本發(fā)明是關(guān)于一種對基因啟動子進行定向進化的方法，具體而言，是關(guān)于一種利用dna改組技術(shù)結(jié)合易錯pcr技術(shù)對大腸桿菌的基因啟動子進行定向進化的方法。
背景技術(shù)：
啟動子是rna聚合酶特異性識別和結(jié)合的dna序列，是基因的一個組成部分，控制基因表達(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達的程度。原核啟動子有三個重要的區(qū)域：-10序列、-35序列和兩者之間的核苷酸。-10序列即tata盒，控制轉(zhuǎn)錄的起始，-35序列在轉(zhuǎn)錄時結(jié)合rna聚合酶，而-10區(qū)和-35區(qū)之間核苷酸數(shù)目的變動也會影響基因轉(zhuǎn)錄活性。改造這些控制元件能夠改變啟動子的效率和性質(zhì)。
目前對基因啟動子的遺傳工程改造主要是通過引入或敲除控制元件改善啟動子的效率和性質(zhì)。例如，rushton等人通過合理的設(shè)計，將多個能在病原體攻擊時調(diào)控基因表達的控制元件引入camv35s啟動子中，構(gòu)建了一個病原體誘導(dǎo)的植物啟動子(rushtonpj,reintadlera,lipkav,lippokb,somssichie.syntheticplantpromoterscontainingdefinedregulatoryelementsprovidenovelinsightsintopathogen-andwound-inducedsignaling.plantcell.2002,14:749-762)。cazzonelli等人在camv35s啟動子的上游加入了同向重復(fù)的增強子序列提高了啟動子的效率(cazzonellici,veltenej.invivocharacterizationofplantpromoterelementinteractionusingsyntheticpromoters.transres2008,17:437-457)。mehrotra等人把兩個調(diào)控元件acgt框或一個gt框放在啟動子的tata框上游時，分別提高了6倍和2倍的啟動子效率(mehrotrar,panwarj.dimerizationofgtelementinterferesnegativelywithgeneactivation.jgenet.2009,88:257-260；mehrotrar,mehrotras.promoteractivationbyacgtinresponsetosalicylicandabscisicacidsisdifferentiallyregulatedbythespacingbetweentwocopiesofthemotif.jplantphysiol.2010,167:1214-1218)。但是這些重構(gòu)啟動子的方法往往需要了解啟動子的功能區(qū)域才能合理設(shè)計出順式作用元件引入的方案，而且操作繁瑣復(fù)雜，耗時長，成功概率低，啟動子效率提高幅度不大。
近年來，也有一些研究通過對基因啟動子的定向進化優(yōu)化啟動子的效率。定向進化指的是利用分子的生物學(xué)手段，在分子水平上創(chuàng)造分子的多樣性，在事先不了解啟動子的功能區(qū)域的情況下，通過模擬自然進化，在體外改造基因啟動子，以改進的誘變技術(shù)結(jié)合靈敏的篩選方法，定向選擇有價值的基因啟動子。目前，定向進化技術(shù)在酵母菌和大腸桿菌等單細胞微生物的代謝工程改造中得到成功應(yīng)用，其中主要是通過易錯pcr技術(shù)或dna改組技術(shù)對啟動子進行定向進化。
易錯pcr是在采用dna聚合酶進行啟動子序列擴增時，通過調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dntps濃度或運用低保真度dna聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向啟動子中隨機引入突變，獲得啟動子的隨機突變體。gokagiya等人利用易錯pcr將隨機點突變引入到一條本身沒有啟動子活性但是有類似原核啟動子-10和-35序列的dna片段中。突變的dna片段含有了更多的-10和-35序列，將其與lacz基因連接后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，重組菌不加誘導(dǎo)物也能表達半乳糖苷酶，而且酶活比tac啟動子調(diào)控lacz基因表達的半乳糖苷酶的酶活大1.94倍(kagiyag,ogawar,hatashitam,takagik,kodakit,hiroshis,yamamotok.generationofastrongpromoterforescherichiacolifromeukaryoticgenomedna.journalofbiotechnology.2005,115:239-248)。但是，易錯pcr技術(shù)建立的啟動子文庫含有較多的有害突變，獲得強啟動子的成功率較低，而且往往需要經(jīng)過多輪的易錯pcr，費時費力。
dna改組是指啟動子序列的體外重組，首先用低保真酶擴增一組啟動子序列，經(jīng)過超聲波處理或用dna酶i(dnasei)消化產(chǎn)生一系列隨機切割的dna片段，然后在沒有引物的情況下，采用有性pcr方法進行合成。隨著循環(huán)數(shù)的增加，pcr產(chǎn)物將越來越接近切割前的啟動子長度。最后，用啟動子兩側(cè)的引物合成全長的啟動子。將重組啟動子與報告基因組成表達盒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，定向篩選一個高效的重組啟動子。這個啟動子可認為是有益突變的集合體。沈國妙等人利用dna改組技術(shù)改造aacc1基因啟動子，效率提高了3倍(沈國妙,姚泉洪,張銘,彭日荷,熊愛生.利用dna改組技術(shù)改造aacc1基因啟動子活性的研究.微生物學(xué)報.2004,44(1):58-61)。但是如果野生型啟動子序列不經(jīng)過突變或經(jīng)過突變率較低的方法擴增，那么dna改組后的重組啟動子所含的有益突變很少，導(dǎo)致文庫中大部分都是野生型群體，大大增加了篩選的難度。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的在于提供一種改進的對基因啟動子進行定向進化的方法。
dna改組技術(shù)結(jié)合易錯pcr技術(shù)在蛋白的定向進化中有廣泛的應(yīng)用，但是在啟動子的定向進化中卻鮮有報道。
本發(fā)明中，利用dna改組技術(shù)結(jié)合易錯pcr技術(shù)對大腸桿菌的基因啟動子進行定向進化，來高效、快捷提高基因啟動子的效率和蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明提供了一種對基因啟動子進行定向進化的方法，該方法包括：
用易錯pcr技術(shù)擴增啟動子，獲得一組突變頻率較高的啟動子序列；
用dna改組技術(shù)去除有害突變，集合有益突變，獲得改組的啟動子(重組的啟動子突變庫)；
將重組啟動子和半乳糖苷酶基因組成表達盒轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過藍白斑篩選和酶活測定獲得目標(biāo)突變啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，所述宿主細胞為大腸桿菌、其他細菌、真菌或哺乳動物細胞。
本方法不需要分析基因啟動子的功能區(qū)域，成本低，高效快捷，操作簡單，成功率高，適合于大腸桿菌乃至真菌、哺乳動物細胞等的基因啟動子定向進化。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，易錯pcr技術(shù)以1％-2％的突變頻率引點突變到宿主細胞的啟動子中。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，通過降解啟動子序列和回收小片段，經(jīng)過primerlesspcr和primerpcr獲得重組的突變啟動子，并將之克隆到帶有半乳糖苷酶報告基因的表達載體中，轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得啟動子突變庫。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，將庫涂布在含有x-gal的lb平板上，提取藍色最深的克隆擴大培養(yǎng)，分別進行β-半乳糖苷酶的酶活測定和改組啟動子的克隆測序分析。
在本發(fā)明的一具體實施方案中，本發(fā)明的方法是對大腸桿菌的tac啟動子進行定向進化。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，易錯pcr的反應(yīng)體系含有 0.5mm的mncl2、50mm的kcl、2.5mm的mgcl2、5u的taq酶、10mm的tri-cl(ph8.3)和1.0μm的引物。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法包括按照以下操作建立突變啟動子文庫：
以psv-β-galactosidase為模板，擴增報告基因β-半乳糖苷酶基因；擴增產(chǎn)物回收純化后經(jīng)sal1和sap1雙酶切，插入經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒puc19中，獲得質(zhì)粒puc19-lacz；
改組后的啟動子片段經(jīng)bamhi和sali雙酶切，插入經(jīng)相同酶切的puc19-lacz中，獲得重組質(zhì)粒puc19-mptac-lacz；
制備感受態(tài)細胞，向感受態(tài)細胞中加入重組質(zhì)粒puc19-mptac-lacz，于含有x-gal的lb平板中培養(yǎng)，獲得克隆文庫。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法包括按照以下操作篩選突變啟動子：挑取藍色顯示快、深的多個克隆進行液體培養(yǎng)，測定β-半乳糖苷酶酶活。
本發(fā)明還提供了按照所述的方法得到的改組后的啟動子。
在本發(fā)明的一具體實施方案中，本發(fā)明首先通過易錯pcr技術(shù)以1％-2％的突變頻率引點突變到大腸桿菌的tac啟動子中，再用dnasei降解啟動子序列和回收小片段，經(jīng)過primerlesspcr和primerpcr獲得重組的突變tac啟動子，并將之克隆到帶有半乳糖苷酶報告基因的表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得啟動子突變庫。
在本發(fā)明的一具體實施方案中，是將獲得的啟動子突變庫涂布在含有80mg/mlx-gal的lb平板上，提取藍色最深的克隆擴大培養(yǎng)，分別進行β-半乳糖苷酶的酶活測定和改組啟動子的克隆測序分析。
在本發(fā)明的一具體實施方案中，是對tac啟動子進行定向進化。通過易錯pcr擴增tac啟動子，建立mptac(突變tac啟動子)文庫，篩選得到β-半乳糖苷酶酶活高的強突變啟動子。
本發(fā)明將dna改組技術(shù)與易錯pcr技術(shù)有機結(jié)合，對大腸桿菌的基因啟動子進行定向進化，來高效提高基因啟動子的效率和蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。這種方法不需要分析基因啟動子的功能區(qū)域，成本低，高效快捷，操作簡便，成功率高，也適合于其他細菌、真菌和哺乳動物細胞的基因啟動子定向進化。
附圖說明
圖1為本發(fā)明一具體實施例中的ptac和mptac的序列比對。
具體實施方式
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例及附圖進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。
實施例1
本發(fā)明首先通過易錯pcr技術(shù)以1％-2％的突變頻率引點突變到大腸桿菌的tac啟動子中，再用dnasei降解啟動子序列和回收小片段，經(jīng)過primerlesspcr和primerpcr獲得重組的突變tac啟動子，并將之克隆到帶有半乳糖苷酶報告基因的表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得啟動子突變庫。將庫涂布在含有80mg/mlx-gal的lb平板上，提取藍色最深的克隆擴大培養(yǎng)，分別進行β-半乳糖苷酶的酶活測定和改組tac啟動子的克隆測序分析。
(1)tac啟動子的改組
易錯pcr擴增tac啟動子。由于mg2+在pcr過程中可以穩(wěn)定非互補的堿基對；mn2+能夠降低聚合酶對模板的特異性，因而調(diào)整兩種離子的濃度，并使用低保真taq酶(takara)可以獲得不同突變頻率的多樣性文庫。本發(fā)明的易錯pcr的反應(yīng)體系含有0.5mm的mncl2、50mm的kcl、2.5mm的mgcl2、5u的taq酶、10mm的tri-cl(ph8.3)和1.0um的引物，突變頻率為1％-2％。以pflag-mac(sigma-aldrich)為模板，用tac啟動子的上游引物為gcgctcatgagcccgaagtcgagccc(seqidno.1)和下游引物為ccggtggacgtgtgaaattgttatccgc(seqidno.2)擴增tac啟動子，反應(yīng)程序為：94℃1min；55℃0.5min；72℃1min；35個循環(huán)。擴增片段回收純化。
dnase1降解dna和小片段回收?；厥占兓蟮膖ac啟動子用dnase1buffer溶解后，加入0.001u的dnase115℃處理15min，90℃10min使dnase1失活。15％聚丙烯酰胺電泳回收30bp以下的片段。
將500ng左右的降解小片段進行不加引物的pcr反應(yīng)(primerlesspcr)。反 應(yīng)體系為0.8mmdntps+3mmmgcl2+50mmkcl+10mmtri(ph9.0)+5utaq酶+0.1％tritonx-100，補充ddh2o到50ul。反應(yīng)程序為：94℃0.5min；55℃0.5min；72℃0.5min；35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。
取primerlesspcr擴增后的產(chǎn)物5ul，加入引物f2和s2，常規(guī)pcr反應(yīng)擴增。擴增產(chǎn)物回收純化。
(2)構(gòu)建載體，建立mptac(突變tac啟動子)文庫
以psv-β-galactosidase(invitrogen)為模板，用上游引物ccggtcgacatgccttctgaacaatgg(seqidno.3)a和下游引物ggcttaccatccagcgccaccatccagt(seqidno.4)擴增報告基因β-半乳糖苷酶基因(lacz)。擴增產(chǎn)物回收純化后經(jīng)sal1和sap1雙酶切，插入經(jīng)同樣酶切的puc19中，獲得質(zhì)粒puc19-lacz。
改組后的啟動子片段經(jīng)bamhi和sali雙酶切，插入經(jīng)相同酶切的puc19-lacz中，獲得質(zhì)粒puc19-mptac-lacz。
用感受態(tài)細胞制備試劑盒(competentcellpreparationkit，takara)制備大腸桿菌e.colitop10的感受態(tài)細胞。向每200μl的感受態(tài)細胞中加入50ng重組質(zhì)粒puc19-mptac-lacz，輕輕混勻后冰中放置30分鐘。接著42℃熱激1min，冰上放置2min后加入800μl的lb培養(yǎng)液，37℃，200r/min，培養(yǎng)1小時。然后8000r/min，離心1min，倒掉上清液，用100μllb培養(yǎng)液重懸沉淀，涂布于含有x-gal的lb平板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16個小時。本發(fā)明一共涂布了20個平板，每個平板大約長出1000個克隆，獲得約2萬個克隆的文庫。
(3)強突變啟動子的篩選
挑取藍色顯示最快、最深的數(shù)個克隆進行液體培養(yǎng)，測定β-半乳糖苷酶酶活。測定方法參見《分子克隆》(第三版)pp.1363-1366中的方法進行。一個酶活單位定義為37℃，1min內(nèi)水解1μmolonpg底物的酶量。酶活測定結(jié)果表明，最強突變啟動子mptac生產(chǎn)的半乳糖苷酶酶活是ptac(野生型tac啟動子)的1.86倍。
(4)強突變啟動子mptac序列分析
篩選β-半乳糖苷酶酶活最高的克隆送到生工公司測序，mptac測序結(jié)果與野生型tac啟動子序列進行比對。ptac和mptac的序列比對結(jié)果參見圖1。
據(jù)文獻報道，擁有共同序列-35和-10以及兩者之間為17bp堿基的距離是強啟 動子的特征(deboerha,comstocklj,vasserm.thetacpromoter:afunctionalhybridderivedfromthetrpandlacpromoters.proc.natlacad.sci.1983,80:21-25；jensenpr,hammerk.thesequenceofspacersbetweentheconsensussequencesmodulatesthestrengthofprokaryoticpromoters.applenvironmicrobiol.1998,64(1):82-87)。
如圖1所示，改組后的tac啟動子相比野生型tac啟動子，有更為標(biāo)準的-10序列tataaa，其在-35和-10之間插入了一個堿基，使兩者之間的距離達到17bp，成為一個典型的強大腸桿菌啟動子。因此，它生產(chǎn)的半乳糖苷酶酶活比較高。