本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種osmpk21-1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：絲裂原蛋白激酶級(jí)聯(lián)(mitogenactivatedproteinkinasecascades，mapkcascades)是真核生物中保守的信號(hào)通路。mapk級(jí)聯(lián)包括三個(gè)層級(jí)的蛋白激酶，細(xì)胞膜表面的受體蛋白接受信號(hào)之后以直接或間接的方式激活mapkinasekinasekinase(mapkkk/map3k)，依次磷酸化下游特定的mapkkinase(mapkk/mkk)，之后mkk磷酸化并激活mapkinase(mapk/mpk)。激活的mpk會(huì)磷酸化細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中不同的底物蛋白，這些底物蛋白包括其它蛋白激酶、各種催化酶、轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白等，將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，并引發(fā)細(xì)胞的響應(yīng)。mapk參與了植物的干旱脅迫響應(yīng)(smekalovaetal.,2014)。干旱是陸生植物面臨的常見的非生物脅迫類型，干旱脅迫會(huì)增加植物磷脂酶d(phospholipased，pld)介導(dǎo)的磷脂酸(pa)和活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的產(chǎn)生。ros參與植物氣孔開閉的調(diào)節(jié)，氣孔關(guān)閉可以減少植物的蒸騰失水(zhaoetal.,2013)。mpk9和mpk12在氣孔細(xì)胞表達(dá)，干旱誘導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)主要是由mpk9和mpk12調(diào)控(jammesetal.,2009)。植物受到干旱脅迫通常會(huì)導(dǎo)致由wrky和b-zip類轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的抗逆的基因表達(dá)譜的變化。mapk參與了不同物種的干旱脅迫響應(yīng)，同時(shí)mapk級(jí)聯(lián)還參與了抗逆相關(guān)的wrky和b-zip類轉(zhuǎn)錄因子激活(shenetal.,2012)。mpk6是另外一個(gè)被干旱激活的mapk，與mpk9和mpk12不同，ros和pa的產(chǎn)生和積累激活mpk6。擬南芥mkk4-oe株系較野生型保水能力強(qiáng)(kimetal.,2011)。關(guān)于mapk級(jí)聯(lián)在水稻干旱脅迫響應(yīng)的研究報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)干旱處理會(huì)激活水稻osmpk4/3/7/14/20-4/20-5等成員(shenetal.,2012)。另外，水稻raf類mapkkk突變體droughtsupersensitivemutant1(dsm1)對(duì)干旱處理超敏感，株系突變體苗期和成株期失水速率較野生型快，而且dsm1-rnai轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出干旱敏感的表型。dsm1突變體中過氧化物酶基因(pox22.3和pox8.1)表達(dá)量顯著降低，表明dsml清除ros能力降低，對(duì)干旱誘導(dǎo)造成的氧化脅迫的敏感(ningetal.,2010)。水稻是世界上近半數(shù)的人口的主食。隨著全球人口的不斷增加和耕地面積的減少，以及各種極端環(huán)境的出現(xiàn)，使得糧食安全面臨巨大挑戰(zhàn)。而我國(guó)干旱半干旱地區(qū)面積巨大，因此利用最新的生物學(xué)研究工具篩選、鑒定參與抗旱的植物基因意義重大。研究和培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆水稻品種對(duì)我國(guó)糧食安全具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種osmpk21-1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為如下a或b：a.osmpk21-1蛋白在如下(a)或(b)中的應(yīng)用：(a)調(diào)控植物抗旱性；(b)選育抗旱性提高或降低的植物品種；所述osmpk21-1蛋白為如下a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)：a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物抗旱相關(guān)的由a1)衍生的蛋白質(zhì)。b.osmpk21-1蛋白相關(guān)生物材料在如下(a)或(b)中的應(yīng)用：(a)調(diào)控植物抗旱性；(b)選育抗旱性提高或降低的植物品種；所述osmpk21-1蛋白為如下a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)：a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物抗旱相關(guān)的由a1)衍生的蛋白質(zhì)；所述osmpk21-1蛋白相關(guān)生物材料，為如下b1)-b5)中任一：b1)編碼所述osmpk21-1蛋白的核酸分子；b2)含有步驟b1)所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；b3)針對(duì)編碼所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列的基因編輯工具；所述基因編輯工具為序列特異核酸酶，所述序列特異核酸酶能夠特異性剪切所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列中的靶標(biāo)片段；所述序列特異核酸酶為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,talen)、鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases,zfn)或crispr/cas9核酸酶；b4)編碼所述基因編輯工具的核酸分子；b5)含有步驟b4)所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。其中，所述“編碼所述osmpk21-1蛋白的核酸分子”為編碼所述osmpk21-1蛋白的dna分子或rna分子；所述dna分子具體可為如下1)至5)中任一所述的dna分子；所述rna分子可為如下1)至5)中任一所述的dna分子轉(zhuǎn)錄所得的 rna分子：1)序列表中序列1所示的dna分子；2)序列表中序列2所示的dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)所限定的dna分子雜交且編碼所述osmpk21-1蛋白的dna分子；4)與1)-3)任一限定的dna分子具有90％以上同一性且編碼所述osmpk21-1蛋白的dna分子。所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列具體為序列表中序列1。所述“編碼所述基因編輯工具的核酸分子”既可為編碼所述基因編輯工具(所述核酸酶)的dna分子，也可為編碼所述基因編輯工具(所述核酸酶)的rna分子。在所述應(yīng)用中，所述“調(diào)控植物抗旱性”體現(xiàn)為：所述osmpk21-1蛋白的表達(dá)量越低和/或活性越弱，所述植物的抗旱性越強(qiáng)；所述osmpk21-1蛋白的表達(dá)量越高和/或活性越強(qiáng)，所述植物的抗旱性越弱。當(dāng)選育抗旱性提高的植物品種時(shí)，可將所述osmpk21-1蛋白的表達(dá)量較低和/或活性較弱的植物品種作為親本進(jìn)行雜交；當(dāng)選育抗旱性降低的植物品種時(shí)，可將所述osmpk21-1蛋白的表達(dá)量較高和/或活性較強(qiáng)的植物品種作為親本進(jìn)行雜交。本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可為如下(a)或(b)：(a)培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：抑制受體植物中osmpk21-1蛋白的表達(dá)或降低受體植物中osmpk21-1蛋白的活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗旱性提高；(b)培育抗旱性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：促進(jìn)受體植物中osmpk21-1蛋白的表達(dá)或提高受體植物中osmpk21-1蛋白的活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗旱性降低；所述osmpk21-1蛋白為如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的與植物抗旱相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。在所述(a)中，可采用任何基因沉默相關(guān)技術(shù)抑制所述受體植物中osmpk21-1蛋白的表達(dá)。如采用針對(duì)編碼所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列的基因編輯工具對(duì)所述受體植物中的所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列進(jìn)行基因編輯，使得所述受體植物中的所述osmpk21-1蛋白的表達(dá)受到抑制；所述基因編輯工具為序列特異核酸酶，所述序列特異核酸酶能夠特異性剪切所述osmpk21-1蛋白的基因組 dna序列中的靶標(biāo)片段；所述序列特異核酸酶為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,talen)、鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases,zfn)或crispr/cas9核酸酶。所述序列特異核酸酶對(duì)所述靶標(biāo)片段進(jìn)行特異性剪切會(huì)造成所述靶標(biāo)片段發(fā)生插入突變、缺失突變和/或替換突變，從而使得所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列發(fā)生能夠抑制所述osmpk21-1蛋白表達(dá)的突變。其中，所述靶標(biāo)片段可位于所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列的如下區(qū)域中的至少一種：增強(qiáng)子區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、終止子區(qū)。當(dāng)所述序列特異核酸酶為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶或鋅指核酸酶時(shí)，對(duì)所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列進(jìn)行基因編輯，是通過如下實(shí)現(xiàn)的：向所述受體植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶或鋅指核酸酶的遺傳物質(zhì)，或者直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶或鋅指核酸酶，再將導(dǎo)入后的細(xì)胞或組織培養(yǎng)成完整植株。當(dāng)所述序列特異核酸酶為crispr/cas9核酸酶時(shí)，對(duì)所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列進(jìn)行基因編輯，是通過如下實(shí)現(xiàn)的：向所述受體植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入表達(dá)crispr/cas9核酸酶的遺傳物質(zhì)或者直接導(dǎo)入cas9蛋白，與向?qū)na一起轉(zhuǎn)化，經(jīng)過細(xì)胞或組織培養(yǎng)成完整植株。所述遺傳物質(zhì)可為dna質(zhì)?；騞na線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的rna；即根據(jù)所述核酸酶種類的不同，所述遺傳物質(zhì)可為能表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶、鋅指核酸酶、cas9蛋白、向?qū)na、tracrrna、crrna的dna質(zhì)?；騞na線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的rna。所述細(xì)胞為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細(xì)胞(如原生質(zhì)體細(xì)胞或懸浮細(xì)胞等)；所述組織為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織(如愈傷組織、幼胚、成熟胚、葉片、莖尖，幼穗或下胚軸等)。所述導(dǎo)入的方法可為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、peg誘導(dǎo)原生質(zhì)體法、電極法、碳化硅纖維介導(dǎo)法、真空滲入法或其他任何導(dǎo)入方法。其中，所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列具體為序列表中序列1。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述序列特異核酸酶具體為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶，所述轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶對(duì)所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列的兩個(gè)作用靶點(diǎn)分別為：序列表中序列1的第208-224位，以及序列表中序列1的第243-260位。進(jìn)一步，組成所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶的兩個(gè)talen蛋白的氨基酸序列分別如序列表6的第3-950位和第995-1972位。在所述(b)中，所述促進(jìn)受體植物中osmpk21-1蛋白的表達(dá)可通過如下實(shí)現(xiàn)：向所述受體植物中導(dǎo)入編碼所述osmpk21-1蛋白的核酸分子，從而促進(jìn)所述受體植 物中所述osmpk21-1蛋白的表達(dá)。其中，所述“編碼所述osmpk21-1蛋白的核酸分子”可為編碼所述osmpk21-1蛋白的dna分子或rna分子；所述dna分子具體可為如下1)至5)中任一所述的dna分子；所述rna分子具體可為如下1)至5)中任一所述的dna分子轉(zhuǎn)錄所得的rna分子：1)序列表中序列1所示的dna分子；2)序列表中序列2所示的dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)所限定的dna分子雜交且編碼所述osmpk21-1蛋白的dna分子；4)與1)-3)任一限定的dna分子具有90％以上同一性且編碼所述osmpk21-1蛋白的dna分子。當(dāng)所述“編碼所述osmpk21-1蛋白的核酸分子”為dna分子時(shí)，可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入所述受體植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：(1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)所述受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述osmpk21-1蛋白的氨基酸序列不改變的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的gc含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中g(shù)c含量可為35％、多于45％、多于50％或多于約60％；(2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；(3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在所述受體植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；(4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率，任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；(5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于tmv，mcmv和amv)。在本發(fā)明中，所述“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴笨梢灾苯佑^察或采用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一 性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。在本發(fā)明中，所述“轉(zhuǎn)基因植物”理解為不僅包含將相關(guān)遺傳物質(zhì)或非遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化到所述受體植物中后得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物及其無(wú)性系，也包括其子代及其無(wú)性系。對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物可為種子、愈傷組織、完整植株或細(xì)胞。在上述應(yīng)用或方法中，所述植物既可以為單子葉植物，也可以為雙子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為單子葉植物中的禾本科植物，具體為水稻(具體如水稻品種日本晴)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，向日本晴水稻中導(dǎo)入針對(duì)所述osmpk21-1蛋白的基因組dna序列的基因編輯工具(talen核酸酶)的編碼基因得到的osmpk21-1突變體轉(zhuǎn)基因水稻(osmpk21-1基因發(fā)生突變，改變了osmpk21-1基因的閱讀框，使其失去功能)，突變體表現(xiàn)出抗干旱脅迫表型，說(shuō)明osmpk21-1或與osmpk21-1相關(guān)的生物材料可用于調(diào)控植物的抗旱，對(duì)于培育抗旱植物特別是水稻新品種具有重要意義。附圖說(shuō)明圖1為pgw3-t-osmpk21-1在水稻原生質(zhì)體的活性檢測(cè)。其中，marker中各條帶由大到小依次為1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。圖2為t0代osmpk21-1基因的talen敲除純合突變體基因型。圖3為t2代osmpk21-1純合突變體在干旱處理5天時(shí)的抗旱表型。圖4為t2代osmpk21-1純合突變體在田間正常種植灌溉條件下的表型。其中，a為野生水稻(wt)；b為t2代osmpk21-1純合突變體。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。農(nóng)桿菌菌株agl1(agrobacteriumstrainagl1)：文獻(xiàn)：hellens，r.，mullineaux，p.，andklee，h.(2000).technicalfocus：aguidetoagrobacteriumbinarytivectors.trendsinplantscience5：446-451.公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。水稻日本晴(oryzasatival.ssp.japonicacv.nipponbare)：文獻(xiàn)：stephena.goffetal.adraftsequenceofthericegenome(oryzasatival.ssp.japonica).science.2002，(296)：92，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。實(shí)施例1、osmpk21-1的生物信息學(xué)分析osmpk21-1是水稻osmpk家族中的e組成員，該基因位于第5號(hào)染色體上。其 在日本水稻注釋計(jì)劃riceannotationprojectdatabase(rap-db)美國(guó)水稻基因組注釋計(jì)劃themsuricegenomeannotationprojectdatabase(rgap7)的登錄號(hào)分別是os05g0576800和loc_os05g50120。osmpk21-1基因在水稻基因組中的序列如序列表中序列1所示；cds序列如序列表中序列2所示；編碼的osmpk21-1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。該基因共有11個(gè)外顯子。本發(fā)明在基因的第一外顯子上設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(talens)的靶序列。以期對(duì)osmpk21-1基因進(jìn)行敲除。實(shí)施例2、osmpk21-1靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)及相關(guān)敲除載體的構(gòu)建在水稻基因組中osmpk21-1基因的第一外顯子處設(shè)計(jì)一對(duì)talen，靶位點(diǎn)序列如下：5’-tcggaggacgcgggcacgcacctgccggtgcgcacggagccgcgacgcatgga-3’；其中的小寫字母為間隔序列，兩側(cè)大寫字母為talen模塊識(shí)別序列(分別命名為l-arm和r-arm)；下劃線為fspi酶切識(shí)別序列；其左側(cè)識(shí)別模塊l-arm的rvd序列為：hdnnnnninnnnnihdnnhdnnnnnnhdnihd；右側(cè)識(shí)別模塊r-arm的rvd序列為：hdhdningnnhdnnnghdnnhdnnnnhdnghdhd。將識(shí)別l-arm的talen命名為t-osmpk21-1-l；識(shí)別r-arm模塊talen命名為t-osmpk21-1-r，將編碼t-osmpk21-1-l/t-osmpk21-1-r的dna片段分別與核酸內(nèi)切酶foki的dna編碼片段融合后得到dna片段t-osmpk21-1，t-osmpk21-1-l和t-osmpk21-1-r構(gòu)建在同一表達(dá)盒中并被18個(gè)氨基酸組成t2a連接，可以在表達(dá)時(shí)斷開形成兩個(gè)蛋白。結(jié)合到靶位點(diǎn)處形成foki二聚體，行使對(duì)osmpk21-1靶位點(diǎn)的編輯。dna片段t-osmpk21-1的序列如序列4所示，其中7-2850位編碼l-arm的編輯蛋白t-osmpk21-1-l：7-27位編碼核定位信號(hào)nls；第463-2052位編碼l-arm的talen識(shí)別模塊蛋白；第2248-2850位編碼核酸內(nèi)切酶foki(603bp)；第2851-2904位編碼由18個(gè)氨基酸殘基組成的t2a序列；序列4中2983-5916位編碼r-arm的編輯蛋白t-osmpk21-1-r，第2983-3003位編碼核定位信號(hào)nls；3439-5130位編碼r-arm的talen識(shí)別模塊蛋白；第5326-5916位編碼foki核酸內(nèi)切酶(591bp)。將序列4所示的dna片段通過gateway克隆(invitrogengatewaylrclonaseiimix克隆酶)方法插入pgw3載體的玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子下游，獲得重組載體pgw3-t-osmpk11。所述載體pgw3是將載體pmdc32(arabidopsisbiologicalresourcecenter，網(wǎng)址：http://abrcosuedu/，stock#cd3-738)中hindiii和acc65ⅰ位點(diǎn)間的35s啟動(dòng)子替換 為序列表序列5的第7-1993位所示的玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子(shan,q.,wang,y.,chen,k.,liang,z.,li,j.,zhang,y.,zhang,k.,liu,j.,voytas,d.f.,zheng,x.,zhang,y.andgao,c.(2013)rapidandefficientgenemodificationinriceandbrachypodiumusingtalens.mol.plant6,1365–1368.)后得到的重組質(zhì)粒。實(shí)施例3、osmpk21-1靶位點(diǎn)talen的活性篩選將實(shí)施例2構(gòu)建完成的重組載體pgw3-t-osmpk21-1大量提取之后通過peg介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)入水稻品種日本晴的原生質(zhì)體，25℃避光培養(yǎng)48小時(shí)，然后提取原生質(zhì)體的基因組dna，用特異引物通過pcr擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)的osmpk21-1基因，然后將含有靶位點(diǎn)osmpk21-1的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用fspi酶切(如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物有部分條帶不能被切開，說(shuō)明實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)有活性)，將不能被限制性內(nèi)切酶fspi切開的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。用于擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)osmpk21-1的引物序列如下：上游引物osmpk21-1-iden-f：ctccatcctacgctggctccgtc(序列1的第18-40位)；下游引物osmpk21-1-iden-r：atgtaagcatgtgaatgaacatgcc(序列1的第449-523位的反向互補(bǔ)序列)。原生質(zhì)體中檢測(cè)重組載體活性的酶切結(jié)果見圖1，泳道1為野生型對(duì)照pcr產(chǎn)物未經(jīng)fspi酶切(大小約為506bp)；泳道2為轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，其中含有不能被fspi切開的pcr條帶(大小約為506bp，與預(yù)期一致)，同時(shí)也含有能被ecorv切開的兩個(gè)pcr條帶(大小分別約為221bp和285bp，與預(yù)期一致)，說(shuō)明靶位點(diǎn)t-osmpk21-1有活性。將泳道2中未被酶切開的條帶切膠回收后測(cè)序，結(jié)果表明靶位點(diǎn)處產(chǎn)生了少量堿基的插入與缺失，證實(shí)重組載體pgw3-t-osmpk21-1在靶位點(diǎn)處進(jìn)行了基因定點(diǎn)編輯。將重組載體pgw3-t-osmpk21-1熱擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株agl1，獲得含有重組載體pgw3-t-osmpk21-1的重組農(nóng)桿菌，命名agl1/pgw3-t-osmpk21-1；同時(shí)將空載體pgw3熱擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株agl1，獲得含有重組載體pgw3的重組農(nóng)桿菌，命名為agl1/pgw3。實(shí)施例4、定點(diǎn)敲除水稻基因組中的osmpk21-1基因一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建用實(shí)施例3中獲得的重組農(nóng)桿菌agl1/pgw3-t-osmpk21-1和agl1/pgw3分別侵染水稻品種日本晴(oryzasatival.ssp.japonicacv.nipponbare)成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，將獲得抗性愈傷組織分別命名為抗性愈傷t-osmpk21-1和抗性愈傷ck1。其中，重組農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的具體方法如下：(1)將25％次氯酸鈉消毒后的日本晴水稻種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)7天，去除芽和殘留胚乳后再置于愈傷組織繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4-6周，得到成熟胚愈傷組織。(2)將重組農(nóng)桿菌接種于yeb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平)中，28℃振蕩培養(yǎng)至od600為1.0-1.5；以10000rpm室溫離心1min，用aam液體培養(yǎng)基(其中，葡萄糖濃度為100g/l，乙酰丁香酮濃度為100μm，ph5.2)重懸菌體并稀釋至od600為0.1，得到菌懸液。(3)將步驟(1)得到的成熟胚愈傷組織浸于步驟(2)得到的菌懸液中25-30min后，于含有兩層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃黑暗下共培養(yǎng)3天。(4)將經(jīng)過步驟(3)共培養(yǎng)的愈傷組織接種于篩選培養(yǎng)基中28℃黑暗下篩選培養(yǎng)2周，轉(zhuǎn)入新配置的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行再次篩選培養(yǎng)，獲得存活的淡黃色抗性愈傷組織。(5)從經(jīng)兩輪篩選后長(zhǎng)出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/l潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)至15h/d光照條件下培養(yǎng)，一般經(jīng)過15-25天左右，有綠點(diǎn)出現(xiàn)。30-40天后進(jìn)一步分化出小苗。(6)當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長(zhǎng)至約2cm時(shí)，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右。選擇高約10cm、根系發(fā)達(dá)的小苗，洗去培養(yǎng)基，移栽至田間，得到分別轉(zhuǎn)入pgw3-t-osmpk21-1和pgw3的t0代轉(zhuǎn)基因植物。其中，所用的培養(yǎng)基如下：1、培養(yǎng)基母液配方：1)20×n6培養(yǎng)基母液：注：配制時(shí)按表中所列順序逐一添加。2)100×b5微量母液(每升含量)：3)b5有機(jī)母液：4)100×鐵鹽注：配制順序如下：①稱取2.78gfeso4·7h2o溶解于200ml去離子水中(a)。②稱取3.73gna2-edta·2h2o溶解于200ml去離子水中(b)。③將b置于70℃水浴鍋中直至溶質(zhì)完全溶解(c)。④將a倒入c中混合，置于70℃水浴鍋中保溫2h。⑤定容至1l。5)aa大量元素母液(每升含量)：2、培養(yǎng)基配方1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(每升含量)：(ch：caseinhydrolysate，水解酪蛋白)2)愈傷組織繼代培養(yǎng)基(每升含量)：3)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(每升含量)：4)篩選培養(yǎng)基(每升含量)：5)分化培養(yǎng)基配方(每升含量)：6)生根培養(yǎng)基配方(每升含量)：7)懸浮農(nóng)桿菌感染愈傷組織團(tuán)的培養(yǎng)基配方(aam)每升含量：二、talens誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因t0代植物突變篩選1、在步驟一獲得t0代轉(zhuǎn)基因植物之后，利用pcr/re對(duì)所有獲得的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行突變篩選。涉及到引物為實(shí)施例3中描述，涉及的內(nèi)切酶和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)施例3中描述。結(jié)果顯示：經(jīng)pcr/re檢測(cè)后，t0代共獲得84株轉(zhuǎn)入重組載體pgw3-t-osmpk21-1的轉(zhuǎn)基因植株。其中共有13株植物中osmpk21-1基因talen結(jié)合位點(diǎn)處有突變；13株突變體中有4株為純合突變體帶型，9株為雜合突變體帶型，突變效率為15.5％(攜帶突變的植株數(shù)目/t0代獲得的轉(zhuǎn)基因植物總數(shù))。2.osmpk21-1突變體基因型測(cè)序確定將上述t0代植物中的pcr/re篩選出的轉(zhuǎn)入重組載體pgw3-t-osmpk21-1的突變體植株的pcr產(chǎn)物連接peasyblunt克隆載體(transgenbiotech)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后37℃培養(yǎng)過夜，在藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基上挑取白色單克隆測(cè)序，確定各株系基因型。選取其中移碼突變株系(記為轉(zhuǎn)入osmpk21-1-t0-11、osmpk21-1-t0-15和osmpk21-1-t0-16突變體植株)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)其中3個(gè)t0代osmpk21-1talen位點(diǎn)純合突變體植株(t0-11、t0-16和t0-15)的測(cè)序結(jié)果見圖2，其中t0-11在設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)處含有29bp的堿基刪除；t0-15在設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)處含有1bp堿基的插入；t0-16在設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)處含有76bp堿基的刪除。這些突變都最終改變osmpk21-1基因的閱讀框，使其失去功能，獲得osmpk21-1純合突變體。實(shí)施例5、水稻基因osmpk21-1敲除突變體的抗干旱脅迫表型將實(shí)施例4獲得的t0代osmpk21-1talen位點(diǎn)純合突變體植株(t0-11、t0-16和t0-15)自交種子鑒定純合突變體，獲得t2代osmpk21-1純合突變體，對(duì)t2代osmpk21-1純合突變體進(jìn)行干旱處理。具體如下：首先將種子在75％乙醇中洗滌1min，然后將種子轉(zhuǎn)移到25％次氯酸鈉溶液中置于旋轉(zhuǎn)搖床上消毒30min；然后將種子用無(wú)菌水洗5遍后置于37℃催芽48小時(shí)。催芽?jī)商旌?，將萌芽的種子置于水培皿中培養(yǎng)10天。將10天的幼苗轉(zhuǎn)移至無(wú)菌土中，每3天澆水一次，期間澆1/2ms營(yíng)養(yǎng)液三次，培養(yǎng)30天。在第30天時(shí)，水飽和之后斷水干旱處理，干旱處理5天左右拍照記錄表型。處理7天之后復(fù)水，復(fù)水5天后統(tǒng)計(jì)存活率。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)基因的日本晴水稻為野生型對(duì)照，同時(shí)以轉(zhuǎn)入pgw3空載體的轉(zhuǎn)基因水稻作為空載體對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，定量結(jié)果取均值。每次重復(fù)中保證供試的各水稻材料均不少于30株。結(jié)果顯示，在干旱處理過程中野生型水稻和空載體對(duì)照水稻失水速率比t2代osmpk21-1純合突變體水稻要快。干旱處理5天時(shí)t2代osmpk21-1純合突變體水稻和野生型水稻的表型見圖3。而osmpk21-1純合突變體在正常栽培條件下與野生水稻無(wú)明顯表型差異(圖4)。各水稻干旱處理7天后復(fù)水5天時(shí)統(tǒng)計(jì)的存活率情況如表1所示，可見與野生水稻相比，t2代osmpk21-1純合突變體水稻的存活率顯著提高(p<0.05)。另外，空載體對(duì)照水稻的存活率與野生水稻的存活率基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表1osmpk21-1純合突變體水稻和野生水稻在干旱處理7天后復(fù)水5天時(shí)的存活率重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3均值(％)osmpk21-1純合突變體63.376.773.371.1野生水稻53.363.36058.9以上結(jié)果表明：與野生水稻相比，osmpk21-1純合突變體水稻表現(xiàn)出抗干旱脅迫表型。當(dāng)前第1頁(yè)12