì)側(cè)臂下部區(qū)域給予TG01。

在治療日制備DTH-測(cè)試劑量，并且是0.10mL的以7mg/mL水的TG01，用于注射溶液，制備用于以無(wú)菌注射器皮內(nèi)注射。

化療劑量標(biāo)準(zhǔn)

吉西他濱：

在施用吉西他濱之前，在每個(gè)新的治療周期開(kāi)始時(shí)，評(píng)估患者以保證他們滿足產(chǎn)品制造商的吉西他濱的處方信息。

結(jié)果和討論

研究從6名患者擴(kuò)展到9名患者，并且從中獲得的結(jié)果在下文討論。

到第11周，在所有9名受試者中都發(fā)現(xiàn)TG01-特異性免疫應(yīng)答，并且未報(bào)道DLT。

安全性特性如對(duì)于胰腺手術(shù)后接受化療的患者所預(yù)期的。存在被認(rèn)為與單獨(dú)的TG01/GM-CSF相關(guān)的一個(gè)副作用事件，其是注射位點(diǎn)反應(yīng)。一名患者經(jīng)歷三個(gè)與TG01/GM-CSF和吉西他濱相關(guān)的事件(惡心、嘔吐和流感樣癥狀)。與吉西他濱相關(guān)的不良事件如對(duì)于3/4級(jí)嗜中性白血球減少癥(neutropenia)(其是主要相關(guān)的不良事件)所預(yù)期的。在這些情況下需要中斷或減少吉西他濱劑量。

在兩名患者中報(bào)道了四種嚴(yán)重的不良事件。一名患者經(jīng)歷肺部感染和兩次發(fā)燒，都認(rèn)為與吉西他濱相關(guān)。一名患者經(jīng)歷惡心，也被認(rèn)為與利用TG01和吉西他濱的治療無(wú)關(guān)。

根據(jù)在基線處(第1周)無(wú)DTH反應(yīng)，在第3周結(jié)束時(shí)起始吉西他濱之前，四名患者(44％)產(chǎn)生DTH反應(yīng)(圖1和2)。在第一周期的吉西他濱(第6周)之后，這增加至七名患者(77％)具有DTH陽(yáng)性，并且在第二周期(第8周)的首次吉西他濱劑量后，增加至所有九名患者(100％)(圖1和2)。這表明，在第8周在用TG01和吉西他濱共同治療后，在所有患者中誘導(dǎo)了Th1極化的針對(duì)TG01的應(yīng)答。

還發(fā)現(xiàn)，對(duì)已建立的免疫應(yīng)答沒(méi)有降低或消除，從而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答持續(xù)(圖2)。的確，在第二周期(第8周)中施用TG01和吉西他濱二者之后顯示免疫應(yīng)答的患者數(shù)量顯著大于單獨(dú)施用TG01時(shí)的患者數(shù)量(圖2)。

這些結(jié)果表明以下預(yù)料不到的研究結(jié)果：TG01和吉西他濱的組合在癌癥患者中有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是強(qiáng)烈的。尤其是，用于使研究繼續(xù)到II期的算法(即在第11周，如果6名患者中有4名以上顯示免疫應(yīng)答和/或6名患者中有2名以下顯示DLT，則將開(kāi)始II期研究)表明，預(yù)期是可能50％的患者將在第11周顯示免疫應(yīng)答。因此，所有在第11周顯示具有免疫應(yīng)答的患者對(duì)于研究的設(shè)計(jì)者是出乎意料的。