本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及豬支氣管上皮細(xì)胞系、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：豬傳染性疾病在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及人類都是一主要的健康威脅，目前對(duì)豬的疾病研究早已成為獸醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)。對(duì)豬而言，傳染性疾病多發(fā)于消化道和呼吸道，而呼吸道疾病是一年四季的常發(fā)病，對(duì)豬的危害最大。目前多種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等微生物被認(rèn)為是可引起豬呼吸系統(tǒng)疾病的病原，如豬場(chǎng)常見的豬肺炎支原體、豬藍(lán)耳病、2型圓環(huán)病毒、豬流感病毒等。然而相較于人類和禽類，豬類病原的研究還相對(duì)比較薄弱，特別是這些病原在豬呼吸系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生中如何產(chǎn)生作用，致病機(jī)理如何，尚不明確。目前，對(duì)豬類呼吸道病原的研究主要集中在豬體內(nèi)感染，尚缺乏合適的宿主細(xì)胞模型，例如支氣管上皮細(xì)胞系。由于原代支氣管上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)難以長(zhǎng)期傳代生存，在當(dāng)前的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，原代上皮細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的應(yīng)用受限主要由于其有限的增殖特性，既在于其上皮相關(guān)特性在幾代內(nèi)就會(huì)消失也在于分離組織的量的有限性。和大多數(shù)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞一樣，這些原代細(xì)胞生命有限并且將停止分裂，在一定數(shù)目的細(xì)胞分裂后隨即開始衰老。所有的這些固有的缺點(diǎn)都急需制備獲得可延長(zhǎng)壽命的永生化的細(xì)胞系，因此制備永生化的豬支氣管上皮細(xì)胞具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供豬支氣管上皮細(xì)胞系，能夠穩(wěn)定傳代至60代以上，且保留有原代細(xì)胞的特性。本發(fā)明的另一目的是提供該豬支氣管上皮細(xì)胞系的制備方法，該方法巧妙、顯著提高了篩選效率。本發(fā)明的再一目的是提供所述豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec在研究豬呼吸道病原感染致病機(jī)理中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec，保藏編號(hào)為cctccno：c201749。本發(fā)明還提供豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的制備方法，包括如下步驟：(1)構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的真核表達(dá)載體pegfp-htert；(2)利用lipofectamin3000將真核表達(dá)載體pegfp-htert轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞，通過g418篩選得到豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec。在本發(fā)明中，所述真核表達(dá)載體pegfp-htert是將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因插入熒光真核表達(dá)載體pires2-egfp后獲得的。本發(fā)明還提供所述豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec在研究豬呼吸道病原感染致病機(jī)理中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞“永生化”是指細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后自發(fā)或在外界因素的影響下脫離增殖衰老，最終獲得無(wú)限增殖能力的過程。本發(fā)明成功嘗試從幼齡雄性二元豬活體動(dòng)物中取得完整的氣管組織和肺臟，并通過解剖鏡及顯微器械成功剝離得到支氣管后，用差速貼壁及膠原酶混合胰酶消化的方法首次得到純度很高的豬原代支氣管上皮細(xì)胞，并成功得以傳代。對(duì)已有的鏈蛋白酶消化法進(jìn)行了改進(jìn)，大大節(jié)省了消化時(shí)間，同時(shí)也減輕了組織的損傷，最大程度地保持了組織原始狀態(tài)。首次成功構(gòu)建含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因并攜帶綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pegfp-htert，并將該真核表達(dá)載體利用lipofectamin3000轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞，可以直觀地通過在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后觀察熒光的方法得知是否轉(zhuǎn)染成功，為后續(xù)g418篩選單克隆提供基礎(chǔ)，顯著提高了篩選效率，并成功獲得能夠穩(wěn)定傳代至60代以上的永生化的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec。通過對(duì)角蛋白18的間接免疫熒光試驗(yàn)及后續(xù)豬原代支氣管上皮細(xì)胞和豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec特性分析，證實(shí)支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec保持了原代支氣管上皮細(xì)胞的特性，為研究豬肺炎支原體等豬呼吸道病原感染的致病機(jī)理提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)踐基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1：豬原代支氣管上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。a：麻醉后腹部切口放血以防喉部大量的血細(xì)胞污染氣管，喉部切口獲得整個(gè)喉頭連接的氣管及豬肺組織；b：解剖鏡及顯微鑷子、顯微剪刀剝離氣管周圍的肺組織后獲得的豬支氣管組織；c：豬支氣管組織差速貼壁后的初代集落的豬支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)；d：傳代后的第三代豬原代支氣管上皮細(xì)胞角蛋白18間接免疫熒光鑒定圖。圖2：真核表達(dá)載體pegfp-htert雙酶切鑒定電泳圖。泳道1為dl15000的marker；泳道2為真核表達(dá)質(zhì)粒pegfp-htert經(jīng)ecorⅰ和salⅰ雙酶切鑒定，上面的條帶為載體pires2-egfp，大小為5.3kb，下面的條帶為插入的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因片段，大小為3.45kb。圖3：永生化的豬支氣管上皮細(xì)胞系的鑒定。a：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的熒光數(shù)量和強(qiáng)度圖(100倍視野下)；b：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的角蛋白18的間接免疫熒光鑒定。圖4：豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec與豬原代支氣管上皮細(xì)胞增殖情況比較。a：豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec與豬原代支氣管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線測(cè)定比較；b：第4代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)；c：第60代豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的細(xì)胞形態(tài)；d：豬原代支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)分布情況；e：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec細(xì)胞周期檢測(cè)分布情況。其中圖d、e的橫坐標(biāo)為cellnumber，即計(jì)數(shù)到的有效細(xì)胞數(shù)，縱坐標(biāo)為dna量。圖5：豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec與豬原代支氣管上皮細(xì)胞的特性分析。a：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶htert基因的rt-pcr檢測(cè)，m為dl2000的marker，1-3泳道分別為第四代豬原代支氣管上皮細(xì)胞、陽(yáng)性對(duì)照人喉癌細(xì)胞hep-2和第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec；b：htert基因的westernblot檢測(cè)；m為蛋白預(yù)染marker(最上面最大的條帶為170kda)，1-3泳道分別為第四代豬原代支氣管上皮細(xì)胞、陽(yáng)性對(duì)照人喉癌細(xì)胞hep-2和第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec；c：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的體外瓊脂依賴性試驗(yàn)顯微鏡100倍視野下示意圖；d：陽(yáng)性對(duì)照hep-2細(xì)胞的體外瓊脂依賴性試驗(yàn)顯微鏡100倍視野下示意圖；e：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的染色體核型分析示意圖；f：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的染色體核型重排示意圖。圖6：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec和豬原代支氣管上皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平的相對(duì)熒光定量qpcr檢測(cè)?？v坐標(biāo)是log2(mrna在豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec中的表達(dá)水平/mrna在豬原代支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平)。圖7：第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的體內(nèi)裸鼠致瘤性檢測(cè)示意圖，其中a-c分別為陽(yáng)性對(duì)照hep-2細(xì)胞腋下皮下注射裸鼠后腫瘤形成示意圖，100倍he染色病理切片示意圖，200倍he染色病理切片示意圖。d-e分別為第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的體內(nèi)裸鼠致瘤性檢測(cè)示意圖，100倍he染色病理切片示意圖和200倍he染色病理切片示意圖。生物保藏豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec于2017年6月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為cctccno：c201749，分類命名：豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)(sambrook等人)中所述的條件，或按照制造廠商建議的方法。實(shí)施例1豬支氣管組織的分離、原代細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定1.豬支氣管組織的分離(1)速眠新(購(gòu)自佛山市雙平寵物用品有限公司)，前肢靜脈麻醉致死50日齡的清潔級(jí)雄性杜長(zhǎng)大二元雜交豬(購(gòu)自南京洲邦生物科技有限公司)并四肢固定后，酒精消毒待處理表皮組織后使用一套手術(shù)器械(剪刀、鑷子各兩把，眼科剪、眼科鑷各一把)腹部切口放血。(2)手術(shù)剪自喉部至胸部最后一根肋骨為止縱向剪開皮膚，沿兩側(cè)肋骨橫向剪開皮膚，分離皮膚。(3)另一套手術(shù)器械(剪刀、鑷子各兩把，眼科剪、眼科鑷各一把)，分離喉部肌肉，暴露氣管，用剪刀沿分離好的皮膚邊緣，去除肋骨，暴露胸腔。(4)縱向剪斷氣管，提起氣管，自上而下，逐步分離氣管及肺組織，止血鉗夾緊氣管上端后剪斷氣管，將整個(gè)喉頭連接的氣管及完整肺臟組織采用pbs清洗后(見圖1a)，移入超凈臺(tái)待進(jìn)行支氣管組織的分離。(5)將獲取的肺組織用平頭鑷子分成單個(gè)肺葉后，借助解剖鏡，使用顯微器械即顯微鑷子及顯微剪刀去除支氣管周圍的肺組織，分離出支氣管組織，注意勿用力撕扯。分離出來(lái)的支氣管形態(tài)見圖1b。2.豬原代支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)(1)支氣管組織的消化將分離好的支氣管組織用pbs緩沖液洗凈，剪碎成約1mm3大小后加入0.5mmol/l的edta溶液2ml，膠原酶ⅰ溶液(worthington)2ml和0.25％胰酶溶液1ml，37℃消化作用45min，每15min超凈臺(tái)內(nèi)取出10μl顯微鏡下觀察消化情況。(2)培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件①基礎(chǔ)培養(yǎng)基：dmem/f12培養(yǎng)基(gibico)。②細(xì)胞培養(yǎng)液：初代細(xì)胞剛貼壁使用dmem/f12+10％胎牛血清，配制方法：在dmem/f12培養(yǎng)基中添加終濃度為10％胎牛血清；貼壁后12小時(shí)更換含有低濃度血清的培養(yǎng)基即dmem/f12+2％胎牛血清+調(diào)節(jié)因子，配制方法：在dmem/f12培養(yǎng)基中添加終濃度為2％胎牛血清、10ng/ml人上皮生長(zhǎng)因子、0.1ng/ml視黃酸(sigma)和begm套裝里的全套上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子(lonza,cat.no.cc-4175)。begm套裝里的全套上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中各物質(zhì)在該培養(yǎng)基中的濃度如下：26μg/mlbpe(牛垂體提取物)，15.5ng/mlhegf(人上皮生長(zhǎng)因子)，5μg/ml人胰島素，1.4μm氫化可的松，2.7μm腎上腺素，9.7nm碘甲狀腺原氨酸，0.3nm維甲酸，10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白。每隔一天更換培養(yǎng)基一次。③終止液：dmem/f12+10％胎牛血清，配制方法是在dmem/f12培養(yǎng)基中添加終濃度為10％的胎牛血清。④0.125％胰酶：采用dhanks液(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)將購(gòu)自gibico的0.25％濃度的商品化胰酶稀釋一倍，調(diào)ph至7.5-8.0。(3)豬原代支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代方法①初代支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)支氣管組織消化45min后，加入終止液終止消化。200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1000rpm離心5min，棄上清，沉淀用dmem/f12+10％胎牛血清重懸后接種在4個(gè)10cmdish(細(xì)胞培養(yǎng)皿)中放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，貼壁后12h換液為dmem/f12+2％胎牛血清+調(diào)節(jié)因子，目的使分離的原代支氣管上皮細(xì)胞中極少量的平滑肌細(xì)胞無(wú)法生存，避免平滑肌細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞。初代支氣管上皮細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞集落形態(tài)見圖1c。②原代支氣管上皮細(xì)胞的傳代初代支氣管上皮細(xì)胞采用標(biāo)題①中方法培養(yǎng)3-4天后，由于每個(gè)dish中細(xì)胞生長(zhǎng)情況不一，將兩個(gè)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80％的10cmdish的細(xì)胞一傳二傳代，另兩個(gè)細(xì)胞較少的dish合并為一個(gè)dish。傳代前的消化方法：首先棄去營(yíng)養(yǎng)液，用dhanks液清洗一遍，用800μl0.125％胰酶消化后放入37℃培養(yǎng)箱，每1min觀察一次細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞開始變圓成單個(gè)時(shí)立即加入終止液，輕輕吹打后移入15ml離心管，尚有部分細(xì)胞未消化完全，再加胰酶消化，然后1000rpm離心，棄上清，沉淀用dmem/f12+2％胎牛血清+調(diào)節(jié)因子一傳二至6cmdish中靜置培養(yǎng)。5個(gè)dish的第二代的原代支氣管上皮細(xì)胞一半用于接種至24孔細(xì)胞板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，一半接著傳代至第三代，經(jīng)傳代后的第三代豬原代豬支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)同圖4b。3.豬原代支氣管上皮細(xì)胞的鑒定由于從豬活體內(nèi)分離組織進(jìn)行上皮細(xì)胞培養(yǎng)不可避免會(huì)有一些其他組織的殘留，分離的支氣管上皮細(xì)胞里易于混有極少量的平滑肌細(xì)胞。本發(fā)明通過在培養(yǎng)過程中降低血清濃度、添加上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，同時(shí)通過額外加入視黃酸和人上皮生長(zhǎng)因子的方法使平滑肌細(xì)胞不能生存。為確定原代支氣管上皮細(xì)胞的純度，我們對(duì)分離的上皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。(1)形態(tài)學(xué)鑒定體外傳代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞由一個(gè)中心向外延伸突觸，呈典型的柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)。胰酶消化后，細(xì)胞開始變成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的圓形細(xì)胞形態(tài)。(2)間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定①間接免疫熒光試驗(yàn)所需試劑:抗體稀釋液：吸取3ml胎牛血清(fbs)溶于27mlpbs緩沖液中，配成含有10％fbs的pbs，備用。pbst：吸取50μltween-20溶于100mlpbs緩沖液中，配成0.05％tween-20，備用。封閉液：稱取bsa0.1g溶于10mlpbs緩沖液中，配成1％bsa溶液，備用。通透液：吸取0.5mltritonx-100溶于100mlpbs緩沖液，配成0.5％tritonx-100溶液，備用?？贵w：一抗為鼠源的抗細(xì)胞角蛋白18單抗(即anti-cytokeratin18單抗，abcam)，用于對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。二抗為fitc標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。②具體試驗(yàn)步驟：取生長(zhǎng)良好且傳至第3代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞，用pbs緩沖液清洗2-3次后加入固定液(4％多聚甲醛)固定15min；棄去固定液，用pbs緩沖液清洗3次，然后加入封閉液封閉2h；棄去封閉液，pbst清洗3次，每次5min，每孔加入100μlanti-cytokeratin18單抗，4℃過夜；棄去一抗，pbst漂洗3次，每次5min，每孔加入200μl的fitc標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體，于37℃避光孵育1h；pbst清洗，dapi染色15min，甘油封片，鏡檢。③間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果第3代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞的間接免疫熒光雙染法鑒定圖見圖1d，其中支氣管上皮細(xì)胞被染成綠色，所有細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)色(包括雜細(xì)胞即平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核)，結(jié)果可見所獲原代支氣管上皮細(xì)胞的純度很高，達(dá)95％以上。實(shí)施例2建立豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec1.試驗(yàn)材料人端粒酶質(zhì)粒pci-neo-htert(攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因片段)及熒光真核表達(dá)載體pires2-egfp，購(gòu)自biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心。2.人端粒酶真核表達(dá)載體pegfp-htert的構(gòu)建人端粒酶重組質(zhì)粒pci-neo-htert攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因，由于該質(zhì)粒僅具有新霉素g418抗性，直接將pci-neo-htert轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞，只能盲目地通過g418篩選且極易形成對(duì)g418的抗藥性，因此本發(fā)明進(jìn)行了如下改進(jìn)。人端粒酶重組質(zhì)粒pci-neo-htert及空白質(zhì)粒pires2-egfp本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買保存。首先按照質(zhì)粒dna小提純化試劑盒(takara)步驟提取質(zhì)粒pci-neo-htert，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用ecorⅰ和salⅰ(takara)雙酶切重組質(zhì)粒，利用膠回收試劑盒(takara)純化回收3.5kb的htert片段(genbank序列號(hào):aac40212.1)。用ecorⅰ和salⅰ(takara)雙酶切熒光真核表達(dá)載體pires2-egfp，酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收。按摩爾比4:1將目的片段(htert片段)和載體(的比例)混合，加入1μlt4dnaligase(takara)，配制10μl連接體系，混勻后置于16℃連接儀過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，pcr、酶切鑒定。送該陽(yáng)性克隆交南京genescript公司測(cè)序，將含有正確連接片段的重組質(zhì)粒命名為pegfp-htert，進(jìn)而將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，涂于含卡那霉素的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，隨機(jī)挑取白色單菌落接種于含卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)14-16h，小量提取質(zhì)粒pegfp-htert。3.重組質(zhì)粒pegfp-htert的雙酶切鑒定驗(yàn)證小量提取的重組質(zhì)粒pegfp-htert，經(jīng)內(nèi)切酶ecori和salⅰ雙酶切后得到與目的基因約3.5kb、載體約5.3kb大小一致的兩個(gè)片段，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(如圖2所示)。采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(omega)提取重組質(zhì)粒pegfp-htert和空白質(zhì)粒pires2-egfp，測(cè)濃度后置于-20℃?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒pegfp-htert轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞將重組質(zhì)粒pegfp-htert轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)，可以直觀地通過egfp綠色熒光蛋白為標(biāo)簽來(lái)分析端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶htert基因在細(xì)胞中的定位情況。(1)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、傳至第三代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞，在24孔板中以1×105cell/孔的密度接種，待細(xì)胞匯合度達(dá)80％后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞更換新鮮的含有2％澳洲胎牛血清及抗生素的培養(yǎng)基。(2)配置如下兩組溶液a組溶液：將重組質(zhì)粒pegfp-htert采用opti-mem(gibico)稀釋到25μl，使質(zhì)粒終濃度分別為0.5μg/25μl，1μg/25μl，1.5μg/25μl，2μg/25μl和2.5μg/25μl，依次標(biāo)記為a1、a2、a3、a4、a5；將1μg質(zhì)粒pires2-egfp(陰性對(duì)照)以及1μl轉(zhuǎn)染試劑(空白對(duì)照)分別采用opti-mem(gibico)稀釋到25μl，依次標(biāo)記為a6、a7。b組溶液：另取7個(gè)ep管，試驗(yàn)組以2μl/μgdna的量各取lipofectamin3000轉(zhuǎn)染試劑1μl，2μl，3μl，4μl，5μl采用opti-mem(gibico)稀釋到25μl，依次標(biāo)記為b1、b2、b3、b4、b5；各取p3000tm試劑2μl采用opti-mem(gibico)稀釋到25μl，依次標(biāo)記為b6、b7。(3)將a組溶液與b組溶液中編號(hào)對(duì)應(yīng)的ep管進(jìn)行混合(例如a1與b1)，將a組溶液用200μl移液槍輕輕吹打混勻后加入溶液b中，使質(zhì)粒dna與lipofectamin3000轉(zhuǎn)染試劑分別按0.5：1，1：1，1.5：1，2：1以及2.5：1比例(質(zhì)粒dna質(zhì)量與lipofectamin3000體積之比)混合，切忌震蕩、劇烈晃動(dòng)或產(chǎn)生大量氣泡。室溫靜置5min。(4)小心吸取混合液，一滴滴加入步驟(1)中已換液的含有2％澳洲胎牛血清及抗生素的培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞板中，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，于熒光倒置顯微鏡下觀測(cè)質(zhì)粒表達(dá)情況，并拍照，篩選單克隆。篩選單克隆的方法如下：在熒光顯微鏡下觀察，尋找轉(zhuǎn)染成功的帶綠色熒光的細(xì)胞，將這些細(xì)胞挑出來(lái)使用0.125％胰酶消化后單獨(dú)培養(yǎng)后，然后將各細(xì)胞通過有限稀釋法并且在含不同濃度的g418抗性篩選作用下進(jìn)行三次亞克隆，篩選得到可穩(wěn)定傳代的單克隆。將該單克隆命名為豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec。從轉(zhuǎn)染結(jié)果可見，利用lipofectamin3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞時(shí)，pegfp-htert與lipofectamin3000的最佳比例為2.5：1。5.豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的傳代豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的傳代方法如下：在6cmdish或細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec，首先棄去上清，通過pbs或dhanks液清洗細(xì)胞兩遍后，加入0.125％的胰酶消化，放入37℃co2培養(yǎng)箱，每一分鐘顯微鏡下觀察一次，一般需要消化三分鐘左右，待細(xì)胞突觸消失細(xì)胞變圓，周邊呈現(xiàn)白色毛刷狀時(shí)加入終止液停止消化，收集液體至15ml離心管中，1000rpm離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用不添加10ng/ml人上皮生長(zhǎng)因子和0.1ng/ml視黃酸的dmem/f12+2％胎牛血清+調(diào)節(jié)因子重懸后進(jìn)行下一代的培養(yǎng)。豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec按照上述方法傳代至第60代。將豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的第60代細(xì)胞在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3a，發(fā)現(xiàn)豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec傳代至第60代仍然在熒光強(qiáng)度和數(shù)量上呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，因此本發(fā)明通過轉(zhuǎn)染端粒酶基因成功獲得了永生化的豬支氣管上皮細(xì)胞系。對(duì)豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的第60代細(xì)胞進(jìn)行上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白18的間接免疫熒光試驗(yàn)(具體方法同實(shí)施例1標(biāo)題3中(2))，結(jié)果見圖3b。對(duì)比發(fā)現(xiàn)豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的第60代細(xì)胞純度很高，達(dá)95％以上，與豬原代支氣管上皮細(xì)胞(圖1d)一致。因此，豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec是永生化的細(xì)胞系。實(shí)施例3豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的檢測(cè)1.細(xì)胞增長(zhǎng)曲線的測(cè)定豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的第60代細(xì)胞和豬原代支氣管上皮細(xì)胞第4代細(xì)胞以每孔250μl培養(yǎng)液中包含2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每天同一時(shí)間點(diǎn)用胰酶消化收集三個(gè)孔的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(honghx,zhangym,xuh,suzy,sunp.immortalizationofswineumbilicalveinendothelialcellswithhumantelomerasereversetranscriptase.molcells,2007,24(3):358-63)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，一直持續(xù)9天。結(jié)果如圖4a所示，豬原代支氣管上皮細(xì)胞和豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，豬原代支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)到第5天達(dá)到峰值后下降，豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec在前五天的生長(zhǎng)慢于豬原代支氣管上皮細(xì)胞，但從第6天開始豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的生長(zhǎng)明顯快于豬原代支氣管上皮細(xì)胞，第7-9天兩種細(xì)胞相比差異極顯著(p<0.01)。2.豬原代支氣管上皮細(xì)胞和豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的形態(tài)學(xué)比較豬原代支氣管上皮細(xì)胞的傳代不能超過6代，而將本發(fā)明構(gòu)建的帶有綠色熒光蛋白和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的真核表達(dá)載體pegfp-htert轉(zhuǎn)染第3代豬原代支氣管上皮細(xì)胞后獲得的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec可傳代至60代以上。圖4b和圖4c分別表示第4代豬原代支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)和豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec第60代細(xì)胞的形態(tài)，可見豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec保持了豬原代支氣管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)，未發(fā)生改變，保留了豬原代支氣管上皮細(xì)胞的特性。3.細(xì)胞周期的分析收集豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec第60代細(xì)胞和對(duì)照(第4代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞)，采用預(yù)冷pbs緩沖液清洗兩次后，用8ml70％-80％的冰乙醇4℃固定過夜。次日取出4℃離心后，棄去上清，細(xì)胞用預(yù)冷的pbs緩沖液清洗兩次后用0.3ml碘化丙啶(pi，bd生物技術(shù)有限公司)室溫避光處理15min。豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec樣本以及對(duì)照組細(xì)胞量不少于1×106個(gè)，用于細(xì)胞周期檢測(cè)。計(jì)算細(xì)胞周期中的g1/g0，g2/m或s期的細(xì)胞所占比例，利用流式細(xì)胞儀(bd生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)，結(jié)合使用flowjo軟件來(lái)分析細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞分布情況，結(jié)果可見豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec(圖4e)s期明顯高于豬原代支氣管上皮細(xì)胞(圖4d)，豬原代支氣管上皮細(xì)胞和豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的s期所占比例分別為3.46％和15.01％，豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的s期所占比例與豬原代支氣管上皮細(xì)胞相比上升了11.55％，相對(duì)應(yīng)的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec的g0/g1期所占比例則低于豬原代支氣管上皮細(xì)胞。上述結(jié)果表明，豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec與豬原代支氣管上皮細(xì)胞相比表現(xiàn)出了更強(qiáng)的增殖活性并且延長(zhǎng)了復(fù)制周期。4.逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)(1)豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec及豬原代支氣管上皮細(xì)胞rna的提取用trizol試劑(invitrogen)提取豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec第60代細(xì)胞、陰性對(duì)照(第4代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞)和陽(yáng)性對(duì)照(人喉癌細(xì)胞hep-2)的rna，具體方法如下：將上述三種細(xì)胞置于6孔細(xì)胞板中，用pbs漂洗三次后，每個(gè)細(xì)胞孔中加入1mltrizol試劑。15-25℃(常溫)靜置5min，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)完全解離后將含有細(xì)胞的液體收集到無(wú)rna酶的1.5mlep管(axygen)。加入0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，用漩渦振蕩器充分劇烈震蕩15s后在15-25℃靜置2～3min。于4℃離心機(jī)中10000g離心15min，上層為水和rna，下層為蛋白質(zhì)和dna。吸取上層清液，按上層清液與異丙醇的比例為1:1加入異丙醇，混勻后靜置于-20℃條件下30min，取出4℃離心機(jī)中10000g離心15min，棄掉上清，沉淀即為rna。向沉淀中加入1ml75％的乙醇溶液，輕輕混勻后4℃離心機(jī)上以10000g離心5min后棄掉上清；將獲得的rna樣品晾干，加入適量的depc處理水溶解，采用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)濃度，-70℃保存?zhèn)溆谩?2)細(xì)胞rna的反轉(zhuǎn)錄將上述三種細(xì)胞的rna采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒hiscriptqrtsupermixforqpcr(+gdnawiper)(南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟如下：①基因組dna去除：將模板rna、4×gdnawipermix以及rnase-freeddh2o放置冰上解凍，使用前將每種溶液完全混勻，瞬時(shí)離心來(lái)收集殘留在管壁的液體。按照表1所示基因組dna去除體系配制混合液，徹底混勻。瞬時(shí)離心，并于42℃下孵育2min，而后置于冰上放置。②接著將反應(yīng)完的pcr管取出加入5×qrtsupermixⅱ2.5μl。在42℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)2min，獲得各細(xì)胞的cdna。表1gdna去除反應(yīng)體系(3)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶htert基因的rt-pcr檢測(cè)為了檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶htert基因在豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec中的表達(dá)情況，對(duì)其進(jìn)行了rt-pcr檢測(cè)，以β-actin作為內(nèi)參。針對(duì)人和豬mrna序列的保守區(qū)域?qū)tert基因片段和β-actin進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表2。結(jié)果如圖5a所示，豬原代支氣管上皮細(xì)胞在661bp處未出現(xiàn)目的條帶，而第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec和陽(yáng)性對(duì)照均在661bp處出現(xiàn)了目的基因的條帶，說明豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec具有很強(qiáng)的端粒酶活性。表2htert基因和β-actin的rt-pcr引物序列以及擴(kuò)增片段的大小5.westernblot檢測(cè)具體方法參考已有報(bào)道[suf,liux,liug,yuy,wangy,jiny,hug,huas,zhangy.establishmentandevaluationofastablecattletypeiialveolarepithelialcellline.plosone,2013,8(9):e76036.]，取約6×105個(gè)第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec，第4代豬原代支氣管上皮細(xì)胞(陰性對(duì)照)以及人喉癌細(xì)胞hep-2(陽(yáng)性對(duì)照)，用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞的總蛋白(南京凱基生物科技有限公司)。將得到的總蛋白采用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度，然后在液氮內(nèi)放置5min，取出后進(jìn)行sds-page電泳，最后進(jìn)行westernblot檢測(cè)。結(jié)果如圖5b所示，陽(yáng)性對(duì)照和第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec均在約123kda處(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶htert)有一明顯的條帶，而豬原代支氣管上皮細(xì)胞則未見蛋白表達(dá)。6.細(xì)胞染色體核型分析取第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec進(jìn)行染色體核型的檢測(cè)，參照文獻(xiàn)(parikhn,nagarajanp,sei-ichim,sinhas,garrett-sinhala.isolationandcharacterizationofanimmortalizedoralkeratinocytecelllineofmouseorigin.archoralbiol,2008,53(11):1091-100.)中方法。具體步驟如下：(1)從培養(yǎng)箱中取出已培養(yǎng)24-36h的第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)液中，加入終濃度為0.05μg/ml的秋水仙素，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置3h，使細(xì)胞維持在分裂中期，用直頭巴氏吸管將細(xì)胞用0.125％胰酶消化后，加終止液(dmem/f12+10％血清)終止，輕輕吹打混勻，然后移至15ml離心管；(2)以1000g離心10min，而后棄掉上清；(3)離心管管底的細(xì)胞沉淀放入37℃預(yù)熱過的0.075mol/l的kcl，于37℃水浴鍋中低滲處理20min；(4)細(xì)胞隨后加入3-4ml新配置的固定液(甲醇：冰醋酸體積比＝3:1)預(yù)固定，將細(xì)胞輕輕用滴管吹勻后以1000g離心10min；(5)棄掉上清以及沉淀上層較透明的部分；(6)加入7ml新配置的固定液(甲醇：冰醋酸體積比＝3:1)，將細(xì)胞團(tuán)塊吹打均勻后固定30min，然后以1000g離心10min，棄掉上清，重復(fù)此步驟2次；(7)根據(jù)離心管底部細(xì)胞的多少，加入適量新鮮固定液，用滴管將細(xì)胞輕輕吹打?yàn)榧?xì)胞懸液；(8)從事先準(zhǔn)備的冰水混合物中取出載玻片，用紙輕輕擦拭注意不要使載玻片上有紙屑或起毛，用滴管將吹勻的細(xì)胞懸液在每片載玻片上滴1-3滴，注意此處細(xì)胞懸液一定要從高處迅速滴下，滴管與載玻片的距離大約有40-50cm，輕輕吹散后自然晾干；(9)用pbs緩沖液配制4％的giemsa溶液，將載玻片上的細(xì)胞染色15min，自來(lái)水沖洗，自然晾干；(10)先用低倍鏡尋找良好的分裂相，再用高倍鏡觀察拍照；(11)用中性樹膠封片，選擇染色體清晰分散度好的分裂相攝影，進(jìn)行核型分析。結(jié)果如圖5e所示，將染色體重排，如圖5f所示。從這兩幅圖可以看出，第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec表現(xiàn)出豬物種的二倍體特征，共18對(duì)常染色體和一對(duì)性染色體，證實(shí)了我們分離得到的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec具有與豬原代支氣管上皮細(xì)胞一致的二倍體染色體特征，并未發(fā)生突變成為多倍體，且性染色體為雄性，也與分離采用的雄性幼齡豬的性別相一致。7.qrt-pcr檢測(cè)豬原代支氣管上皮細(xì)胞和豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec基因的表達(dá)水平熒光定量pcr檢測(cè)的目的是為了確認(rèn)htert基因的導(dǎo)入是否對(duì)支氣管上皮細(xì)胞基因的表達(dá)量有影響。首先將第4代的豬原代支氣管上皮細(xì)胞和第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec用trizol試劑裂解后進(jìn)行細(xì)胞rna的提取。將1μg的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，使用sybr1premixextaqtm(perfectrealtime)試劑盒(takara)進(jìn)行qrt-qpcr檢測(cè)。一共檢測(cè)了包括細(xì)胞周期(sox2、sox17、ccna1、ccna2、ccnb1和ccnb2)，先天性免疫應(yīng)答(il-6、il-8、csf2、jnk1、cxcl2和stat3)以及氧脅迫應(yīng)答(duox1,duox2,sod1和gpx1)在內(nèi)的16個(gè)基因，而β-actin和gapdh則作為內(nèi)參基因，參與qrt-qpcr的引物名稱及其序列見表3。豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec和豬原代支氣管上皮細(xì)胞的mrna表達(dá)水平的倍數(shù)變化用2-δδct來(lái)表示。結(jié)果如圖6所示，涉及細(xì)胞周期的基因，分別為sox2、sox17、ccna1、ccna2、ccnb1和ccnb2，這些基因的表達(dá)水平除了sox17外，豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec相比于豬原代支氣管上皮細(xì)胞而言，上調(diào)表達(dá)十分明顯。與之相對(duì)的是，而涉及免疫應(yīng)答和氧化應(yīng)激應(yīng)答的基因大部分沒有變化，并且豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec相對(duì)于豬原代支氣管上皮細(xì)胞的相對(duì)mrna水平變化范圍在基因表達(dá)水平差異顯著的2倍范圍以內(nèi)，以上結(jié)果表明豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec較豬原代支氣管上皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力。表3熒光定量pcr用的引物列表8.軟瓊脂試驗(yàn)和裸鼠致瘤性試驗(yàn)軟瓊脂上的是否生長(zhǎng)是證實(shí)細(xì)胞是否具有體外致瘤性轉(zhuǎn)化的最低標(biāo)準(zhǔn)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每個(gè)孔加入500μl含有0.5％的瓊脂單層后置于4℃。第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec以及陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照(hep-2)用胰酶消化處理后，用含有2％fbs的dmem/f12培養(yǎng)液以5×103、1×104和2.5×104個(gè)細(xì)胞/ml將細(xì)胞懸浮起來(lái)。緊接著，將2ml0.5％瓊脂加入到1ml細(xì)胞懸浮液中，細(xì)胞懸浮液(1ml)隨后覆蓋于固體層的下層，然后將細(xì)胞板放置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱下溫育4周，4周后取出在顯微鏡下進(jìn)行集落分析。結(jié)果如圖5c和5d所示，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)了細(xì)胞集落團(tuán)塊，而豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec則無(wú)細(xì)胞集落形成，表明豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec不具有體外致瘤性。為了評(píng)估豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec是否具有體內(nèi)致瘤性，對(duì)每只4周齡的雌性裸鼠腋下皮下注射第60代的豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec約2×106個(gè)細(xì)胞，注射3只裸鼠。相同濃度的hep-2細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照同樣腋下皮下注射3只裸鼠。裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體環(huán)境下，并且在注射后兩個(gè)月內(nèi)觀察裸鼠腋下是否產(chǎn)生腫瘤。結(jié)果如圖7所示，陽(yáng)性對(duì)照攻毒的裸鼠腋下出現(xiàn)了腫瘤(圖7a)，而豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec攻毒的小鼠腋下未出現(xiàn)腫瘤(圖7d)，病理切片結(jié)果同樣表明陽(yáng)性對(duì)照攻毒的裸鼠表現(xiàn)出大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7b和圖7c)，而豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec攻毒的裸鼠的病理切片結(jié)果則表現(xiàn)出正常的結(jié)締組織形態(tài)(圖7e和圖7f)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明豬支氣管上皮細(xì)胞系htert-pbec保持了豬原代支氣管上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞的特性，為后續(xù)研究豬肺炎支原體等豬呼吸道病原的感染機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)踐基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12