專利名稱：用于檢測人類K-ras基因突變的引物、探針及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因突變檢測引物及該引物的使用方法，具體地涉及一種能檢測人類K-ras基因7個熱點突變的引物及其使用方法。

背景技術(shù)：
腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素是細胞增殖、分化失控，細胞凋亡障礙及血管生成通路異常，它是一個多基因改變的積累過程。近年來研究顯示K-ras基因活性物與細胞增殖、凋亡之間關(guān)系密切。突變K-ras基因使本應(yīng)正常死亡的細胞的生存期延長，K-ras基因過度表達還能增加抗藥物和紫外光誘導(dǎo)的凋亡，可能的機制是K-ras基因增強了細胞分解過氧化氫的能力從而抑制凋亡。K-ras基因能夠根據(jù)激活信號的強度和質(zhì)量、細胞類型和代謝環(huán)境誘導(dǎo)細胞抗凋亡通道，因此對K-ras基因突變的檢測將有助于控制腫瘤細胞生長和凋亡制定出有效的治療方案。
K-ras基因在調(diào)節(jié)細胞生長和分化方面具有重要作用，大約70％的腫瘤在不同程度上都與12、13位密碼子突變有關(guān)，其它密碼子突變在59、61位上。K-ras基因在骨肉瘤、軟骨肉瘤、骨巨細胞瘤中均有高表達，K-ras基因激活與促進惡性骨腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)。而K-ras基因活化又與IV型膠原酶的高表達有密切聯(lián)系，因此認為這種改變可能是K-ras基因促進腫瘤細胞侵潤轉(zhuǎn)移的分子調(diào)節(jié)機制之一。
K-ras基因在燕麥細胞癌中突變率占33％，結(jié)腸癌占44％，胰腺癌占90％。如果這些患者服用相關(guān)藥物如Cetuximab(愛必妥)和Panitumumab(帕尼單抗)等藥物，治療效果不明顯，如果樣品為野生型，這些靶向藥物對某些人群療效非常好，但是價格昂貴，如果病人攜帶有K-ras突變而服用此類藥物，不僅耽誤病情還造成巨額藥費的浪費。因此，在用藥前篩查檢測病人是否攜帶有K-ras基因突變顯得尤為重要，也是未來腫瘤個體化治療的發(fā)展方向。所以，如何快速準確地檢測這些與藥物反應(yīng)性有關(guān)的K-ras基因突變成為人們亟待解決的問題。
建立對腫瘤病人K-ras基因突變檢測方法不同于檢測一般性的遺傳突變，一般的遺傳性突變即便是雜合性突變(異質(zhì)性)和野生比例永遠是1/1，靠一般的探針技術(shù)就可以對突變和野生進行很好的區(qū)分。然而，這些K-ras突變都是體細胞突變，提取模板中存在大量野生型DNA，突變所占比例不確定，直接來自手術(shù)切除的樣品，突變比例高，可能達到20％以上，或許突變含量只有0.1％。雖然可以通過顯微激光捕獲樣品中的腫瘤細胞，提高樣品中腫瘤細胞的比率。不過即便是腫瘤細胞，也不是100％的腫瘤細胞都帶有此類突變，處于不同腫瘤組織部位的細胞或許不太一樣。如果是來自血液的樣品突變含量或許會更低。這就是稀有突變檢測的難點一面要具有高靈敏的檢測能力——個位數(shù)甚至單個突變拷貝，另外必須保證極高的特異性——面對上千倍上萬倍的野生型模板的干擾，不出現(xiàn)假陽性。
目前檢測K-ras基因稀有突變的方法有多種，檢測能力在1％～20％。主要有兩大類，一類是非實時PCR，主要有測序和DHPLC，檢測能力僅為20％和5％，而且需要PCR后處理，步驟繁瑣，耗時長，容易污染；另一類是實時PCR，雖然都是基于實時PCR的技術(shù)平臺，但是為了提高檢測方法的選擇能力，不同學(xué)者所用策略不盡相同。主要有完全依賴DNA序列自身識別特異性和依賴酶識別特異性兩大類策略，有TaqMan探針、高分辨熔解曲線分析、競爭性抑制實時PCR方法，檢測能力5％～20％之間，DxS蝎子引物法檢測能力可達1％。
近年來，研究發(fā)現(xiàn)在病人的外周血液中能夠檢測到癌細胞逸出的突變DNA，成為良好的腫瘤早期診斷、治療預(yù)后的生物標記。Kimura等(2006年)報道能夠在循環(huán)血血清中檢測到K-ras突變。認為檢測這些外周血液中的突變DNA，可以知道靶向藥物靶標位點的分子學(xué)特征，從而判斷哪個藥物對病人最有效。但是，外周血液中癌細胞的突變DNA是存在于大量野生型基因背景下的極為稀少的突變基因，其存在比率一般小于0.2％，即便是手術(shù)切除的肺癌組織中也混雜了大量的正常細胞，而且并不是所有的腫瘤細胞都帶有突變。上述方法不能滿足越來越多的無創(chuàng)的突變檢測需要，因此能否準確無創(chuàng)地檢測這類稀有突變對現(xiàn)有檢測技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。


發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)檢測能力有限，現(xiàn)提供一種熒光PCR檢測K-ras基因突變的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是針對K-ras基因的7個熱點突變，設(shè)計的突變型引物以及特殊探針對待測樣品分8個PCR管進行檢測，其包括以下步驟 (1)根據(jù)K-ras基因12和13密碼子的野生型基因序列和7種突變基因序列，設(shè)計多對高特異性簡并引物和多個特異性雙環(huán)探針。
(2)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應(yīng)體系 (3)用步驟(1)的各種特異性簡并引物和特異性雙環(huán)探針分別擴增待測的7種點突變基因序列。
(4)利用雙環(huán)探針與擴增產(chǎn)物的雜交，檢測反應(yīng)體系的熒光強度，以達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標準，Ct值為0或35陰性；Ct小于28陽性。
熒光PCR的反應(yīng)體系為 1×PCR緩沖液、ddH2O MgCl2 5.0～10.0mmol dNTP各 0.8～1.5mmol 各對引物0.1~1.0μmol 各條探針0.5~1.0μmol Taq酶 2.0～3.0U 模板4.0～6.0μl 總體積 20～30μl 所述熒光PCR的反應(yīng)條件是96℃預(yù)變性3分鐘，15個循環(huán)95℃變性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)95℃變性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)，后35個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。
所述的K-ras基因突變具體相見表1 表1K-ras基因12和13密碼子的7種熱點突變 所述特異性引物和特異性探針如下 1、根據(jù)K-ras基因12密碼子第2位核苷酸由G突變?yōu)锳而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO1) K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO2) 2、根據(jù)K-ras基因12密碼子第2位核苷酸由G突變?yōu)镃而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC(SEQ ID NO3) K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO4) 3、根據(jù)K-ras基因12密碼子第2位核苷酸由G突變?yōu)門而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT(SEQ ID NO5) K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO6) 4、根據(jù)K-ras基因12密碼子第1位核苷酸由G突變?yōu)锳而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA(SEQ ID NO7) K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO8) 5、根據(jù)K-ras基因12密碼子第1位核苷酸由G突變?yōu)镃而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC(SEQ ID NO9) K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO10) 6、根據(jù)K-ras基因12密碼子第1位核苷酸由G突變?yōu)門而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT(SEQ ID NO11) K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO12) 7、根據(jù)K-ras基因13密碼子第2位核苷酸由G突變?yōu)門而設(shè)計的一對上下游引物。其序列如下 K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA(SEQ ID NO13) K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO14) 8、與目標核酸擴增而得到的擴增產(chǎn)物雜交的雙環(huán)探針序列及其修飾如下K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) 9、包括以HGH基因作為擴增模板的一對內(nèi)控引物，分別命名為HGH-F、HGH-R，序列如下 HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO16) HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO17) 10、以一段HGH基因作為雜交對象的一對內(nèi)控雙環(huán)探針，其序列如下HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA(SEQ ID NO18) 所述實時熒光PCR檢測K-ras基因12和13密碼子的7種突變的方法不包括對待測樣品處理和模板提取步驟，但對于來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自血漿的樣品所提的短片段DNA依然具有與新鮮組織樣品DNA同樣的擴增和檢測能力。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明在特異性引物和雙環(huán)探針技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了多重實時PCR檢測7種K-ras基因12和13密碼子的突變檢測方法，此方法(1)靈敏度高，5-10拷貝的突變即可檢出；(2)特異性強，10ng野生型基因組DNA不會有非特異信號；(3)選擇性能力強，可以在10ng野生型基因組DNA背景下檢出0.1％～1％的突變DNA；(4)檢測速度快，整個檢測過程需要90分鐘。



圖1為本發(fā)明實時熒光PCR檢測7種K-ras基因突變的檢測曲線圖， (a)為本發(fā)明檢測陰性對照檢測曲線圖； (b)為本發(fā)明檢測7種K-ras基因突變的其中一種檢測曲線圖； 圖2為實施例1中實時熒光PCR檢測K-ras基因突變的檢測曲線圖，其中 (a)為樣本中不含K-ras基因GGT＞GAT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； (b)為樣本中含有K-ras基因GGT＞GAT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； (c)為靈敏度分析試驗結(jié)果曲線圖； (d)為選擇性試驗結(jié)果曲線圖； 圖3為實施例2中實時熒光PCR檢測K-ras基因突變的檢測曲線圖，其中 (a)為樣本中不含K-ras基因GGT＞AGT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； (b)為樣本中含有K-ras基因GGT＞AGT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； (c)為靈敏度分析試驗結(jié)果曲線圖； (d)為選擇性試驗結(jié)果曲線圖； 圖4為實施例3中實時熒光PCR檢測K-ras基因突變的檢測曲線圖，其中 (a)為樣本中不含K-ras基因GGC＞GAC突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； (b)為樣本中含有K-ras基因GGC＞GAC突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； (c)為靈敏度分析試驗結(jié)果曲線圖； (d)為選擇性試驗結(jié)果曲線圖；
具體實施例方式 本發(fā)明以K-ras基因12和13密碼子的7種突變?yōu)闄z測對象，通過特異引物的優(yōu)化組合以及使用雙環(huán)探針，從而實現(xiàn)快速準確、簡單地檢測7種突變，而且檢測突變的能力高達0.1％~0.1％。
野生型細胞系H460的基因組DNA為野生型模板，以細胞系SW480為K-ras-M4(Gly12Ser)模板，其他6種缺失突變以經(jīng)過基因工程構(gòu)建的突變質(zhì)粒作為突變模板，建立實時熒光PCR檢測K-ras基因7種突變的反應(yīng)體系，并將此體系用于K-ras基因突變的快速檢測。此方法主要包括以下步驟 (1)根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12和13密碼子的野生型基因序列和7種突變基因序列，設(shè)計多對高特異性簡并引物和特異性雙環(huán)探針。
(2)待測樣品處理和模板提取。
(3)熒光PCR擴增。
(4)檢測熒光信號，以達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標準。
步驟(1)中根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12和13密碼子的野生型基因序列和7種突變基因序列，設(shè)計多對高特異性簡并引物和特異性雙環(huán)探針，詳見表2。
其中步驟(2)樣品處理和模板提取，樣品適用范圍包括新鮮腫瘤組織、石蠟組織塊、石蠟組織玻片、血液、血漿等標本。對于樣本的處理參照市場上相應(yīng)的DNA提取試劑盒的操作說明。
步驟(3)的熒光PCR擴增的反應(yīng)體系為 1×PCR緩沖液 MgCl2 7.0mmol dNTP各 1.0mmol 各對引物0.1~1.0μmol 各條探針0.5~1.0μmol Taq酶 1.0U 模板5μl 總體積 25μl 以上試劑組分Taq酶和dNTP購自TaKaRa生物公司。反應(yīng)條件是96℃預(yù)變性3分鐘，15個循環(huán)95℃變性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)95℃變性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)，后35個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。
步驟(4)檢測熒光信號的Ct值，是采用MX3000P熒光PCR擴增儀退火階段檢測熒光，一次可檢測96份樣品(包括陰陽性質(zhì)控)。根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或35表示呈陰性；Ct小于28表示呈陽性；Ct在28~35之間時，樣品需重新檢測。檢測過程所需時間約為90分鐘。
實施例1 以試劑盒中的試劑來檢測臨床采集的石蠟組織樣本K-ras基因GGT＞GAT突變?yōu)槔?。根?jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12外顯子的野生型基因序列和突變基因序列比較分析，設(shè)計一對引物和探針分別為K-ras-M1-F、K-ras-M1-R、K-ras-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的HGH基因的野生型基因序列分析，設(shè)計一對引物和探針分別為HGH-F、HGH-R、HGH-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的人類基因外顯子4的野生型基因序列分析，設(shè)計一對引物和探針分別為EX-4-F、EX-4-R、 K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′ HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′ HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA EX-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATG EX-4-RTTGCTAAGTCCTGAGC EX-4-PHEX-5’-AAGGCATGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGTGTTCTA-3’-TAMRA 利用上述熒光PCR體系檢測臨床采集的石蠟組織樣本K-ras基因GGT＞GAT突變的方法包括以下步驟 (1)樣品處理和模板提取接收來自臨床的石蠟組織樣品，樣品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入1ml無水乙醇到沉淀中，室溫或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小時，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混勻再加入200μl無水乙醇充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2ml離心柱中，6000×g(8000rpm)離1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)離1min，小心打開蓋子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)離1min，空管離心20000×g(14000rpm)離3min，加入100μl Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000×g(14000rpm)離1min。取3μl測OD值，將提取的樣品DNA稀釋到2ng/μl，取5μl進行PCR反應(yīng)。
(2)熒光PCR擴增，其反應(yīng)體系為 1×PCR緩沖液、ddH2O MgCl27.0mmol dNTP各 1.0mmol K-ras引物0.5~1.0μmol K-ras探針0.5~1.0μmol HGH引物 0.5~1.0μmol HGH探針 0.5~1.0μmol Taq酶1.0U 模板 5μl 總體積 25μl 實時PCR反應(yīng)條件是96℃預(yù)變性3分鐘，15個循環(huán)95℃變性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)95℃變性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)，后35個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。
(3)檢測采用MX3000P實時PCR擴增儀(SRATGENE公司)退火階段檢測熒光，將含反應(yīng)液的PCR管逐一放到熒光PCR擴增儀進行檢測。根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或35陰性；Ct值小于28陽性；Ct在28-35之間樣品需重新檢測，儀器檢測時間為90分鐘。
圖2(a)為樣本中不含K-ras基因GGT＞GAT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線；圖2(b)為樣本中含有K-ras基因GGT＞GAT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； 共采收集100份臨床樣本，用前述的熒光PCR進行檢測，同時采用傳統(tǒng)的測序法進行驗證。熒光PCR方法與傳統(tǒng)測序檢測方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度高于傳統(tǒng)測序方法。見表3。
表3傳統(tǒng)測序方法與熒光PCR檢測方法的比較
(4)特異性分析 特異性檢測以SW48細胞的DNA作為對照，對收集的樣品進行K-ras基因GGT＞GAT突變檢測，特異性分析結(jié)果表明，只有含有K-ras基因GGT＞GAT突變的樣品有熒光信號，作為對照的SW48細胞DNA無熒光信號，同時采集血站100例血液樣品，進一步證明熒光PCR的特異性。結(jié)果表明血站采集的血液樣品DNA進行熒光PCR檢測無熒光信號。
(5)靈敏度分析 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突變的質(zhì)粒DNA進行定量分析，取經(jīng)定量后濃度為1000個拷貝數(shù)的樣品DNA，進行10倍稀釋，共做3個稀釋度，然后依次取4個稀釋度的5μl，8個平行組進行熒光PCR反應(yīng)。本發(fā)明的熒光PCR方法靈敏度高，1-10copys/μl即可檢出。見圖2(c)。
(6)選擇性試驗 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突變的質(zhì)粒DNA的1000、100、10、1個拷貝數(shù)在10ng的背景下進行熒光PCR檢測。本發(fā)明的熒光PCR方法選擇性好。見圖2(d)。
(7)重復(fù)性試驗 分別取10例經(jīng)傳統(tǒng)測序方法驗證為陽性和陰性的樣品，重復(fù)10次進行熒光PCR擴增，10次Ct值相差不0.1個循環(huán)。
實施例2 以試劑盒中的試劑來檢測臨床采集的石蠟組織樣本K-ras基因GGT＞AGT突變?yōu)槔?。根?jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12外顯子的野生型基因序列和突變基因序列比較分析，設(shè)計一對引物和探針分別為K-ras-M4-F、K-ras-M4-R、K-ras-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的HGH基因的野生型基因序列分析，設(shè)計一對引物和探針分別為HGH-F、HGH-R、HGH-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的人類基因外顯子4的野生型基因序列分析，設(shè)計一對引物和探針分別為EX-4-F、EX-4-R、K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′ HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′ HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA EX-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATG EX-4-RTTGCTAAGTCCTGAGC EX-4-PHEX-5’-AAGGCATGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGTGTTCTA-3’-TAMRA 利用上述熒光PCR體系檢測臨床采集的石蠟組織樣本K-ras基因GGT＞AGT突變的方法包括以下步驟 (1)樣品處理和模板提取接收來自臨床的石蠟組織樣品，樣品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入1ml無水乙醇到沉淀中，室溫或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小時，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混勻再加入200μl無水乙醇充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2ml離心柱中，6000×g(8000rpm)離1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)離1min，小心打開蓋子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)離1min，空管離心20000×g(14000rpm)離3min，加入100μl Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000×g(14000rpm)離1min。取3μl測OD值，將提取的樣品DNA稀釋到2ng/μl，取5μl進行PCR反應(yīng)。
(2)熒光PCR擴增，其反應(yīng)體系為 1×PCR緩沖液、ddH2O MgCl2 7.0mmol dNTP各 1.0mmol K-ras引物 0.5~1.0μmol K-ras探針 0.5~1.0μmol HGH引物0.5~1.0μmol HGH探針0.5~1.0μmol Taq酶 1.0U 模板 5μl 總體積 25μl 實時PCR反應(yīng)條件是96℃預(yù)變性3分鐘，15個循環(huán)95℃變性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)95℃變性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)，后35個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。
(3)檢測采用MX3000P實時PCR擴增儀(SRATGENE公司)退火階段檢測熒光，將含反應(yīng)液的PCR管逐一放到熒光PCR擴增儀進行檢測。根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或35陰性；Ct值小于28陽性；Ct在28-35之間樣品需重新檢測，儀器檢測時間為90分鐘。
圖3(a)為樣本中不含K-ras基因GGT＞GAT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線；圖3(b)為樣本中含有K-ras基因GGT＞GAT突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； 共采收集100份臨床樣本，用前述的熒光PCR進行檢測，同時采用傳統(tǒng)的測序法進行驗證。熒光PCR方法與傳統(tǒng)測序檢測方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度高于傳統(tǒng)測序方法。見表4。
表4傳統(tǒng)測序方法與熒光PCR檢測方法的比較
(4)特異性分析 特異性檢測以SW48細胞的DNA作為對照，對收集的樣品進行K-ras基因GGT＞AGT突變檢測，特異性分析結(jié)果表明，只有含有K-ras基因GGT＞AGT突變的樣品有熒光信號，作為對照的SW48細胞DNA無熒光信號，同時采集血站100例血液樣品，進一步證明熒光PCR的特異性。結(jié)果表明血站采集的血液樣品DNA進行熒光PCR檢測無熒光信號。
(5)靈敏度分析 以合成的含有K-ras基因GGT＞AGT突變的質(zhì)粒DNA進行定量分析，取經(jīng)定量后濃度為1000個拷貝數(shù)的樣品DNA，進行10倍稀釋，共做3個稀釋度，然后依次取4個稀釋度的5μl，8個平行組進行熒光PCR反應(yīng)。本發(fā)明的熒光PCR方法靈敏度高，1-10copys/μl即可檢出。見圖3(c)。
(6)選擇性試驗 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突變的質(zhì)粒DNA的1000、100、10、1個拷貝數(shù)在10ng的背景下進行熒光PCR檢測。本發(fā)明的熒光PCR方法選擇性好。見圖3(d)。
(7)重復(fù)性試驗 分別取10例經(jīng)傳統(tǒng)測序方法驗證為陽性和陰性的樣品，重復(fù)10次進行熒光PCR擴增，10次Ct值相差不0.1個循環(huán)。
實施例3 以試劑盒中的試劑來檢測臨床采集的石蠟組織樣本K-ras基因GGC＞GAC突變?yōu)槔?。根?jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因13外顯子的野生型基因序列和突變基因序列比較分析，設(shè)計一對引物和探針分別為K-ras-M7-F、K-ras-M7-R、K-ras-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的HGH基因的野生型基因序列分析，設(shè)計一對引物和探針分別為HGH-F、HGH-R、HGH-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的人類基因外顯子4的野生型基因序列分析，設(shè)計一對引物和探針分別為EX-4-F、EX-4-R、K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′ HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′ HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA EX-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATG EX-4-RTTGCTAAGTCCTGAGC EX-4-PHEX-5’-AAGGCATGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGTGTTCTA-3’-TAMRA 利用上述熒光PCR體系檢測臨床采集的石蠟組織樣本K-ras基因GGC＞GAC突變的方法包括以下步驟 (1)樣品處理和模板提取接收來自臨床的石蠟組織樣品，樣品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入1ml無水乙醇到沉淀中，室溫或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小時，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混勻再加入200μl無水乙醇充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2ml離心柱中，6000×g(8000rpm)離1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)離1min，小心打開蓋子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)離1min，空管離心20000×g(14000rpm)離3min，加入100μl Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000×g(14000rpm)離1min。取3μl測OD值，將提取的樣品DNA稀釋到2ng/μl，取5μl進行PCR反應(yīng)。
(2)熒光PCR擴增，其反應(yīng)體系為 1×PCR緩沖液、ddH2O MgCl2 7.0mmol dNTP各1.0mmol K-ras引物 0.5~1.0μmol K-ras探針 0.5~1.0μmol HGH引物 0.5~1.0μmol HGH探針 0.5~1.0μmol Taq酶 1.0U 模板 5μl 總體積 25μl 實時PCR反應(yīng)條件是96℃預(yù)變性3分鐘，15個循環(huán)95℃變性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)95℃變性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)，后35個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX熒光信號。
(3)檢測采用MX3000P實時PCR擴增儀(SRATGENE公司)退火階段檢測熒光，將含反應(yīng)液的PCR管逐一放到熒光PCR擴增儀進行檢測。根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或35陰性；Ct值小于28陽性；Ct在28-35之間樣品需重新檢測，儀器檢測時間為90分鐘。
圖4(a)為樣本中不含K-ras基因GGC＞GAC突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線；圖4(b)為樣本中含有K-ras基因GGC＞GAC突變的熒光PCR擴增儀測定的熒光強度曲線； 共采收集100份臨床樣本，用前述的熒光PCR進行檢測，同時采用傳統(tǒng)的測序法進行驗證。熒光PCR方法與傳統(tǒng)測序檢測方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度高于傳統(tǒng)測序方法。見表4。
表4傳統(tǒng)測序方法與熒光PCR檢測方法的比較
(4)特異性分析 特異性檢測以SW48細胞的DNA作為對照，對收集的樣品進行K-ras基因GGC＞GAC突變檢測，特異性分析結(jié)果表明，只有含有K-ras基因GGC＞GAC突變的樣品有熒光信號，作為對照的SW48細胞DNA無熒光信號，同時采集血站100例血液樣品，進一步證明熒光PCR的特異性。結(jié)果表明血站采集的血液樣品DNA進行熒光PCR檢測無熒光信號。
(5)靈敏度分析 以合成的含有K-ras基因GGC＞GAC突變的質(zhì)粒DNA進行定量分析，取經(jīng)定量后濃度為1000個拷貝數(shù)的樣品DNA，進行10倍稀釋，共做3個稀釋度，然后依次取4個稀釋度的5μl，8個平行組進行熒光PCR反應(yīng)。本發(fā)明的熒光PCR方法靈敏度高，1-10copys/μl即可檢出。見圖4(c)。
(6)選擇性試驗 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突變的質(zhì)粒DNA的1000、100、10、1個拷貝數(shù)在10ng的背景下進行熒光PCR檢測。本發(fā)明的熒光PCR方法選擇性好。見圖4(d)。
(7)重復(fù)性試驗 分別取10例經(jīng)傳統(tǒng)測序方法驗證為陽性和陰性的樣品，重復(fù)10次進行熒光PCR擴增，10次Ct值相差不0.1個循環(huán)。
序列表
<110>廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司
<120>用于檢測人類K-ras基因突變的引物、探針及其使用方法
<160>18
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M1上游引物
<400>1
TGGTAGTTGG AGCTGA16
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M1下游引物
<400>2
CTGCACCAGT AATATG16
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M2上游引物
<400>3
TGGTAGTTGG AGCTGC 16
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M2下游引物
<400>4
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M3上游引物
<400>5
TGGTAGTTGG AGCTGT 16
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M3下游引物
<400>6
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M4上游引物
<400>7
TGGTAGTTG GAGCTA 16
<210>8
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M4下游引物
<400>8
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>9
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M5上游引物
<400>9
TGGTAGTTG GAGCTC16
<210>10
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M5下游引物
<400>10
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M6上游引物
<400>11
TGGTAGTTGG AGCTT15
<210>12
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M6下游引物
<400>12
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M7上游引物
<400>13
TGGTGGAGC TGGTGA16
<210>14
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化學(xué)合成的K-ras-M7下游引物
<400>14
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>15
TCAAGGCGTG CCTTGACGAT ACAGCTCTGT AT32
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以HGH基因作為擴增模板的內(nèi)控上游引物
<400>16
GCCTTCCCAA CCATT 15
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以HGH基因作為擴增模板的內(nèi)控下游引物
<400>17
CATTCCCCAA GAGCTTAC18
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>18
TTGTCATTGA CAACGCTATG CTCCATAGC29
權(quán)利要求
1、用于檢測人類K-ras基因突變的引物及探針，其特征在于包括
以下序列的引物對
(1)TGGTAGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO1)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO2)
(2)TGGTAGTTGGAGCTGC(SEQ ID NO3)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO4)
(3)TGGTAGTTGGAGCTGT(SEQ ID NO5)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO6)
(4)TGGTAGTTGGAGCTA(SEQ ID NO7)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO8)
(5)TGGTAGTTGGAGCTC(SEQ ID NO9)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO10)
(6)TGGTAGTTGGAGCTT(SEQ ID NO11)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO12)
(7)TGGTGGAGCTGGTGA(SEQ ID NO13)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO14)和
以下序列的探針
FAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15)
以及內(nèi)控引物對
5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO16)
5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO17)
和內(nèi)控雙環(huán)探針
HEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA(SEQ ID NO18)
2、一種檢測人類K-ras基因突變的方法，其特征在于，其步驟為
(1)提供權(quán)利要求1所述的引物及探針；
(2)配制熒光PCR擴增突變基因序列的反應(yīng)體系
(3)用步驟(1)的引物和特探針分別擴增待測的7種點突變基因序列；
(4)利用雙環(huán)探針與擴增產(chǎn)物的雜交，檢測反應(yīng)體系的熒光強度，以達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標準，Ct值為0或35陰性；Ct小于28陽性。
3、如權(quán)利要求2所述的一種檢測人類K-ras基因突變的方法，其特征在于，其熒光PCR的反應(yīng)體系為
1×PCR緩沖液
MgCl2 5～10mmol
dNTP各0.8～1.5mmol
各對引物 0.1～1.0μmol
各條探針 0.5～1.0μmol
Taq酶 0.8～1.5U
模板 4～6μl
總體積20～30μl
4、一種檢測人類K-ras基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒至少包括
以下序列的引物對
(1)TGGTAGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO1)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO2)
(2)TGGTAGTTGGAGCTGC(SEQ ID NO3)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO4)
(3)TGGTAGTTGGAGCTGT(SEQ ID NO5)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO6)
(4)TGGTAGTTGGAGCTA(SEQ ID NO7)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO8)
(5)TGGTAGTTGGAGCTC(SEQ ID NO9)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO10)
(6)TGGTAGTTGGAGCTT(SEQ ID NO11)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO12)
(7)TGGTGGAGCTGGTGA(SEQ ID NO13)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO14)和
以下序列的探針
FAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15)
5、如權(quán)利要求4所述的一種檢測人類K-ras基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，還包括
作為內(nèi)控的引物對
5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO16)
5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO17)
和內(nèi)控雙環(huán)探針
HEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA(SEQ ID NO18)
6、如權(quán)利要求4或5所述的一種檢測人類K-ras基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，進一步包括分裝于PCR反應(yīng)管中的PCR反應(yīng)緩沖液及DNA聚合酶。
全文摘要
用于檢測人類K-ras基因突變的引物、探針及其使用方法，涉及基因突變的檢測。本發(fā)明將熒光定量PCR技術(shù)與熒光雙環(huán)探針技術(shù)方法相結(jié)合，發(fā)展了一種可以快速檢測基因突變的多重實時熒光PCR方法并設(shè)計了相關(guān)引物。將該方法用于檢測K-ras基因第12位和第13位密碼子發(fā)生的突變，分別采用針對其不同突變方式設(shè)計的突變型引物對待測樣品進行檢測，只有突變型樣品能被順利擴增出雙鏈DNA產(chǎn)物，該產(chǎn)物才能與雙鏈DNA探針結(jié)合，發(fā)出熒光信號從而被檢測到。本發(fā)明可檢測到樣品中含量為1/1000的突變型基因。具有快速、簡便、安全、高靈敏、高通量和低成本等優(yōu)點，可用于大量臨床樣本的K-ras基因突變篩查。
文檔編號C12N15/11GK101608241SQ20091011150
公開日2009年12月23日 申請日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者力 阮, 何東華, 鄭立謀 申請人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司